少腹逐瘀湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠在位內(nèi)膜增殖、凋亡及血管生成的影響

陳雨詩(shī)，朱廣輝，董建新，白素芬，杜晨光，曹穎

(1.華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000； 2.華北理工大學(xué) 附屬醫(yī)院，河北 唐山 063000)

·論 著·

少腹逐瘀湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠在位內(nèi)膜增殖、凋亡及血管生成的影響

陳雨詩(shī)1，朱廣輝1，董建新2，白素芬1，杜晨光1，曹穎1

(1.華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000； 2.華北理工大學(xué) 附屬醫(yī)院，河北 唐山 063000)

目的：觀察少腹逐瘀湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠在位內(nèi)膜增殖、凋亡及血管生成的影響，探討少腹逐瘀湯治療子宮內(nèi)膜異位癥的機(jī)制。方法：58只SD雌性大鼠中隨機(jī)選擇10只作為對(duì)照組，剩余大鼠采用自體移植法建立子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型，造模成功的38只大鼠隨機(jī)分為模型組及治療組，治療組給予少腹逐瘀湯灌胃，給藥4周。HE染色觀察在位內(nèi)膜組織形態(tài)及內(nèi)膜厚度，免疫組化法檢測(cè)PCNA表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)CD34、SMA- α表達(dá)以評(píng)估微血管密度(MVD)及血管成熟指數(shù)(VMI)。結(jié)果：模型組在位內(nèi)膜較對(duì)照組、治療組明顯增厚(P<0.05)，在位內(nèi)膜凋亡指數(shù)明顯低于對(duì)照組及治療組(P<0.01)，MVD值明顯高于對(duì)照組及治療組(P<0.05)，VMI值明顯低于對(duì)照組及治療組(P<0.01)。結(jié)論：少腹逐瘀湯可以通過(guò)誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制在位內(nèi)膜增殖，并能夠抑制在位內(nèi)膜血管生成，促進(jìn)微血管成熟。

少腹逐瘀湯； 子宮內(nèi)膜異位癥； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡； 血管生成； 大鼠

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis, EMT)是一種子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)種植于子宮腔以外的雌激素依賴(lài)性疾病，在育齡期女性中的發(fā)病率為10%，在不孕癥患者中的發(fā)病率高達(dá)25%～50%[1]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，EMT患者的在位內(nèi)膜與非EMT患者的子宮內(nèi)膜在組織學(xué)及分子生物學(xué)特征上存在明顯不同。這些功能異常的子宮內(nèi)膜具有更強(qiáng)的腹腔種植潛能。也就是說(shuō)，在位內(nèi)膜的病變?cè)贓MT發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用[2]。在對(duì)狒狒及嚙齒類(lèi)動(dòng)物EMT模型的研究中發(fā)現(xiàn)，造模導(dǎo)致在位內(nèi)膜在細(xì)胞侵襲、血管生成、細(xì)胞生長(zhǎng)、免疫調(diào)節(jié)、性激素代謝等方面的蛋白表達(dá)異常，說(shuō)明異位病灶影響了在位內(nèi)膜的生物學(xué)特征。這可能與炎癥反應(yīng)干擾了性激素受體表達(dá)或子宮內(nèi)膜細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)特征有關(guān)[3]。另有研究證據(jù)表明，異位病灶細(xì)胞可以遷移至在位內(nèi)膜[4]。以上研究表明，在位內(nèi)膜功能異常與異位病灶形成之間互為因果，相互影響。

如果針對(duì)EMT的治療藥物可以糾正在位內(nèi)膜的病理狀態(tài)，將可能有助于EMT治療。在EMT治療中被廣泛使用的促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(gonadotropin releasing hormone agonist, GnRHa )即被證實(shí)能夠抑制在位內(nèi)膜中的血管新生及細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)在位內(nèi)膜發(fā)生細(xì)胞凋亡[5- 6]。然而，GnRHa以降低人體雌激素水平為代價(jià)，隨之而來(lái)的各種副作用限制了藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用。中醫(yī)藥療法因治療效果與達(dá)那唑或孕三烯酮類(lèi)似，但不抑制排卵[7]，副作用更少，能更好地改善全身癥狀[8]，在EMT的治療中被廣泛使用。以活血化瘀、溫經(jīng)止痛立法的經(jīng)典名方少腹逐瘀湯是治療寒凝血瘀型EMT的常用方劑。少腹逐瘀湯對(duì)EMT的治療是否與糾正在位內(nèi)膜病理狀態(tài)有關(guān)呢？本研究從在位內(nèi)膜的細(xì)胞增殖、凋亡及血管生成入手，初步揭示少腹逐瘀湯對(duì)EMT的治療作用及其機(jī)制，旨在為其在EMT治療中的應(yīng)用提供新證據(jù)、新思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠60只，雌性，體質(zhì)量(200±20) g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK- (軍)2014- 0001。

1.2 藥物

少腹逐瘀湯：根據(jù)王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》原方所載的藥味及配方比例，處方：當(dāng)歸9 g，生蒲黃9 g，五靈脂6 g，赤芍6 g，小茴香3 g，醋延胡索3 g，沒(méi)藥3 g，川芎3 g，肉桂3 g，炮姜0.6 g。以上藥物均購(gòu)于北京同仁堂唐山連鎖藥店有限公司。藥物制備采用傳統(tǒng)煎煮方法，除肉桂外其他藥物加水300 ml 先浸泡1 h，煮沸，文火煎煮60 min，肉桂后下，煎煮20 min；濾出藥液，濃縮至1 g·ml-1。

1.3 主要試劑及儀器

一抗PCNA小鼠單克隆抗體(批號(hào)610664，美國(guó)BD公司)，一抗CD34兔單克隆抗體(ab81289，美國(guó)Abcam公司)，一抗SMA- α小鼠單克隆抗體(ab7817，美國(guó)Abcam公司)，二步法免疫組化檢測(cè)系統(tǒng)(PV- 900，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，熒光二抗Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG(ab150077，美國(guó)Abcam公司)，熒光二抗Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(ab150116，美國(guó)Abcam公司)，Apop Tag過(guò)氧化物酶標(biāo)記的原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)系統(tǒng)(S7100，美國(guó)Chemicon公司)，DAB(0031，福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)，顯微鏡(奧林巴斯BX53)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物造模

60只大鼠常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后每日定時(shí)作陰道涂片檢查，選擇動(dòng)情周期4～5 d，并連續(xù)有兩個(gè)正常動(dòng)情周期的大鼠共計(jì)58只。隨機(jī)選取10只作為對(duì)照組，正常飼養(yǎng)。剩余48只大鼠在動(dòng)情期造模[9- 10]，造模前24 h給予戊酸雌二醇0.2 mg·只-1灌胃，造模時(shí)以2%戊巴比妥鈉按40 mg·kg-1對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。在無(wú)菌條件下選取尿道口上端約1 cm處為切入點(diǎn)，沿腹中線切開(kāi)1.5～2.0 cm的縱形切口，進(jìn)入腹腔后分離并結(jié)扎右側(cè)子宮，取中間段約1.5 cm，縱形剪開(kāi)宮腔，切取5 mm×5 mm大小的子宮組織，生理鹽水沖洗后將子宮組織以?xún)?nèi)膜面貼向左側(cè)腹膜血管豐富處，用5- 0非吸收性縫合線縫合子宮組織四角，關(guān)腹。術(shù)后連續(xù)3 d給予腹腔注射青霉素鈉，術(shù)后第10天起灌胃戊酸雌二醇0.02 mg·只-1，連續(xù)5 d。造模后第4周陸續(xù)選擇動(dòng)情期大鼠剖腹檢查，見(jiàn)移植的子宮內(nèi)膜體積增大，呈透明的結(jié)節(jié)狀或囊狀，內(nèi)有液體積聚，表面有結(jié)締組織覆蓋及血管形成，為造模成功。

1.4.2 動(dòng)物分組及干預(yù)

經(jīng)剖腹檢查證實(shí)造模成功的大鼠共計(jì)38只，隨機(jī)分為模型組及治療組，每組19只。治療組給藥量按人體正常給藥量46.6 g·d-1，根據(jù)大鼠體表面積換算為大鼠給藥量，模型組及對(duì)照組灌胃等體積生理鹽水，每周根據(jù)大鼠體質(zhì)量變化調(diào)整灌胃量，連續(xù)灌胃4周。藥物干預(yù)期間模型組有1只大鼠死于灌胃意外，治療組有1只大鼠因咬傷死亡。

1.4.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.3.1 大鼠子宮組織形態(tài)學(xué)觀察 將大鼠子宮及異位內(nèi)膜組織用10%甲醛溶液固定48 h，經(jīng)梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.3.2 免疫組化法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表達(dá) 二甲苯和梯度酒精對(duì)組織切片進(jìn)行脫蠟、水化，0.3%的H2O2室溫孵育10 min去除過(guò)氧化物酶，山羊血清37 ℃封閉30 min，一抗稀釋濃度為1∶50，4 ℃孵育過(guò)夜。二抗孵育參照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。每張切片在400倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行拍照，采用ImageProPlus6.0軟件分析細(xì)胞增殖指數(shù)，增殖指數(shù)(‰)=增殖細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×1000。

1.4.3.3 末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnickendlabeling,TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，每張切片在400倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行拍照，采用ImageProPlus6.0軟件分析細(xì)胞凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100。

1.4.3.4 免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)CD34、平滑肌肌動(dòng)蛋白α(α-smoothmuscleactin,SMA-α)蛋白表達(dá) 二甲苯和梯度酒精對(duì)組織切片進(jìn)行脫蠟、水化，山羊血清37 ℃封閉30min，一抗稀釋濃度為1∶200，4 ℃孵育過(guò)夜。二抗孵育參照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，DAPI染核，每張切片在200倍鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)視野進(jìn)行拍照，采用ImageProPlus6.0軟件分析微血管密度(microvesseldensity,MVD)、SMA-α陽(yáng)性MVD及血管成熟指數(shù)(vascularmaturityindex,VMI)。MVD=CD34陽(yáng)性血管計(jì)數(shù)/視野面積，VMI(%)=SMA-α陽(yáng)性MVD/MVD×100。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述；符合正態(tài)分布的多組數(shù)據(jù)比較，采用單因素方差分析one-wayANOVA；不符合正態(tài)分布的多組數(shù)據(jù)比較，采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 少腹逐瘀湯對(duì)在位內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)及內(nèi)膜厚度的影響

病理結(jié)果顯示，對(duì)照組子宮內(nèi)膜規(guī)整，間質(zhì)內(nèi)腺體完整、排列整齊，間質(zhì)細(xì)胞疏松排列整齊；模型組子宮內(nèi)膜增厚，間質(zhì)內(nèi)腺體管腔不規(guī)則，部分管腔消失，間質(zhì)細(xì)胞致密，炎癥細(xì)胞增多；治療組間質(zhì)內(nèi)腺體管腔完整，形態(tài)較規(guī)則，間質(zhì)細(xì)胞排列整齊，但較對(duì)照組更為密集，可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞。各組大鼠子宮內(nèi)膜組織圖片見(jiàn)圖1。對(duì)照組大鼠在位內(nèi)膜厚度為(475.00±29.43) μm，模型組在位內(nèi)膜明顯增厚達(dá)(523.60±33.32) μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組大鼠在位內(nèi)膜為(458.25±19.43) μm，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療組與對(duì)照組在位內(nèi)膜厚度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 少腹逐瘀湯對(duì)在位內(nèi)膜細(xì)胞增殖、凋亡的影響

3組大鼠在位子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞中PCNA表達(dá)均較低，各組間細(xì)胞增殖指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡較腺上皮明顯，其中對(duì)照組及治療組內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡指數(shù)高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，對(duì)照組與治療組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3組大鼠在位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2、表1。

2.3 少腹逐瘀湯對(duì)在位內(nèi)膜血管生成的影響

模型組MVD值高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療組MVD值低于模型組及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。治療組SMA- α陽(yáng)性MVD低于對(duì)照組(P<0.01)。模型組VMI值顯著低于對(duì)照組及治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3、表2。

A.對(duì)照組；B.模型組；C.治療組

圖1 各組大鼠子宮內(nèi)膜 HE染色×100

Fig 1 HE staining of endometrium of different groups of rats ×100

A1- 2.對(duì)照組；B1- 2.模型組；C1- 3.治療組

圖2 各組大鼠子宮內(nèi)膜PCNA、TUNEL表達(dá) ×400

Fig 2 Expressions of PCNA and TUNEL in endometrium of different groups of rats ×400

表1 各組大鼠在位內(nèi)膜細(xì)胞增殖指數(shù)及凋亡指數(shù)比較

Tab 1 Comparisons of proliferative and apoptotic index in endometrium of different groups of rats

組 別在位內(nèi)膜間質(zhì)在位內(nèi)膜腺上皮增殖指數(shù)/‰凋亡指數(shù)/%增殖指數(shù)/‰凋亡指數(shù)/%對(duì)照組16．26±10．8536．95±6．89a5．51±8．638．63±4．48模型組8．68±5．9322．94±9．727．75±11．826．09±4．61治療組13．62±12．3134．76±5．77a3．12±4．7110．75±8．89

a 與模型組比較，P<0.01

A1- 4.對(duì)照組；B1- 4.模型組；C1- 4.治療組；綠色為CD34標(biāo)記的微血管，紅色為SMA- α標(biāo)記的微血管，藍(lán)色為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核

圖3 各組大鼠子宮內(nèi)膜CD34、SMA- α免疫熒光染色 ×200

Fig 3 Expressions of CD34 and SMA- α in endometrium of different groups of rats ×200

表2 各組大鼠在位內(nèi)膜MVD、SMA- α陽(yáng)性血管密度、VMI水平的比較

Tab 2 Comparisons of MVD, SMA- α positive MVD and VMI in endometrium of different groups of rats

組 別MVD/個(gè)·mm-2SMA?α陽(yáng)性血管密度/個(gè)·mm-2VMI水平/%對(duì)照組91．78±5．50a88．92±11．6296．67±9．43b模型組127．01±29．9273．49±21．4457．78±10．32治療組70．17±12．91bc65．72±10．95c95．08±13．93b

與模型組比較， aP<0.05，bP<0.01； c 與對(duì)照組比較，P<0.01

3 討 論

在EMT的諸多發(fā)病學(xué)說(shuō)中，Sampson的經(jīng)血逆流理論居于主導(dǎo)地位。近年來(lái)，在位內(nèi)膜異常在EMT發(fā)病中的作用日益受到重視。郎景和院士提出的“在位內(nèi)膜決定論”正是基于對(duì)EMT患者在位內(nèi)膜研究的成果所提出的病因假說(shuō)。本研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)情期EMT模型大鼠子宮內(nèi)膜的厚度大于對(duì)照組，而治療組子宮內(nèi)膜厚度小于模型組，與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明EMT造模改變了子宮內(nèi)膜微環(huán)境，促進(jìn)了在位內(nèi)膜增殖。余燚薇等[11]比較EMT患者與非EMT患者增殖期、分泌期在位內(nèi)膜厚度發(fā)現(xiàn)，EMT患者在位內(nèi)膜明顯增厚；在EMT保守治療后3年隨訪期間，42.11%的復(fù)發(fā)患者于復(fù)發(fā)前出現(xiàn)在位內(nèi)膜增厚；據(jù)此認(rèn)為EMT患者在位內(nèi)膜厚度與疾病發(fā)生、復(fù)發(fā)密切相關(guān)，本研究結(jié)論與之一致。

大鼠子宮內(nèi)膜厚度的變化與內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、凋亡直接相關(guān)。本研究中以PCNA作為檢測(cè)細(xì)胞增殖的標(biāo)志。PCNA主要表達(dá)于細(xì)胞周期的S期，位于細(xì)胞核內(nèi)，是DNA聚合酶δ的輔助蛋白，為DNA復(fù)制所必需，可作為研究細(xì)胞增殖的有效標(biāo)志。本研究顯示，各組大鼠在位內(nèi)膜增殖均不明顯，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這是由于大鼠的動(dòng)情期與女性月經(jīng)周期中的黃體期類(lèi)似。在動(dòng)情期，大鼠子宮內(nèi)膜的增殖被抑制，核分裂及PCNA指數(shù)水平均處于動(dòng)情周期中的最低值[12]。因此，由于取材時(shí)間的局限，研究數(shù)據(jù)并不能全面反映細(xì)胞增殖對(duì)在位內(nèi)膜厚度的影響。研究中選用TUNEL方法監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示模型組在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯低于對(duì)照組及治療組，說(shuō)明模型組大鼠在位內(nèi)膜增厚可能與間質(zhì)細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)有關(guān)，而少腹逐瘀湯能夠誘導(dǎo)在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡。對(duì)EMT患者經(jīng)血及分泌晚期、月經(jīng)期子宮內(nèi)膜標(biāo)本的研究均顯示，在位內(nèi)膜凋亡指數(shù)顯著高于正常子宮內(nèi)膜。這一變化使得逆流經(jīng)血中的子宮內(nèi)膜碎片中具有更多的活細(xì)胞，由于這些細(xì)胞中抗凋亡因子B淋巴細(xì)胞瘤- 2(B- cell lymphoma- 2, bcl- 2)表達(dá)上調(diào)，促凋亡因子bcl- 2相關(guān)X蛋白(bcl- 2 assaciated X protein, bax)表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞對(duì)各種凋亡信號(hào)的敏感性下降，其發(fā)生異位種植的幾率自然更大[13]。而少腹逐瘀湯能夠誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡，使其恢復(fù)到正常水平，是否意味著少腹逐瘀湯能通過(guò)誘導(dǎo)凋亡起到預(yù)防EMT復(fù)發(fā)的治療作用呢？這一推論需要我們進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

血管生成是維持子宮內(nèi)膜異位種植生長(zhǎng)的必要條件，因此抗血管生成被認(rèn)為是EMT治療藥物的研究方向之一，多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示出抗血管生成藥物對(duì)于EMT具有良好的療效。EMT患者皆為育齡期女性，生理性血管生成是女性生殖功能正常及胚胎發(fā)育的先決條件，抗血管生成治療對(duì)女性生殖功能的影響是藥物評(píng)價(jià)中需要解決的問(wèn)題。促進(jìn)血管生成的因素眾多，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血管生成素(angiogenin, Ang)、血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor, PDGF)，甚至多種炎癥細(xì)胞因子也能誘導(dǎo)血管生成[14]。中藥復(fù)方往往通過(guò)多層次、多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)發(fā)揮抗血管生成作用，因此本研究選擇MVD作為評(píng)價(jià)血管生成的指標(biāo)，組織中MVD值越高說(shuō)明毛細(xì)血管越豐富，MVD可以直接反映出藥物抗血管生成的療效。EMT患者在位內(nèi)膜血管新生活躍，表現(xiàn)為VEGF高表達(dá)，MVD值明顯高于正常子宮內(nèi)膜[3]。血管生成異?；钴S的子宮內(nèi)膜，其對(duì)胚胎的接受能力反而更差[15]，子宮內(nèi)膜容受性差正是出現(xiàn)EMT不孕的原因之一[16]。綜上所述，糾正在位內(nèi)膜異常的血管生成狀態(tài)將有益于EMT的治療。本研究結(jié)果顯示：模型組在位內(nèi)膜MVD值明顯高于對(duì)照組，與以往研究結(jié)論[3]一致；少腹逐瘀湯可以抑制在位內(nèi)膜血管生成。但出人意料的是，治療組的MVD值明顯低于對(duì)照組，這一現(xiàn)象是否會(huì)影響胚胎著床及發(fā)育還需深入研究。周細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞共同構(gòu)成毛細(xì)血管，在維持血管穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要作用。新生血管中周細(xì)胞覆蓋率偏低是導(dǎo)致血管生成活躍的原因之一[17]。SMA- α是周細(xì)胞的主要標(biāo)志蛋白之一，VMI即微血管的周細(xì)胞覆蓋率，是反映微血管成熟度的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，模型組在位內(nèi)膜的周細(xì)胞覆蓋率明顯低于對(duì)照組及治療組。說(shuō)明異位病灶在促進(jìn)在位內(nèi)膜血管生成的同時(shí)，還造成了新生血管結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。這種血管通透性高，更有利于炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[17]。少腹逐瘀湯能夠調(diào)控周細(xì)胞的生物學(xué)行為，促進(jìn)新生血管成熟，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

少腹逐瘀湯作為治療寒凝血瘀型痛經(jīng)的代表方劑，被諸多中醫(yī)婦科名家如季金玲、王大增等作為治療EMT的主方[18- 19]。已有研究表明，少腹逐瘀湯可以改善寒凝血瘀型EMT 大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)，降低血清中E2水平[20]，抑制異位病灶中血管新生及異位內(nèi)膜細(xì)胞侵襲[21- 22]。本研究結(jié)果表明，少腹逐瘀湯能夠從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制血管新生、促進(jìn)新生血管成熟3個(gè)方面改善EMT大鼠在位內(nèi)膜的病理狀態(tài)，提示其可能具有提高EMT大鼠子宮內(nèi)膜容受性或降低EMT保守術(shù)后復(fù)發(fā)率的治療作用，為少腹逐瘀湯在EMT治療中的臨床應(yīng)用提供思路。

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(本文編輯：周蘭波)

Effects of Shao Fu Zhu Yu Decoction on proliferation, apoptosis and angiogenesis in eutopic endometrium of rat endometriosis model

CHEN Yu- shi1,ZHU Guang- hui1,DONG Jian- xin2,BAI Su- fen1,DU Chen- guang1,CAO Ying1

(1.NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China; 2.TheAffiliatedHospital,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective: To observe the effects of Shao Fu Zhu Yu Decoction(SFZY) on proliferation, apoptosis and angiogenesis in eutopic endometrium of endometriosis rats, and to explore the mechanisms of SFZY for treating endometriosis. Methods: 10 rats were randomly assigned to control group from 58 female SD rats, the rest rats underwent surgical induction of endometriosis with autotransplantation. 38 rats with successful ectopic implants were divided into two groups: model group and treated group. SFZY was administered to rats in the treated group by gastrogavage. After a 4- week treatment period, histopathological properties of the eutopic endometrium were evaluated, expression of PCNA in the eutopic endometrium was detected by immunohistochemistry, apoptotic cells were assessed by TUNEL, expression of CD34 and SMA- α in the eutopic endometrium was detected by immunofluorescence double- staining for calculating microvessel density(MVD) and vascular maturity index(VMI). Results: The eutopic endometrium was significantly thicker(P<0.05)in the model group compared to the control and treated group, the apoptosis index and VMI were significantly lower(P<0.01)in the model group compared to the control and treated group, the MVD was significantly increased(P<0.05)in the model group compared to the control and treated group. Conclusion: SFZY can inhibit the proliferation of eutopic endometrium through inducing apoptosis of eutopic endometrial stromal cells in endometriosis rats, and inhibit angiogenesis and induce vessel maturation in eutopic endometrium.

Shao Fu Zhu Yu Decoction; endometriosis; cell proliferation; cell apoptosis; angiogenesis; rats

2016- 09- 28

2016- 12- 09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81603455)；河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目(2015165)；2015年河北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目；2015年華北理工大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(X2015061)

陳雨詩(shī)(1993-)，女，遼寧鞍山人，在讀本科生。E- mail:529621925@qq.com

曹穎 E- mail:couny02@163.com

陳雨詩(shī),朱廣輝,董建新,等.少腹逐瘀湯對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠在位內(nèi)膜增殖、凋亡及血管生成的影響[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2017,36(2):142- 148.

R285.5; R711.71; R- 332

A

1671- 6264(2017)02- 0142- 07

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.02.003