乳腺癌患者外周血中TGF-β1和P53蛋白與臨床特征的關(guān)系

丁明劍 楊文華 白楊 崔國忠 戴殿祿

·論著·

乳腺癌患者外周血中TGF-β1和P53蛋白與臨床特征的關(guān)系

丁明劍 楊文華 白楊 崔國忠 戴殿祿

目的 研究乳腺癌患者在治療前后外周血中轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)與P53蛋白含量變化，初步探討二者與乳腺癌患者各項臨床特征之間的關(guān)系。方法 選取乳腺癌患者80例作為乳腺癌組，30例乳腺增生女性作為乳腺增生組。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗分別測定乳腺癌患者于治療前后外周血中TGF-β1與P53蛋白含量變化，與乳腺增生組對照，說明其治療前后的濃度變化及與乳腺癌各項臨床特征之間的關(guān)系。結(jié)果 乳腺癌患者中外周血中TGF-β1及P53蛋白的含量顯著高于乳腺增生組(P<0.05)，且經(jīng)過有效的治療后，二者的含量顯著下降(P<0.05)。TGF-β1與P53蛋白的含量在腫瘤的組織學分級及腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否有顯著的關(guān)聯(lián)(P<0.05)，與乳腺癌組織中的雌激素受體表達無顯著相關(guān)(P>0.05)。乳腺癌患者的周血中TGF-β1與P53蛋白含量呈正相關(guān)(r=0.348,P<0.01)。結(jié)論 乳腺癌患者外周血中TGF-β1與P53蛋白的含量顯著增高，且與腫瘤組織學分級及腋下淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，能夠為乳腺癌的臨床治療工作提供新的靶點及思路。

TGF-β1；P53；乳腺腫瘤；酶聯(lián)免疫吸附

轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β,TGF-β1) 是一種具有多種生物活性的多肽類細胞因子，在腫瘤的發(fā)展過程中,TGFβ1信號通路失衡或者發(fā)生改變，多種癌基因發(fā)生突變，腫瘤細胞分泌大量的活性TGF-β1，改變腫瘤細胞外的微環(huán)境，從而由抑制腫瘤的生長演變成為促進腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移[1,2]。而P53基因是迄今了解最多的抑癌基因之一，野生型的P53基因?qū)τ诩毎纳L、分化及增殖起著重要的調(diào)控作用，而突變型的P53基因則與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1調(diào)節(jié)通路中的某些促癌基因的轉(zhuǎn)錄激活需要突變型的P53基因[3]，說明二者之間在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有著密不可分的聯(lián)系。乳腺癌是目前臨床工作中較為常見的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年升高，復發(fā)轉(zhuǎn)移風險高，外周血中尚無特別靈敏有效的腫瘤標記物來判斷乳腺癌患者的相關(guān)臨床與病理特征，我們通過酶聯(lián)免疫吸附法測定乳腺癌患者外周血中的TGF-β1及P53蛋白的含量，初步探討二者與乳腺癌臨床特征之間的關(guān)系及二者之間是否存在著某種關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取滄州市中心醫(yī)院2003年6月至2008年6月經(jīng)病理證實的乳腺癌患者80例，均為女性，年齡26～72歲，中位年齡46.8歲，所有患者行乳腺癌改良根治術(shù)，術(shù)后給予蒽環(huán)類及紫杉醇藥物為主的化療6～8周期，腋下淋巴結(jié)3枚或3枚以上者行局部放射治療。其中組織學分級Ⅰ～Ⅱ級患者59例，Ⅲ級患者21例，有腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者39例，ER表達陽性者21例，有乳腺癌家族史者13例，已絕經(jīng)者42例。另外隨機選取我院體檢中心乳腺增生女性患者30名作為乳腺癌組。

1.2 標本收集 3組患者均取晨起空腹靜脈血5 ml，其中乳腺癌治療前組均未進行任何治療前抽取，乳腺癌治療組則在患者規(guī)范完成所有治療后抽取，3 000 r/min離心10 min提取血清，-20℃保存，1周內(nèi)測定。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附法 采用雙抗體夾心法進行酶聯(lián)免疫吸附實驗，TGF-β1檢測試劑盒購于Genzyme公司，P53蛋白試劑盒購于上海森雄公司，按照實驗說明書進行操作，具體的實驗步驟為加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、顯色、終止反應(yīng)、測量吸光度，實驗重復3次，采用Germany M5000酶聯(lián)免疫分析儀，檢測指標濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中TGF-β1及P53蛋白的含量。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組及乳腺增生組外周血中TGF-β1及P53蛋白含量 乳腺癌患者外周血中TGF-β1和P53蛋白的含量顯著高于乳腺增生組，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為12.606和24.352，P=0.000)。見表1。

項目乳腺癌治療前組(n=80)乳腺增生組(n=30)t值P值TGF?β1 96．3±16．456．6±8．312．6060．000P53蛋白167．3±20．270．9±5．524．3520．000

2.2 乳腺癌患者治療前后TGF-β1及P53蛋白含量的變化 經(jīng)過有效治療后，乳腺癌患者外周血中的TGF-β1、P53蛋白含量與治療前比較均有明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

組別治療組治療后t值P值TGF?β196．3±16．467．8±9．115．1020．000P53蛋白167．3±20．277．7±7．735．9060．000

2.3 治療前TGF-β1的含量與乳腺癌臨床特征之間的關(guān)系 乳腺癌患者外周血中TGF-β1的含量在不同年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤家族史、腫瘤大小等方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但在腫瘤的組織學分級及腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否有顯著的關(guān)聯(lián)(P<0.05)。見表3。

2.4 治療前P53蛋白的含量與乳腺癌臨床特征之間的關(guān)系 乳腺癌患者外周血中P53的含量在不同年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤家族史、腫瘤大小等方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但在腫瘤的組織學分級及腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否有顯著的關(guān)系(P<0.05)。見表4。

2.5TGF-β1與P53蛋白與乳腺癌組織中ER表達之間的關(guān)系TGF-β1與P53蛋白與乳腺癌組織中的雌激素受體表達無明顯關(guān)聯(lián)(P<0.05)。見表5。

2.6 乳腺癌患者外周血中TGF-β1與P53蛋白二者之間的關(guān)系：以治療前乳腺癌患者外周血中TGF-β1含量為橫軸，P53蛋白的含量為縱軸，繪制散點圖，可見二者表達情況呈正相關(guān)(r=0.348，P=0.002)。見圖1。

臨床病理特征數(shù)值t(F)值P值年齡(歲) >50(n=43)98．2±18．0 <50(n=37)94．0±14．31．1680．248絕經(jīng)狀態(tài) 未(n=38)98．1±17．6 已(n=42)94．6±15．30．9480．346家族史 有(n=13)88．8±17．4 無(n=67)97．5±16．01．7760．08腫瘤大小(cm) <2(n=34)100．0±15．4 2～5(n=38)93．2±13．2 >5(n=8)94．1±18．71．5870．211淋巴結(jié)狀態(tài) 陽性(n=39)104．4±14．2 陰性(n=41)88．5±14．74．9270．000組織學分級 Ⅰ～Ⅱ級(n=59)90．2±16．0 Ⅲ級(n=21)105．8±12．24．6530．000

臨床病理特征數(shù)值t(F)值P值年齡(歲) >50(n=43)121．3±44．8 <50(n=37)113．8±31．10．8810．381絕經(jīng)狀態(tài) 未(n=38)121．0±41．9 已(n=42)103．8±13．91．610．109家族史 有(n=13)130．1±44．9 無(n=67)115．8±37．51．1110．270腫瘤大小(cm) <2(n=34)167．4±19．0 2～5(n=38)169．2±20．7 >5(n=8)157．3±33．71．1460．323淋巴結(jié)狀態(tài) 陽性(n=39)130．84±40．3 陰性(n=41)104．9±31．93．270．002組織學分級 Ⅰ～Ⅱ級(n=59)161．8±17．6 Ⅲ級(n=21)175．1±21．43．0640．003

3 討論

TGF-β1在惡性腫瘤的發(fā)展過程中起著雙重作用。在癌變的早期，TGF-β1誘導上皮細胞凋亡而產(chǎn)生抑制癌變的作用。隨著腫瘤的發(fā)展，腫瘤細胞逃逸了TGFβ1的抑制作用，同時分泌大量的活性TGF-β1，改變了腫瘤細胞外的微環(huán)境，促進腫瘤細胞的血管生成，從而促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，目前TGF-β1這種從抑制癌變到促進癌變的轉(zhuǎn)換機制并不十分明確[1-4]。人P53基因定位于17號染色體，其野生型編碼產(chǎn)物為一大小為53kD的磷酸化蛋白，參與細胞周期調(diào)控、細胞分化、細胞程序化死亡等多種病理生理過程，易分解，不宜檢測。而研究證實，突變型的P53基因編碼產(chǎn)物穩(wěn)定性強，不易水解，于組織細胞中堆積，可以被免疫組化方法檢測[5,6]，且其在人類大多數(shù)腫瘤中均有突變，如在肺癌患者中其突變率高達80%以上[7]。LEE等[8]證實在哺乳類細胞動物中，P53基因發(fā)生突變，均可以使TGF-β1的生長抑制作用轉(zhuǎn)換成為生長促進作用，且在結(jié)腸癌患者中，TGF-β1和P53與其病理分期程相關(guān)，且P53的表達強度與TGF-β1及其下游信號通路的Smad蛋白相關(guān)，二者表達程協(xié)同增強[9]。因此，我們可以得出結(jié)論，突變型的P53基因與TGF-β1的密切相關(guān)，二者的協(xié)同表達很可能在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，而且，突變型的P53基因極有可能在TGF-β1對于腫瘤細胞的雙重作用的轉(zhuǎn)換中扮演著重要的角色。

項目ER陽性ER陰性t值P值TGF?β193．9±15．598．1±17．31．1330．261P53蛋白170．4±20．2166．2±20．00．6960．491

圖1 乳腺癌患者外周血中TGF-β1與P53蛋白二者之間的關(guān)系

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，涉及到多個癌基因與抑癌基因、多個信號同路的轉(zhuǎn)變，目前研究發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤的進展過程中，TGF-β1能夠促進惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，與胃癌[10]、肺癌[11]、結(jié)腸癌[12]、乳腺癌[13,14]等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，但是TGF-β1由抑制腫瘤細胞的生長轉(zhuǎn)化成促進腫瘤細胞的生長機制并不明確。同時P53基因的突變與多種惡性腫瘤的關(guān)系已經(jīng)得到證實[5-7]，那么TGF-β1與P53蛋白在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演者什么樣的角色，以及二者之間的關(guān)系目前并不明確。在本研究中，我們通過檢測乳腺癌患者外周血中TGF-β1和P53蛋白含量并與健康人群對比，發(fā)現(xiàn)其含量均顯著高于健康人群，且二者呈顯著正相關(guān)。據(jù)此，我們可以推測TGF-β1和P53蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中，起著重要的促進作用，很有可能的機制是，在TGF-β1對于癌細胞的雙重作用轉(zhuǎn)換中，P53基因的突變是其重要的“分子開關(guān)”之一。同時，在規(guī)范的治療周期結(jié)束之后，乳腺癌患者外周血中TGF-β1和P53蛋白的含量顯著下降，證實治療有效，也更加印證外周血中TGF-β1和P53蛋白與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展成正相關(guān)，同時也能夠說明聯(lián)合檢測乳腺癌患者外周血中TGF-β1和P53蛋白的含量有可能能夠成為篩查乳腺癌患者的指標之一，對于腫瘤的治療應(yīng)答也具有一定的檢測價值。

同時在本研究中，我們也對乳腺癌患者外周血中TGF-β1和P53蛋白的含量與其各項臨床特征進行了研究。目前已經(jīng)證實乳腺癌患者的組織學分級及腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)與其預(yù)后呈顯著相關(guān)[15]，Bao等[16]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中TGF-β1的表達含量愈高，其腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)目愈多，其無瘤生存時間愈短，而本研究中證實乳腺癌患者外周血中TGF-β1和P53蛋白的含量愈高，其組織學分級愈差，腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移愈多，與Bao等[16]研究結(jié)果是一致的，也就是說明乳腺癌患者外周血中TGF-β1和P53蛋白的含量愈高，患者的預(yù)后越差。因此，TGF-β1和P53蛋白也有望成為判斷乳腺癌患者預(yù)后的指標之一，而對于雌激素受體的表達，我們并沒有發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者外周血中的TGF-β1和P53蛋白含量與之有關(guān)。

TGF-β1的含量增高，如何參與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移過程，P53蛋白是否參與其中，目前并不十分明確。大多數(shù)研究者認為[17]，正常組織細胞中依賴于Smad的TGF-β1信號傳導通路與Smad非依賴性的TGF-β1信號傳導通路處于平衡狀態(tài)，兩者可以相互調(diào)節(jié)，而腫瘤細胞中這種平衡被破壞。Lang等[18]發(fā)現(xiàn)TGF-β1能夠促進uPA/PAI-1等細胞因子的活化，從而參與乳腺癌的復發(fā)與轉(zhuǎn)移，也有研究證實TGF-β1介導SMAD3/SMAD4信號傳導通路參與了腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移，而P53蛋白的表達升高是否參與TGF-β1的促癌作用[19]，目前尚未見國內(nèi)外相關(guān)報道，因此，TGF-β1含量上調(diào)在乳乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中其具體的分子機制則有待于進一步研究。

綜上所述，通過聯(lián)合檢測乳腺癌患者外周血中的TGF-β1和P53蛋白含量，可對于判斷乳腺癌的發(fā)展轉(zhuǎn)歸具有一定的意義，同時針對TGF-β1和P53蛋白的靶向治療也有望能夠為乳腺癌的臨床治療提供新的思路。

1RosmanDS,PhukanS，HuangCC，etal.TGFBR1*6AEnhancestheMigrationandInvasionofMCF-7BreastCancerCellsthroughRhoAActivation.CancerRes,2008,68:1319-1328.

2RobertsAB,WakefieldLM.Thetwofacesoftransforminggrowthfactorβincarcinogenesis.PNAS,2003,100:8621-8623.

3KajdaniukD,MarekB,Borgiel-MarekH,etal.“Transforminggrowthfactor-β1 (TGF-β1)inphysiologyandpathology,”EndokrynologiaPolska,vol.64,no.5,pp,2013:384-396.

4BuckMB,FritzP,DipponJ,etal.Prognosticsignificanceoftransforminggrowthfactor-receptorIIinestrogenreceptor-negativebreastcancerpatients.ClinCancerRes,2004,10:491-498.

5WylieA,JonesAE,AbramsJM.p53?inthegameoftransposons.Bioessays,2016,38:1111-1116.

6RileyT,SontagE,ChenP,etal.TranscriptionalcontrolofhumanP53-regulatedgenes.NatRevMolCellBiol,2008,9:402-412.

7LiG,ZhaoJ,PengX,etal.Radiation/paclitaxeltreatmentofP53-abnormalnon-smallcelllungcancerxenografttumorandassociatedmechanism.CancerBiother.Radiopharm,2012,27:227-233.

8LeeSO,AndeyT,JinUH,etal.ThenuclearreceptorTR3regulatesMtorc1signalinginlungcancercellsexpressingwild-typeP53.Oncogene,2012,31:3310.

9CordenonsiM,DupontS,MarettoS,etal.Linksbetweentunmorsupressors:p53isrequiredforTGF-betageneresponsesbycooperaringwithSmads.Cell,2003,113:301-304.

10 沈衛(wèi)東，劉鵬飛，劉兵團，等．TGF-β1和Smad2在胃癌中的表達及意義． 世界華人消化雜志，2012，20:1238-1241．

11MinamiyaY,MiuraM,HinaiY,etal.Transforminggrowthfactor-β1 29T>Cgeneticpolymorphismisassociatedwithlymphnodemetastasisinpatientswithadenocarcinomaofthelung.TumourBiol,2010,31:437-441.

12 周瑞，丁明劍，熊斌.轉(zhuǎn)化生長因子βⅠ型受體多態(tài)性在結(jié)腸癌細胞侵襲遷移中的作用.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2012,6:7200-7204.

13BholaNE,BalkoJM,DuggerTC,etal.TGF-βinhibitionenhanceschemotherapyactionagainsttriple-negativebreastcancer.JClinInvest,2013,123:1348-1358.

14LangDS,MarwitzS,HeilenktterU,etal.TransformingGrowthFactor-BetaSignalingLeadstouPA/PAI-1ActivationandMetastasis:AStudyonHumanBreastCancerTissuesT.GoldmannPathology&OncologyResearchJuly,2014,20:727-732.

15 張麗,趙曉輝,伶仲生,等.356例三陰性乳腺癌的臨床特征及預(yù)后多因素分析中國腫瘤臨床,2010,37:1045-1049.

16BaoJ,WuZS,QiY,etal.ExpressionofTGF-beta1andthemechanismofinvasivenessandmetastasisinducedbyTGF-beta1inbreastcancerChinesejournalofoncology,2009,31:679-828.

17JakowlewSB.Transforminggrowthfactor-βincancerandmetastasis，CancerMetastasisRev,2006，25:435-457.

18LangDS,MarwitzS,Heilenk?tterU,etal.TransformingGrowthFactor-BetaSignalingLeadstouPA/PAI-1ActivationandMetastasis:AStudyonHumanBreastCancerTissuesT.GoldmannPathology&OncologyResearchJuly,2014,20:727-732.

19XueJ,LinX,ChiuWT,etal.SustainedactivationofSMAD3/SMAD4byFOXM1promotesTGF-β-dependentcancermetastasis.JClinInvest,2014,3:564-579.

Correlation between the changes of TGF-β1,P53 protein levels in peripheral blood and clinical characteristics in patients with breast cancer

DINGMingjian,YANGWenhua,BAIYang,etal.
DepartmentofOncology,CentralHospitalofCangzhouCity,Hebei,Cangzhou061000,China

Objective To observe the changes of TGF-β1,P53 protein levels in peripheral blood of patients with breast cancer in order to explore the correlation between the two factors and clinical characteristics of nreast cancer.Methods Eighty patients with breast cancer were enrolled as breast cancer group, and 30 patients with hyperplasia of mammary glands were served as mammary glands hyperplasia group (MGH group). The expression levels of TGF- β 1 and P53 protein in peripheral blood of patients with breast cancer before and after treatment were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), which were compared with those in patients with hyperplasia of mammary glands. Moreover the correlation between the changes of expression levels of TGF-β1,P53 protein before and after treatment and clinical characteristics of breast cancer was analyzed.Results The expression levels of TGF-β1 and P53 protein in breast cancer group were significantly higher than those in MGH group (P<0.05).Aftertreatment,theexpressionlevelsofTGF-β1andP53proteinwereobviouslydecreased(P<0.05).TheexpressionlevelsofTGF-β1andP53proteinwerecloselycorrelatedtohistologicalgradingandaxillarylymphnodemetastasisofbreastcancer(P<0.05),however,whichwerenotrelatedwiththeexpressionlevelsofestrogenreceptorinbreastcancertissues(P>0.05).MoreovertheexpressionofTGF-β1waspositivelycorrelatedtothatofP53protein(r=0.348,P<0.01).Conclusion The expression levels of TGF-β1and P53 protein in peripheral blood of patients with breast cancer are obviously increased, moreover,which are closely correlated to histological grading and axillary lymph node metastasis of breast cancer,therefor,which can provide new targets and ideas for clinical treatment of breast cancer

TGF-β1; P53; breast cancer; enzyme linked immunosorbent assay

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.10.003

061000 河北省滄州市中心醫(yī)院

戴殿祿，061000 河北省滄州市中心醫(yī)院；

E-mail:czssl@tom.com

R

A

1002-7386(2017)10-1453-04

2016-11-16)