熒光編碼微球的制備研究進(jìn)展

李 艷 羅 成* 吳道澄

1(宜春學(xué)院醫(yī)學(xué)院，江西 宜春 336000)2(西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院教育部生物醫(yī)學(xué)信息工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710049)

熒光編碼微球的制備研究進(jìn)展

李 艷1羅 成1*吳道澄2

1(宜春學(xué)院醫(yī)學(xué)院，江西 宜春 336000)2(西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院教育部生物醫(yī)學(xué)信息工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710049)

懸浮芯片技術(shù)是近年來(lái)興起的高通量生物檢測(cè)技術(shù)，在生命科學(xué)研究及臨床診斷等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。作為懸浮芯片技術(shù)的檢測(cè)載體，熒光編碼微球的研究已取得一系列進(jìn)展。首先對(duì)懸浮芯片技術(shù)的檢測(cè)原理及應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹，重點(diǎn)對(duì)熒光編碼微球的制備方法進(jìn)行總結(jié)，包括有機(jī)溶劑溶脹法、層-層自組裝法、包埋法、微流控技術(shù)、膜乳化法等，最后對(duì)熒光編碼微球未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行探討。

懸浮芯片；微球；熒光編碼；量子點(diǎn)

引言

懸浮芯片技術(shù)又稱為懸浮陣列和液相芯片，是在傳統(tǒng)平面生物芯片技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的高通量生物檢測(cè)技術(shù)。與平面生物芯片技術(shù)相比，懸浮芯片具有多功能性、高敏感性、高通量、高靈活性等優(yōu)勢(shì)[1-3]，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究及臨床診斷等諸多領(lǐng)域。作為最常用的懸浮芯片檢測(cè)載體，熒光編碼微球的研究近年來(lái)取得了大量進(jìn)展，涌現(xiàn)了多種多樣的制備方法。下面先對(duì)懸浮芯片的檢測(cè)原理及應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹，再重點(diǎn)對(duì)熒光編碼微球的制備方法、熒光編碼與其他功能的復(fù)合、熒光編碼微球的發(fā)展趨勢(shì)等進(jìn)行系統(tǒng)闡述。

1 懸浮芯片技術(shù)

1.1 檢測(cè)原理

懸浮芯片技術(shù)的檢測(cè)原理如圖1所示，其中編碼微球作為免疫檢測(cè)的載體，所帶有的編碼信息同時(shí)用作表面結(jié)合探針?lè)肿拥臉?biāo)記。懸浮芯片技術(shù)的分析過(guò)程為：目標(biāo)分子先與編碼微球表面負(fù)載的探針?lè)肿咏Y(jié)合，再進(jìn)一步與帶有熒光標(biāo)記的報(bào)告分子結(jié)合，形成夾心式結(jié)構(gòu)的復(fù)合體，微球帶有的編碼信息用于區(qū)分目標(biāo)分子的種類，而報(bào)告分子的信號(hào)強(qiáng)弱則反映目標(biāo)分子的含量。

圖1 懸浮芯片技術(shù)檢測(cè)原理Fig.1 Schematic illustration of suspension array analysis

1.2 技術(shù)應(yīng)用

懸浮芯片技術(shù)在基因表達(dá)譜分析、基因突變及多態(tài)性分析、病原微生物檢測(cè)、疾病的早期診斷等方面具有廣泛的應(yīng)用[4-5]。朱鵬等利用多重PCR、多重等位基因特異性引物延伸反應(yīng)以及懸浮芯片技術(shù)，確定了東方型鼠疫菌中18個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)的堿基狀態(tài)，并依據(jù)這18個(gè)SNP將36株?yáng)|方型鼠疫菌分為7個(gè)基因型[6]。Sun等利用多重PCR結(jié)合懸浮芯片分析技術(shù),同時(shí)鑒定6種食源性致病菌(大腸桿菌O157:H7，志賀氏桿菌，沙門(mén)氏菌，副溶血性弧菌，金黃色葡萄球菌，單增李斯特菌)，檢測(cè)靈敏度比傳統(tǒng)的PCR法高1～5個(gè)數(shù)量級(jí)，多重檢測(cè)的檢測(cè)限為1～10 CFU/mL[7]。Nolen等利用懸浮芯片技術(shù)，測(cè)定了包括83例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、74例良性肺部腫瘤和77例正常人群尿液樣本中的242種生物標(biāo)志物，并確定了一組針對(duì)NSCLC的腫瘤標(biāo)志物(IGFBP-1，sIL-1Ra，CEACAM-1)，這對(duì)區(qū)分NSCLC和正常對(duì)照組具有很高的特異性[8]。Tong等利用懸浮芯片技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，檢測(cè)胃癌的10種血清標(biāo)志物，通過(guò)3種診斷算法篩選了5種標(biāo)志物，該組標(biāo)志物的含量顯著高于其他細(xì)胞因子和標(biāo)志物，有望提高胃癌的檢測(cè)準(zhǔn)確性[9]。由于懸浮芯片技術(shù)具有高通量、多功能性等優(yōu)勢(shì)，所以在臨床檢驗(yàn)診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、農(nóng)業(yè)監(jiān)測(cè)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 熒光編碼微球

2.1 微球編碼方式

微球的編碼方式主要包括光譜編碼(熒光編碼、拉曼編碼、光子晶體反射編碼)、圖形編碼、熒光壽命編碼、衍射及全息編碼等[3,10-11]。相對(duì)于其他編碼方式，熒光編碼具有編碼及解碼過(guò)程簡(jiǎn)單、編碼容量大、可大批量制備等優(yōu)勢(shì)。熒光編碼微球利用熒光發(fā)射波長(zhǎng)和強(qiáng)度進(jìn)行編碼，理論上編碼容量C=Nm-1，N是熒光的強(qiáng)度梯度，m是發(fā)射波長(zhǎng)的數(shù)量，1對(duì)應(yīng)所有熒光強(qiáng)度為零的編碼。以3種發(fā)射波長(zhǎng)、每個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)分為10個(gè)濃度梯度為例，編碼容量可以達(dá)到C=103-1=999。熒光編碼微球可以通過(guò)流式細(xì)胞儀或者微流控系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，分析速度達(dá)到幾千甚至幾萬(wàn)赫茲，因而特別適用于高通量樣本分析。

2.2 熒光編碼元件

熒光編碼微球的編碼元件主要分為有機(jī)熒光染料、量子點(diǎn)和上轉(zhuǎn)換納米顆粒3類[12]。有機(jī)熒光染料價(jià)格低廉、種類較多，適用于多種編碼方法和多種材質(zhì)的微球，不同批次間熒光均一性好；缺點(diǎn)在于熒光穩(wěn)定性差，激發(fā)光譜不重疊的染料需要多個(gè)激發(fā)光源進(jìn)行激發(fā)，因而增加了分析儀器的成本。量子點(diǎn)的發(fā)射光譜窄，熒光穩(wěn)定性好，發(fā)射波長(zhǎng)可以通過(guò)量子點(diǎn)的尺寸和組分進(jìn)行調(diào)節(jié)，其較寬的激發(fā)光譜可以實(shí)現(xiàn)多種量子點(diǎn)的單一波長(zhǎng)激發(fā)，缺點(diǎn)在于組成量子點(diǎn)的重金屬元素具有一定的毒性。部分有機(jī)染料或量子點(diǎn)制備的熒光編碼微球需要較短的激發(fā)波長(zhǎng)，所以導(dǎo)致較強(qiáng)的背景干擾(瑞麗散射和自發(fā)熒光)。上轉(zhuǎn)換納米顆粒利用近紅外光激發(fā)，可以有效避免生物分子背景熒光的干擾，同時(shí)利用上轉(zhuǎn)換納米顆粒編碼，可以避免不同發(fā)射波長(zhǎng)間的共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，缺點(diǎn)是具有不同發(fā)射波長(zhǎng)的上轉(zhuǎn)換納米顆粒種類較少。

3 熒光編碼微球制備方法

3.1 有機(jī)溶劑溶脹法

有機(jī)溶劑溶脹法的基本原理為：聚合物微球在有機(jī)溶劑中溶脹，染料或量子點(diǎn)等滲透入微球內(nèi)部；移除有機(jī)溶劑后，微球聚合物網(wǎng)絡(luò)發(fā)生收縮，并將染料或量子點(diǎn)等包裹在微球內(nèi)部；調(diào)整染料或量子點(diǎn)的種類和濃度，可以實(shí)現(xiàn)不同的熒光編碼。利用該方法制備的代表性熒光編碼微球是Luminex公司的MicroPlex?微球，是利用紅色和近紅外染料對(duì)聚苯乙烯微球進(jìn)行編碼，兩種染料分別設(shè)定10個(gè)濃度梯度，得到了100種熒光編碼微球，并開(kāi)發(fā)了與MicroPlex?編碼微球配套的xMAP(multi-analyte profiling)多重樣本分析平臺(tái)。新一代的MagPlex?微球在此基礎(chǔ)上增加了第三種熒光染料(5個(gè)濃度梯度)，得到了500種編碼微球。基于類似的原理，Han等利用疏水性ZnS-CdSe量子點(diǎn)制備熒光編碼微球，微球的熒光強(qiáng)度與微球內(nèi)部量子點(diǎn)的數(shù)量成線性關(guān)系[13]。在單色熒光編碼的基礎(chǔ)上，按照量子點(diǎn)尺寸從大到小的順序，依次負(fù)載不同發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)微球的多色熒光編碼。選用與量子點(diǎn)相同激發(fā)波長(zhǎng)(350 nm)的染料標(biāo)記DNA目標(biāo)分子，可以實(shí)現(xiàn)編碼微球和目標(biāo)分子的單一激發(fā)光源的激發(fā)。Zhang等利用類似的方法，將上轉(zhuǎn)換納米顆粒包裹在聚苯乙烯微球內(nèi)部，調(diào)整不同發(fā)射波長(zhǎng)上轉(zhuǎn)換納米顆粒的比例，可以獲得不同的熒光編碼微球[14]。上轉(zhuǎn)換熒光編碼與報(bào)告分子染料標(biāo)記沒(méi)有光學(xué)交叉，因此標(biāo)記染料的可選擇范圍很寬(見(jiàn)圖2)。

圖2 不同上轉(zhuǎn)換納米顆粒編碼微球用于目標(biāo)分子檢測(cè)[14]Fig.2 Microspheres encoded with different upconversion nanoparticles for detection of targeted molecules[14]

為了增加熒光編碼微球的熒光均一性和穩(wěn)定性，許多學(xué)者對(duì)有機(jī)溶劑溶脹法進(jìn)行了改進(jìn)。Wang等利用有機(jī)溶劑溶脹-溶劑蒸發(fā)法，制備熒光編碼微球[15]。量子點(diǎn)和微球的氯仿溶液在密封條件下攪拌2 h溶脹微球，之后將溶液在空氣氛下攪拌2 h，隨著氯仿的揮發(fā)，溶液中量子點(diǎn)的濃度逐漸升高，促使量子點(diǎn)滲入微球內(nèi)部。該方法可以增加量子點(diǎn)在微球內(nèi)的包裹效率和分布均一性。Song等利用漸次溶劑蒸發(fā)方式，制備熒光編碼微球[16]。微球分散在異丙醇中，與量子點(diǎn)的氯仿溶液混合后，在真空干燥箱中干燥12 h。由于量子點(diǎn)在氯仿中的分散性比在異丙醇中好，干燥過(guò)程中氯仿較異丙醇揮發(fā)速度快，從而驅(qū)動(dòng)量子點(diǎn)從溶液擴(kuò)散到微球內(nèi)部，溶劑完全揮發(fā)后得到負(fù)載量子點(diǎn)的熒光編碼微球。調(diào)整微球制備過(guò)程中制孔劑的含量，可以實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)在微球內(nèi)部的均勻分布。

為了避免環(huán)境干擾導(dǎo)致量子點(diǎn)從微球中泄露以及量子點(diǎn)熒光變化，Song等利用自愈合法制備熒光編碼微球[17]。整個(gè)反應(yīng)分為溶脹、升溫、脫溶脹和降溫三部分： 多孔聚苯乙烯微球分散在十六烷中，與量子點(diǎn)的氯仿溶液混合后于50℃攪拌1～2 h溶脹微球；在氬氣氛下逐漸升溫至180℃，升溫階段聚合物分子鏈自發(fā)運(yùn)動(dòng)，微球繼續(xù)溶脹，同時(shí)氯仿蒸發(fā)導(dǎo)致微球內(nèi)外量子點(diǎn)濃度出現(xiàn)差異，量子點(diǎn)更容易滲透進(jìn)微球內(nèi)部。氯仿被除去后，聚合物分子鏈的熱運(yùn)動(dòng)和相互作用導(dǎo)致微球孔隙收縮；隨之迅速降溫，微球脫溶脹，聚合物分子鏈再次被固定，從而將量子點(diǎn)牢固限定在微球內(nèi)部。與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑溶脹法制備的熒光編碼微球相比，自愈合法制備的熒光編碼微球具有較高的量子點(diǎn)負(fù)載量，量子點(diǎn)在微球基質(zhì)內(nèi)分布均勻，同時(shí)避免了量子點(diǎn)的泄露，提高了熒光編碼微球在不同pH條件下的化學(xué)穩(wěn)定性和長(zhǎng)期儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。

3.2 疏水作用結(jié)合

Gao等利用介孔二氧化硅微球和三正辛基氧膦(TOPO)修飾量子點(diǎn)之間的強(qiáng)疏水作用，制備熒光編碼微球[18]，編碼過(guò)程通過(guò)攪拌量子點(diǎn)和微球的混合溶液實(shí)現(xiàn)，對(duì)于32 nm孔徑的微球，編碼過(guò)程只需10 min即可完成。由于介孔微球具有較大的孔徑和比表面積，量子點(diǎn)可以滲透進(jìn)介孔微球內(nèi)部，所以該方法制備的熒光編碼微球比有機(jī)溶劑溶脹法制備的熒光編碼微球亮度要高50～100倍。量子點(diǎn)表面的TOPO與介孔模板分子疏水碳鏈有多重疏水作用，將量子點(diǎn)牢牢固定在介孔通道內(nèi)，防止了量子點(diǎn)的解離或泄露。后來(lái)，該課題組利用類似的原理，制備了聚苯乙烯熒光編碼微球[19]，微球與量子點(diǎn)的結(jié)合快速且定量，上清中幾乎無(wú)殘余量子點(diǎn)存在。多孔微球的熒光亮度和均勻度分別是無(wú)孔微球的1 000倍和5倍。微球分散在水或極性有機(jī)溶劑中無(wú)量子點(diǎn)泄露，7種單色編碼和4種雙色編碼微球混合后，可以通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行區(qū)分。Hu等利用該方法制備量子點(diǎn)摻雜的介孔二氧化硅微球，編碼微球表面結(jié)合聚乙烯醇后包裹二氧化硅殼層[20]。二氧化硅包裹后的熒光編碼微球具有非常高的穩(wěn)定性，避免了溶劑(氯仿)誘導(dǎo)的量子點(diǎn)泄露和化學(xué)誘導(dǎo)的熒光猝滅。

3.3 層-層自組裝法

利用聚電解質(zhì)和相反電性量子點(diǎn)間的靜電吸附作用，可以實(shí)現(xiàn)聚電解質(zhì)和量子點(diǎn)在微球表面的交替結(jié)合。調(diào)整聚電解質(zhì)和量子點(diǎn)結(jié)合的層數(shù)，可以控制微球表面負(fù)載的量子點(diǎn)數(shù)量[21]。Sukhanova等利用層-層自組裝法，將3種不同發(fā)射光譜的量子點(diǎn)分別組裝在三聚氰胺-甲醛樹(shù)脂微球表面，利用量子點(diǎn)與報(bào)告分子熒光之間的共振能量轉(zhuǎn)移作用，成功實(shí)現(xiàn)了3種目標(biāo)分子的檢測(cè)[22]。Allen等先利用季胺化的苯乙烯-氯甲基苯乙烯共聚物，將疏水性量子點(diǎn)從氯仿轉(zhuǎn)移到水相，并使量子點(diǎn)帶有正電性，之后將量子點(diǎn)通過(guò)層-層自組裝法組裝在二氧化硅微球表面，制備熒光編碼微球[23]。Schnackel等將異硫氰酸熒光素標(biāo)記的聚烯丙基胺鹽酸鹽(FITC-PAH)和相反電性的聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)交替組裝在二氧化硅微球表面[24]，微球的熒光強(qiáng)度可以通過(guò)FITC-PAH熒光層的層數(shù)以及未做熒光標(biāo)記的PAH和FITC-PAH之間的比例進(jìn)行調(diào)整。

3.4 表面交聯(lián)法

為了實(shí)現(xiàn)微球表面的固相引物合成，Nanthakumar等利用高度交聯(lián)、非溶脹的聚苯乙烯微球，通過(guò)在微球表面共價(jià)交聯(lián)BODIPY染料分子，實(shí)現(xiàn)熒光編碼寡核苷酸合成載體的制備[25]。微球表面交聯(lián)的染料數(shù)量由染料的濃度決定，利用濃度逐級(jí)稀釋(10倍)的染料溶液，得到4種強(qiáng)度的熒光編碼。Kozak等在有機(jī)硅微球表面共價(jià)交聯(lián)熒光染料Atto-Tech 550和620[26]，通過(guò)改變兩種染料的濃度獲得了41種熒光編碼微球，并通過(guò)表面引發(fā)的可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)，在微球表面生成了一層蛋白質(zhì)抵抗聚合物層，減少了97%的非特異性蛋白質(zhì)吸附。

3.5 包埋法

3.5.1 有機(jī)染料編碼

Zhang等利用單分散聚苯乙烯微球進(jìn)行種子聚合[27]，羅丹明6G(R6G)染料在聚合過(guò)程中被包裹在殼層內(nèi)。調(diào)整染料的濃度可以準(zhǔn)確控制微球的熒光強(qiáng)度，制備了12種不同熒光強(qiáng)度的熒光編碼微球。Liu等首先制備了烯丙基化的羅丹明B、熒光素和尼羅紅，然后將染料與苯乙烯單體等混合，通過(guò)分散聚合制備了3種熒光編碼微球，染料分子共聚在微球內(nèi)部[28]。該課題組還利用吸附法制備了2種熒光編碼微球，微球分散良好，具有較高的熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性。

Wu等通過(guò)有機(jī)溶膠-凝膠法，制備熒光編碼三聚氰胺-甲醛樹(shù)脂微球(見(jiàn)圖3)[29]。染料分子首先與樹(shù)枝狀的三聚氰胺-甲醛預(yù)聚物分子結(jié)合，在預(yù)聚物進(jìn)一步反應(yīng)生成微球的同時(shí)，將染料分子包裹在微球內(nèi)部。該方法對(duì)多種染料都有很高的包裹率，微球具有較高的熱和機(jī)械穩(wěn)定性，保存過(guò)程中幾乎無(wú)染料分子泄露。利用2種(每種染料5個(gè)濃度梯度)和3種染料(每種染料3個(gè)濃度梯度)，分別制備了25種和27種熒光編碼微球。利用染料間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用，可以實(shí)現(xiàn)多種激發(fā)波長(zhǎng)染料的單一波長(zhǎng)激發(fā)。

圖3 有機(jī)溶膠-凝膠法制備熒光編碼微球[29]Fig.3 Schematic illustration of encoding microspheres prepared by the organic Sol-Gel doping mechanism[29]

3.5.2 量子點(diǎn)編碼

Vaidya等在懸浮聚合過(guò)程中，將量子點(diǎn)包裹在聚苯乙烯微球內(nèi)部，調(diào)整量子點(diǎn)的顏色和數(shù)量，實(shí)現(xiàn)熒光編碼微球的制備[30]。激光共聚焦顯微鏡分析證明，量子點(diǎn)在微球內(nèi)部呈多個(gè)團(tuán)聚體分布，微球的發(fā)射光譜與非聚集態(tài)量子點(diǎn)相比沒(méi)有發(fā)生位移。由于團(tuán)聚體內(nèi)量子點(diǎn)間距離較近，不同發(fā)射波長(zhǎng)量子點(diǎn)間發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移，改變了不同發(fā)射波長(zhǎng)的相對(duì)熒光強(qiáng)度，不過(guò)這種能量轉(zhuǎn)移作用沒(méi)有改變編碼光譜的唯一性。利用一種染料作為內(nèi)參比的比色式編碼，可以消除微球粒徑對(duì)編碼的影響。Yang等利用可聚合的表面活性劑作為乳化劑和相轉(zhuǎn)移劑，通過(guò)改進(jìn)的細(xì)乳液聚合，將3-巰基丙酸修飾的CdTe量子點(diǎn)均勻包裹在聚苯乙烯微球內(nèi)部[31]。聚苯乙烯具有致密結(jié)構(gòu)和疏水特性，使得微球的熒光幾乎不受pH的影響?？删酆系谋砻婊钚詣┡c聚合物骨架之間的共價(jià)鍵，使量子點(diǎn)被牢固固定在微球內(nèi)部，因此微球具有優(yōu)異的抗溶劑特性。

Chan等以單分散二氧化硅微球?yàn)楹?，表面包裹摻雜量子點(diǎn)的二氧化硅殼層，實(shí)現(xiàn)熒光編碼微球的制備[32]。利用5-氨基-正戊醇(AP)和3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)，通過(guò)鏈交換作用取代量子點(diǎn)表面結(jié)合的TOPO，AP的羥基基團(tuán)增加了量子點(diǎn)在乙醇中的分散性，APTMS則與二氧化硅基質(zhì)反應(yīng)生成硅氧鍵，將量子點(diǎn)牢固地固定在微球基質(zhì)內(nèi)。編碼微球的單分散性取決于內(nèi)部的二氧化硅微球，因此不受編碼過(guò)程的影響。Graf等將聚乙烯吡咯烷酮修飾的量子點(diǎn)吸附到氨基功能化的二氧化硅微球表面，在微球表面包裹二氧化硅殼層，將量子點(diǎn)固定在微球內(nèi)部[33]。

3.6 刺激響應(yīng)性水凝膠

Kuang等利用N-異丙基丙烯酰胺和4-乙烯基吡啶共聚物(PNIPVP)水凝膠的pH響應(yīng)性，在酸性條件下將溶脹的凝膠微球與水溶性量子點(diǎn)孵育，微球經(jīng)離心分離后分散在pH=7的水溶液中，凝膠網(wǎng)絡(luò)收縮將量子點(diǎn)包裹在微球內(nèi)部(見(jiàn)圖4)；量子點(diǎn)在微球內(nèi)均勻分布，將不同種類量子點(diǎn)按照不同比例包裹在凝膠微球內(nèi)，可以獲得不同熒光編碼的凝膠微球[34]。該課題組還利用溫度響應(yīng)性水凝膠微球制備量子點(diǎn)熒光編碼微球，特別是凝膠結(jié)構(gòu)的溫度響應(yīng)性使內(nèi)部量子點(diǎn)之間的距離可以通過(guò)溫度進(jìn)行調(diào)整，進(jìn)而控制量子點(diǎn)之間共振能量的轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)溫度響應(yīng)性的熒光發(fā)射[35]。

圖4 pH響應(yīng)性水凝膠負(fù)載量子點(diǎn)制備熒光編碼微球及pH響應(yīng)性量子點(diǎn)釋放[34]Fig.4 Schematic illustration of the loading of quntum dots in spheres and their controlled release by pH[34]

3.7 膜乳化法

近紅外光與生物分子的作用較弱，因而背景干擾較小。然而，通常報(bào)道的近紅外量子點(diǎn)都具有較寬的發(fā)射光譜，因此當(dāng)使用兩種或以上發(fā)射波長(zhǎng)編碼時(shí)會(huì)出現(xiàn)光譜重疊現(xiàn)象。Wang等利用單波長(zhǎng)編碼策略，解決光譜重疊的問(wèn)題(見(jiàn)圖5)[36]。3種近紅外量子點(diǎn)的發(fā)射光譜均涵蓋流式細(xì)胞儀的FL4和FL5檢測(cè)通道，但是在兩個(gè)通道的強(qiáng)度比例不同，因而可以通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行區(qū)分。疏水性CdSeTe/CdS/ZnS量子點(diǎn)與聚合物分子溶解在甲苯中作為分散相，含有十二烷基磺酸鈉的水溶液作為連續(xù)相，分散相在氮?dú)鈮毫ο峦ㄟ^(guò)Shirasu介孔膜生成水包油的液滴，甲苯從液滴中蒸發(fā)后聚合物固化生成微球，將量子點(diǎn)包裹在微球內(nèi)部，得到高亮度的熒光編碼微球。量子點(diǎn)在整個(gè)微球內(nèi)部均勻分布，微球具有較好的熒光穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。3種量子點(diǎn)分別設(shè)置4個(gè)濃度梯度，制備得到了12種不同的熒光編碼微球。

圖5 單波長(zhǎng)編碼制備熒光編碼微球[36]。(a)不同量子點(diǎn)編碼微球在FL4、FL5檢測(cè)通道內(nèi)的分布比例不同；(b)3種量子點(diǎn)濃度梯度編碼微球；(c)編碼微球的流式細(xì)胞儀分析Fig.5 Microspheres encoded by “single wavelength” method.[36] (a) The relationship between the photoluminescence peak wavelength of microspheres and FL4, FL5 fluorescent detection channels of Beckman Coulter FC 500 flow cytometer；(b) Schematic of the relationship of the different barcodes corresponding to FL4 and FL5 fluorescence detection channels of flow cytometer；(c) Fluorescence barcodes matrices of encoding microspheres on flow cytometric FL5-FL4 plot diagram

3.8 微流控技術(shù)

微流控技術(shù)為納米材料的制備開(kāi)辟了新的途徑[37]，在熒光編碼微球領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。Gerver等[38]利用全自動(dòng)的微流控器件，制備了鑭系納米熒光材料編碼的親水性聚合物微球。鑭系納米熒光材料、聚乙二醇雙丙烯酸酯和光引發(fā)劑等溶解在甲醇中作為分散相，在流體通道內(nèi)生成液滴，再經(jīng)紫外線照射引發(fā)液滴內(nèi)聚合反應(yīng)，就得到熒光編碼微球。鑭系納米熒光材料由于Laporte限制的f-f能級(jí)階躍具有窄的發(fā)射峰，通用的主體基質(zhì)使多種鑭系金屬可以通過(guò)同一波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā)，并且熒光穩(wěn)定性好，無(wú)熒光重吸收現(xiàn)象。固定YVO4:Eu的濃度作為內(nèi)參比，改變YVO4:Dy和YVO4:Sm的濃度，制備了24種不同的編碼微球，同種編碼微球之間編碼差別小于3%，不同編碼之間可以相互區(qū)分，誤差率小于1‰。

Fournier-Bidoz等利用濃度調(diào)節(jié)的流動(dòng)聚焦微流控技術(shù)，制備量子點(diǎn)編碼熒光微球，含有量子點(diǎn)和苯乙烯-馬來(lái)酸酐共聚物的氯仿溶液在流體通道內(nèi)生成液滴，氯仿擴(kuò)散入水溶液后，聚合物固化生成熒光編碼微球。通過(guò)調(diào)整量子點(diǎn)的種類和濃度，制備了105種不同的熒光編碼微球。聚合物分子中的馬來(lái)酸酐遇水后水解生成兩個(gè)羧基，賦予微球表面負(fù)電荷，使微球穩(wěn)定分散并方便后續(xù)生物探針的共價(jià)交聯(lián)。利用過(guò)濾器和閥門(mén)的組合，可以將反應(yīng)產(chǎn)物中的水移除，使反應(yīng)可以持續(xù)進(jìn)行[39]。

Ji等利用微流控技術(shù)，制備量子點(diǎn)編碼的海藻酸鈣微球，含有量子點(diǎn)、海藻酸鈉的液滴與連續(xù)流動(dòng)相中的鈣離子作用，生成包裹量子點(diǎn)的海藻酸鈣凝膠微球。利用金字塔狀的微流體網(wǎng)絡(luò)，可以實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)逐級(jí)濃度梯度的自動(dòng)化，無(wú)需預(yù)先制備不同濃度和比率的量子點(diǎn)溶液，不同編碼的微球可以同時(shí)生成[40]。

Chen等利用毛細(xì)管微流控技術(shù)，制備水凝膠殼層保護(hù)的核-殼式熒光編碼微球，水凝膠殼層的保護(hù)避免了量子點(diǎn)的泄露，增加了熒光穩(wěn)定性。利用多個(gè)內(nèi)部分散相毛細(xì)管，制備含有多個(gè)內(nèi)部液滴的油/水/油雙乳液為模板，不同種類量子點(diǎn)分散在不同的內(nèi)部液滴中，液滴經(jīng)紫外誘導(dǎo)聚合轉(zhuǎn)變?yōu)榫酆衔镂⑶?，制備得到結(jié)構(gòu)不對(duì)稱的多核心熒光編碼微球。由于不同種類量子點(diǎn)相互之間沒(méi)有干擾，每種量子點(diǎn)的光譜可以被分別記錄，無(wú)需對(duì)不同顏色量子點(diǎn)的熒光進(jìn)行區(qū)分和反褶積計(jì)算[41]。

熒光編碼微球的制備方法各自有其優(yōu)勢(shì)和不足，如表1所示。

表1 熒光編碼微球制備方法對(duì)比Tab.1 Comparison of different preparation methods for fluorescence-encoded microspheres

4 與其他功能復(fù)合

4.1 熒光編碼-反射光譜編碼

利用熒光強(qiáng)度進(jìn)行編碼的方式對(duì)微球粒徑的均一性和編碼過(guò)程的可控性具有非常高的要求，同時(shí)要求編碼微球具有較高的熒光穩(wěn)定性。光子晶體反射編碼利用載體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的獨(dú)特反射光譜進(jìn)行編碼，編碼穩(wěn)定性好[42-44]，不足之處在于反射峰的位置通常需要位于紫外-可見(jiàn)光區(qū)域，因此限制了編碼的容量。為了增加編碼容量，Li等通過(guò)層-層自組裝法，將CdTe量子點(diǎn)組裝在光子晶體編碼的二氧化硅膠體晶體微球(SCCBs)表面(見(jiàn)圖6)，實(shí)現(xiàn)熒光和光子晶體反射光譜的復(fù)合編碼[45-46]。由于兩種光譜的產(chǎn)生原理完全不同，因此兩種光譜編碼相互之間沒(méi)有干擾。編碼只依賴熒光發(fā)射峰和光子晶體反射峰的位置，不依賴熒光強(qiáng)度，因此編碼具有較高的穩(wěn)定性。

圖6 熒光編碼-反射光譜復(fù)合編碼[45]Fig.6 Schematic illustration of encoding microspheres with combination of fluorescence and reflectance spectrum[45]

4.2 熒光編碼-熒光壽命編碼

同樣，為了克服熒光強(qiáng)度編碼的缺陷，Chen等利用晶格畸變和摻雜，制備近紅外熒光發(fā)射(700～910 nm)和長(zhǎng)熒光壽命(約1 μs)的CdTe/CdS:Cu量子點(diǎn)，并利用量子點(diǎn)的多色發(fā)射和熒光壽命制備二維編碼微球[47]。

4.3 熒光編碼-前向散射編碼

Wang等利用膜乳化法制備包裹CdSe/CdS/ZnS量子點(diǎn)的熒光編碼微球，微球的粒徑可以通過(guò)Shirasu介孔膜的孔徑進(jìn)行調(diào)節(jié)，不同粒徑的微球可以通過(guò)流式細(xì)胞儀的前向散射信號(hào)進(jìn)行區(qū)分，實(shí)現(xiàn)熒光編碼和前向散射編碼的復(fù)合[48]。

4.4 磁性-熒光編碼微球

在懸浮芯片分析中，熒光編碼微球需要經(jīng)過(guò)多次的分離和清洗操作，如果在熒光編碼的基礎(chǔ)上引入磁性功能，制備磁性-熒光編碼雙功能微球，通過(guò)外加磁場(chǎng)可以大大簡(jiǎn)化微球的分離操作，降低分析過(guò)程的人力成本和時(shí)間成本。目前已有多篇磁性-熒光編碼微球的報(bào)道，如Li等利用有機(jī)溶劑溶脹和高溫溶脹法，依次將四氧化三鐵納米顆粒和量子點(diǎn)包裹在微球內(nèi)部，制備磁性-熒光編碼微球[49]；Sathe等將疏水性量子點(diǎn)和四氧化三鐵納米顆粒通過(guò)疏水作用，組裝在介孔二氧化硅內(nèi)部孔道內(nèi)[50]；Wilson等[51-52]通過(guò)層-層自組裝法，將量子點(diǎn)組裝在商品化Dynal磁性微球表面，制備不同熒光編碼的磁性-熒光編碼微球；Insin等在二氧化硅微球表面同時(shí)包裹γ-Fe2O3納米顆粒和CdSe/CdZnS量子點(diǎn)，制備磁性-熒光編碼微球[53]；Li等在熒光編碼微球制備基礎(chǔ)上，通過(guò)在磁性微球表面包裹染料摻雜的三聚氰胺-甲醛樹(shù)脂殼層，得到核-殼式磁性-熒光編碼微球，在高溫煅燒除去熒光殼層的磁性微球表面重新包裹熒光殼層，實(shí)現(xiàn)磁性-熒光編碼微球的再生利用[54]；Wang等將含有量子點(diǎn)、磁性納米顆粒和聚苯乙烯-順丁烯二酸酐的甲苯溶液作為分散相，利用膜乳化法制備磁性-熒光編碼微球[55]；Zhao等利用毛細(xì)管微流控生成的油/水/油雙乳液液滴，制備量子點(diǎn)編碼顆粒，并通過(guò)流速和相組分的調(diào)節(jié)，制備內(nèi)部含有獨(dú)立熒光編碼核和磁性核或者含有一個(gè)不對(duì)稱結(jié)構(gòu)Janus核的磁性-熒光編碼微球[56]；Gao等將制備量子點(diǎn)熒光編碼微球的濃度調(diào)節(jié)流動(dòng)聚焦技術(shù)擴(kuò)展到磁性-熒光編碼微球的制備，并利用簡(jiǎn)單的芯片設(shè)計(jì)，通過(guò)外加磁場(chǎng)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)過(guò)程的自動(dòng)化[57]。

5 總結(jié)與展望

懸浮芯片技術(shù)因具有多功能性、高靈活性等優(yōu)勢(shì)，在生物醫(yī)學(xué)和分析領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。作為懸浮芯片的分析載體，熒光編碼微球的制備研究取得了一系列進(jìn)展，涌現(xiàn)了多種多樣的制備方法，包括有機(jī)溶劑溶脹法、層-層自組裝法、包埋法、微流控技術(shù)、膜乳化法等，并有多個(gè)商業(yè)化產(chǎn)品和配套檢測(cè)儀器可供用戶選擇。隨著納米技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，未來(lái)有望出現(xiàn)更多新型制備方法，進(jìn)一步優(yōu)化熒光編碼微球的制備和使用。

目前，限制熒光編碼容量的主要因素在于不同熒光發(fā)射光譜之間重疊，減少了可供選擇的編碼波長(zhǎng)數(shù)量，同時(shí)增加了編碼和解碼的復(fù)雜性。為了提高編碼容量，一方面可以通過(guò)研發(fā)新型窄發(fā)射光譜的染料或熒光納米顆粒，增加編碼波長(zhǎng)的可選擇數(shù)量，另一方面可以將熒光編碼與其他編碼方式復(fù)合，如之前提到的熒光編碼與反射光譜編碼、熒光編碼與熒光壽命編碼的復(fù)合等。需要注意的是，多種編碼方式復(fù)合在提高編碼容量的同時(shí)，可能會(huì)增加分析儀器的復(fù)雜性和檢測(cè)的耗時(shí)，因此不能單純地將多種編碼方式進(jìn)行雜合。

未來(lái)生物分析技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)是集成化、自動(dòng)化和高通量化，熒光編碼微球有望與微流控技術(shù)結(jié)合，將樣品混合、分離純化和檢測(cè)分析功能高度集成到一個(gè)微流控芯片上完成，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)過(guò)程的自動(dòng)化和通量化，降低分析檢測(cè)設(shè)備的復(fù)雜性和分析成本，有效促進(jìn)即時(shí)檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展和應(yīng)用。

綜上所述，隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展、新型熒光材料合成和納米材料加工技術(shù)的不斷進(jìn)步，將有望克服目前熒光編碼微球面臨的局限，提高熒光編碼微球的編碼容量和微球質(zhì)量，簡(jiǎn)化懸浮芯片分析設(shè)備復(fù)雜性，進(jìn)一步擴(kuò)展懸浮芯片技術(shù)在臨床診斷、藥物篩選、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域的應(yīng)用。

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Progress in the Preparation of Fluorescence-Encoded Microspheres

Li Yan1Luo Cheng1*Wu Daocheng2

1(SchoolofMedicine,YichunUniversity,Yichun336000,Jiangxi,China)2(KeyLaboratoryofBiomedicalInformationEngineeringofEducationMinistry,SchoolofLifeScienceandTechnology,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710049,China)

Suspension array is a promising platform for multiplex analyses with broad applications in science research and clinical diagnosis. As one of the key components for the suspension array, fluorescence-encoded microspheres have received much attention and a lot of achievements have been made. In this review, the analysis pattern and applications of suspension array were introduced, and recent advances in the fluorescence-encoded microspheres were summarized according to the classification of preparation methods including swelling method, layer-by-layer (LBL) self-assembly, embedding in microspheres, microfluidic techniques and membrane emulsification. Current challenges and future directions of fluorescence-encoded microspheres were also outlined.

suspension array; microspheres; fluorescence-encoding; quantum dots

10.3969/j.issn.0258-8021. 2017. 02.013

2016-07-20， 錄用日期:2016-09-24

國(guó)家自然科學(xué)基金(81471771)；江西省自然科學(xué)基金(20161BAB215196)

R318

A

0258-8021(2017) 02-0219-09

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: luocheng999@163.com