胡蘿卜回交漸滲系表型遺傳變異研究

孫婷婷曹文姬歐承剛劉 波趙志偉莊飛云*

（1農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2甘肅省酒泉市種子管理站，甘肅酒泉735000）

胡蘿卜回交漸滲系表型遺傳變異研究

孫婷婷1曹文姬2歐承剛1劉 波1趙志偉1莊飛云1*

（1農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2甘肅省酒泉市種子管理站，甘肅酒泉735000）

以野生胡蘿卜品種松滋野生（Ws）和歐洲橘色栽培品種Amsterdam（Af）為親本構(gòu)建的223個(gè)回交漸滲系為試材，深入分析Ws染色體片段在回交漸滲系后代中的遺傳表現(xiàn)。通過(guò)兩年對(duì)12個(gè)農(nóng)藝性狀的調(diào)查，結(jié)果表明，葉片質(zhì)量、根質(zhì) 量、根肩寬、根中寬、根尖寬、綠肩、干物質(zhì)含量、單株質(zhì)量、葉片質(zhì)量/根質(zhì)量、根中寬/根長(zhǎng)在兩年間呈極顯著差異，2014年和2015年前4個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率分別達(dá)到80.36%和83.28%。相關(guān)性分析結(jié)果表明，根質(zhì)量和單株質(zhì)量均與其他性狀呈極顯著或顯著相關(guān)；而干物質(zhì)含量除了與葉片質(zhì)量/根質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)外，與根質(zhì)量、根肩寬、根中寬、根尖寬、單株質(zhì)量、根中寬/根長(zhǎng)均呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)?；蛐头治雠c聚類結(jié)果表明Ws染色體被隨機(jī)導(dǎo)入了Af中。

胡蘿卜；回交漸滲系；表型遺傳

目前關(guān)于胡蘿卜遺傳圖譜構(gòu)建及農(nóng)藝性狀的遺傳定位主要采用F2群體，大多圍繞根色、類胡蘿卜素合成（Just et al.，2007；歐承剛 等，2010）、雄性不育（Alessandro et al.，2013）、花青素（Yildiz et al.，2013）等進(jìn)行研究，而關(guān)于肉質(zhì)根的遺傳研究非常薄弱。Nie等（2015）利用54個(gè)棉花回交漸滲系（backcrossing introgression lines，BILs）定位了58個(gè)與纖維性狀、田間農(nóng)藝性狀相關(guān)的位點(diǎn)。Thomson等（2003）利用水稻野生種與栽培種構(gòu)建的漸滲系將與馴化過(guò)程相關(guān)的株高、分蘗型、芒長(zhǎng)性狀定位到了1號(hào)和4號(hào)染色體上。本試驗(yàn)以胡蘿卜野生種松滋野生（Ws）為供體，以歐洲橘色栽培品種Amsterdam（Af）為受體構(gòu)建了一套BILs，初步對(duì)胡蘿卜葉和根相關(guān)農(nóng)藝性狀遺傳變異進(jìn)行調(diào)查，以期為胡蘿卜農(nóng)藝性狀的遺傳定位研究提供重要數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以白色木質(zhì)化的胡蘿卜野生種松滋野生（Ws）和歐洲橘色栽培品種Amsterdam（Af）為親本進(jìn)行雜交，并以Af為輪回親本，連續(xù)回交2代獲得BC2，再單株自交6代得到回交漸滲系（BC2S6），群體大小為223個(gè)株系，分別于2014年和2015年的8月上旬在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所南口農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行露地播種，每個(gè)株系種植80～130株，常規(guī)管理。同年10月初，每個(gè)株系隨機(jī)選取5株鮮葉，液氮速凍，置于-80℃超低溫冰箱中貯存待用。

1.2田間農(nóng)藝性狀調(diào)查及數(shù)據(jù)分析

2014年和2015年分別于播種后110 d，每個(gè)BILs株系隨機(jī)選取3～5株，3次重復(fù)。測(cè)量最大葉長(zhǎng)、葉片質(zhì)量、根長(zhǎng)、根質(zhì)量、根肩寬、根中寬、根尖寬、綠肩、干物質(zhì)含量、單株質(zhì)量，并計(jì)算葉片質(zhì)量/根質(zhì)量、根中寬/根長(zhǎng)，具體測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)參照胡蘿卜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)（莊飛云和朱德蔚，2007）。利用SPSS 19.0軟件計(jì)算數(shù)據(jù)平均值、標(biāo)準(zhǔn)誤，采用D檢驗(yàn)方法檢測(cè)正態(tài)分布，采用ANOVA軟件的Duncan法對(duì)各性狀進(jìn)行方差分析，采用雙側(cè)檢驗(yàn)法分析各農(nóng)藝性狀間的相關(guān)性，采用因子分析法進(jìn)行主成分分析，參照馬振國(guó)等（2015）的方法計(jì)算農(nóng)藝性狀多樣性指數(shù)（H’）。

1.3回交漸滲系與親本間的親緣關(guān)系分析

在經(jīng)典車的大范疇里，沃爾沃是個(gè)絕不能被忽視的汽車品牌。和二戰(zhàn)后的法拉利經(jīng)典車習(xí)慣用拍賣市場(chǎng)的成交價(jià)彰顯身份不同，沃爾沃經(jīng)典車的粉絲們總習(xí)慣用沃爾沃救自己的次數(shù)或者難以被超越的總行駛里程數(shù)來(lái)告訴周遭的人們，他們究竟有多愛(ài)自己的沃爾沃。

從223份BILs中隨機(jī)選取110份材料，以及親本W(wǎng)s和Af，參照Briard等（2000）的CTAB法提取DNA，由北京百邁客生物科技公司在Illumina HiSeq 2500平臺(tái)上進(jìn)行基因組重測(cè)序。親本Af共得到5.6 Gbp的clean堿基，平均深度7.0×；親本W(wǎng)s共得到5.6 Gbp的clean堿基，平均深度7.0×；110個(gè)子代總數(shù)據(jù)量為77.51 Gbp，平均深度1.5×，Q30＞85%。參照胡蘿卜基因組數(shù)據(jù)（Xu et al.，2014），采用BWA軟件進(jìn)行序列比對(duì)，并采用GATK（Genome Analysis Toolkit）軟件檢測(cè)SNP。選取1 976個(gè)具有多態(tài)性的SNP標(biāo)記，根據(jù)標(biāo)記分型計(jì)算親本分型占群體基因分型的覆蓋率。利用PowerMarker v3.25軟件（Liu & Muse，2005）的UPGMA方法進(jìn)行聚類，采用MEGA5軟件（Tamura et al.，2011）顯示結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1胡蘿卜BILs 12個(gè)主要農(nóng)藝性狀的表型分析

從圖1和表1可以看出，最大葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)、根質(zhì)量、根肩寬、單株質(zhì)量、根中寬/根長(zhǎng)在兩年間均符合正態(tài)分布。除最大葉長(zhǎng)與根長(zhǎng)外，葉片質(zhì)量、根質(zhì)量、根肩寬、根中寬、根尖寬、干物質(zhì)含量、綠肩、單株質(zhì)量、葉片質(zhì)量/根質(zhì)量、根中寬/根長(zhǎng)在兩年間呈極顯著差異水平，其中葉片質(zhì)量、根質(zhì)量和單株質(zhì)量2015年最大值分別為2014年的2.2、1.8和1.9倍。除綠肩、干物質(zhì)含量、葉片質(zhì)量/根質(zhì)量外，其他性狀的多樣性指數(shù)在兩年間基本一致。

2.2胡蘿卜BILs 12個(gè)主要農(nóng)藝性狀的主成分分析

從表2可以看出，2014年和2015年12個(gè)性狀的前4個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率分別達(dá)到80.36%和83.28%，其中根質(zhì)量、根肩寬、根中寬、單株質(zhì)量均在第1主成分中。

2.3胡蘿卜BILs 12個(gè)主要農(nóng)藝性狀的相關(guān)性分析

從表3可以看出，各性狀之間的相關(guān)性很強(qiáng)，其中根質(zhì)量和單株質(zhì)量在兩年間與干物質(zhì)含量、葉片質(zhì)量/根質(zhì)量均呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)，而與其他性狀均呈極顯著或顯著正相關(guān)。根肩寬、根中寬、根尖寬在兩年間均呈極顯著正相關(guān)，并且根肩寬和根中寬之間的相關(guān)系數(shù)明顯高于根肩寬和根尖寬之間的相關(guān)系數(shù)，說(shuō)明胡蘿卜肉質(zhì)根的根肩部和中部的膨大同步性較強(qiáng)。干物質(zhì)含量?jī)赡觊g除了與葉片質(zhì)量/根質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)外，與根質(zhì)量、根肩寬、根中寬、根尖寬、單株質(zhì)量、根中寬/根長(zhǎng)均呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明肉質(zhì)根膨大速度越快，干物質(zhì)含量積累越低。

表1胡蘿卜BILs群體12個(gè)主要農(nóng)藝性狀遺傳變異和方差分析

圖1胡蘿卜BILs群體12個(gè)主要農(nóng)藝性狀頻次分布與正態(tài)分布

2.4胡蘿卜BILs 12個(gè)主要農(nóng)藝性狀的親緣關(guān)系分析

從圖2可以看出，110個(gè)BILs株系中，親本Af基因型覆蓋率為60.93%～98.56%，均值為88.18%；Ws基因型覆蓋率為1.38%～38.34%，均值為11.34%；雜合型覆蓋率為0～1.95%，均值為0.48%。說(shuō)明親本分型在群體株系間所占的基因型覆蓋率存在明顯差異。從圖3可以看出，供體野生種Ws位于群體最外圍，受體栽培種Af位于最內(nèi)側(cè)，BILs之間呈梯度型聚類分布，說(shuō)明Ws染色體通過(guò)多代回交和自交被隨機(jī)導(dǎo)入了Af中。與野生種Ws親緣關(guān)系最近的為E5401、E5506、E5003、E52015 4個(gè)株系，并且這4個(gè)BILs株系的根形根色存在較大差異，其中E5401為橘色錐形，E5506和E5003為黃色錐形，E52015則為黃色柱錐形。與栽培種Af親緣關(guān)系最近的為E2903，根色根形與Af相似。

表2胡蘿卜BILs群體12個(gè)主要農(nóng)藝性狀的主成分分析

表3胡蘿卜BILs群體12個(gè)主要農(nóng)藝性狀的相關(guān)性分析

圖2胡蘿卜BILs群體親本與110個(gè)株系基因型分析

圖3胡蘿卜BILs群體的UPGMA聚類分析

3 結(jié)論與討論

將野生種染色體片段導(dǎo)入到栽培種中培育漸滲系，可在單一遺傳背景下進(jìn)行基因定位和挖掘。水稻野生種O. ruf i pogon與栽培種Jefferson通過(guò)2次回交構(gòu)建258個(gè)漸滲系，將與水稻馴化過(guò)程直接相關(guān)的株高、分蘗型、芒長(zhǎng)性狀定位到了1號(hào)和4號(hào)染色體上（Thomson et al.，2003）。邱樹(shù)亮等（2011）以鮮食栽培番茄1052和野生潘那利番茄LA0716為材料，通過(guò)1次雜交、5次回交、5次苗期分子標(biāo)記輔助選擇構(gòu)建的潘那利番茄漸滲系群體，將6個(gè)果實(shí)差異性狀定位到植株共同含有的染色體區(qū)段上，大大提高了定位的準(zhǔn)確度。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)兩年223個(gè)胡蘿卜BILs的12個(gè)性狀方差分析表明，葉片質(zhì)量、根質(zhì)量、根肩寬、根中寬、根尖寬、綠肩、干物質(zhì)含量、單株質(zhì)量、葉片質(zhì)量/根質(zhì)量、根中寬/根長(zhǎng)在兩年間呈極顯著差異，受環(huán)境影響較大。主成分分析表明，2014年和2015年的前4個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率分別達(dá)到80.36%和83.28%，其中兩年第1主成分中均包含根質(zhì)量、根肩寬、根中寬、單株質(zhì)量等4個(gè)根部性狀。最大葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)、根中寬多樣性指數(shù)在兩年間基本一致，介于1.77～1.79間，略低于我國(guó)地方資源多樣性指數(shù)（馬振國(guó) 等，2015），表明本試驗(yàn)的漸滲系群體變異較大，部分性狀的變異系數(shù)達(dá)到30%以上。相關(guān)性分析表明，胡蘿卜干物質(zhì)含量與根質(zhì)量、根肩寬、根中寬、根尖寬、單株質(zhì)量、根中寬/根長(zhǎng)均呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明肉質(zhì)根膨大速度越快，干物質(zhì)含量積累越低。Hole等（1984）的研究也表明胡蘿卜干物質(zhì)積累量隨肉質(zhì)根膨大而增多，但干物質(zhì)含量隨肉質(zhì)根膨大期間水分的增加而減少?；蛐头治雠c聚類結(jié)果表明，胡蘿卜親本分型在群體株系間所占的基因型覆蓋率存在明顯差異，Ws染色體被隨機(jī)導(dǎo)入了Af中，與Rong等（2014）得出的胡蘿卜栽培種遺傳多樣性與馴化過(guò)程中野生片段導(dǎo)入有關(guān)觀點(diǎn)一致。下一步將針對(duì)胡蘿卜BILs群體性狀的遺傳特點(diǎn)，利用BILs群體進(jìn)行肉質(zhì)根相關(guān)性狀的QTL定位。

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Studies on Phenotypic Genetic Variation of Carrot Backcrossing Introgression Line

SUN Ting-ting1，CAO Wen-ji2，OU Cheng-gang1，LIU Bo1，ZHAO Zhi-wei1，ZHUANG Fei-yun1*

（1InstituteofVegetablesandFlowers，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100081，China；2JiuquanCitySeedManagementStationofGansuProvince，Jiuquan735000，Gansu，China）

Taking 223 backcrossing introgression lines（BILs）developed from crossing wild species ‘Songzi’（Ws）and European orange cultivar ‘Amsterdam’（Af）as experimental material，this paper analyzed thoroughly the genetic expression of Ws chromosome fragments in progeny. Through 2 years investigation on 12 agronomic characteristics，we got the results showing that there were significant differences in leaf weight，root weight，root shoulder width，root middle width，root tip width，green shoulder，dry matter content，single plant weight，leaf weight/root weight，and root middle width/root length during these 2 years，and the top 4 principal components could reach 80.36% and 83.28%，respectively. Correlation analysis showed that there were extremely significant or significant correlation between root weight，single plant weight with the other traits，while there were extremely significant or significant negative correlation between dry matter content with root weight，root shoulder width，root middle width，root tip width，single plant weight，and root middle width/root length，and there were extremely significant positive correlation between dry matter content with leaf weight/root weight. The genotyping and cluster analysis indicated that Ws chromosome fragments were randomly introgressed into Af.

Carrot；Backcrossing introgression line；Phenotypic genetic

孫婷婷，女，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：453432783@qq.com

*通訊作者（Corresponding author）：莊飛云，男，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：zhuangfeiyun@caas.cn

2016-12-08；接受日期：2017-03-08

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD01B04），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272162），中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項(xiàng)目