兩株芽孢桿菌混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化

王繼雯，岳丹丹，趙俊杰，劉莉，慕琦，李冠杰，甄靜，鞏濤，楊文玲，杜志敏，陳國參*

（1.河南省科學院生物研究所有限責任公司，河南鄭州450008；2.河南省微生物工程重點實驗室，河南鄭州450008）

兩株芽孢桿菌混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化

王繼雯1，2，岳丹丹1，2，趙俊杰1，2，劉莉1，2，慕琦1，李冠杰1，2，甄靜1，2，鞏濤1，2，楊文玲1，2，杜志敏1，2，陳國參1，2*

（1.河南省科學院生物研究所有限責任公司，河南鄭州450008；2.河南省微生物工程重點實驗室，河南鄭州450008）

為了探索地衣芽孢桿菌（Baclicus lincheniformis）DY-1和膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）XK混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢的最佳條件，該研究采用單因素試驗和正交試驗進行了優(yōu)化；利用Eppendorf 7.5 L發(fā)酵罐在最佳條件下進行了混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢試驗。結(jié)果表明，混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢的最佳發(fā)酵條件為：膠凍樣芽孢桿菌XK和地衣芽孢桿菌DY-1種子液的接種比例為4∶1（V/V），培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間60 h，pH 8.0。在此條件下，進行Eppendorf 7.5 L發(fā)酵罐混菌發(fā)酵試驗，其芽孢數(shù)可高達1.1×1011CFU/mL，高于搖瓶發(fā)酵所產(chǎn)芽孢數(shù)（2.0×1010CFU/mL）。

地衣芽孢桿菌混菌發(fā)酵DY-1；膠凍樣芽孢桿菌XK；產(chǎn)芽孢條件；正交試驗

WANG Jiwen1,2,YUE Dandan1,2,ZHAO Junjie1,2,LIU Li1,2,MU Qi1,LI Guanjie1,2,ZHEN Jing1,2,GONG Tao1,2, YANG Wenling1,2,DU Zhimin1,2,CHEN Guocan1,2*
(1.Henan Academy of Sciences Institute of Biology Co.,Ltd.,Zhengzhou 450008,China; 2.Key Laboratory of Microbial Engineering of Henan Province,Zhengzhou 450008,China)

混菌發(fā)酵又稱混合發(fā)酵，指采用兩種或多種微生物的協(xié)同作用共同完成某發(fā)酵過程的一種新型發(fā)酵技術[1]。混菌發(fā)酵是純種發(fā)酵技術的新發(fā)展，也是一種不需要進行復雜的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）體外重組卻可取得類似效果的新型發(fā)酵技術[2]。優(yōu)點是可提高發(fā)酵效率甚至可形成新產(chǎn)品，與單菌株發(fā)酵相比顯著縮短了發(fā)酵時間[3]。在我國現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)中，設計構(gòu)建的指定菌種的多菌種混合發(fā)酵并不多見，但在食品發(fā)酵、環(huán)境保護和能源方面已有了一些研究和應用[3-5]。微生物混菌培養(yǎng)在很多領域中的作用已經(jīng)得到充分肯定，部分成果已成功應用于實踐[6-8]。隨著混菌發(fā)酵在各方面應用研究的深入，在生物菌肥方面混菌發(fā)酵的研究也已成為熱點[9-11]。混菌優(yōu)化培養(yǎng)，不但可以提高發(fā)酵效率，節(jié)約生產(chǎn)成本，而且由它們制得的高密度芽孢菌劑或微生物肥料，應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，可以減少化肥用量，緩解土壤污染，為中國的糧食安全保駕護航。

芽孢是產(chǎn)芽孢細菌在生長過程中形成的一種抗逆休眠體，它的形成受營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境因素等的綜合影響[12]。芽孢最主要的特點就是抗性強，對高溫、紫外線、干燥、電離輻射和很多有毒的化學物質(zhì)都有很強的抗性。自由存在的芽孢沒有明顯的代謝作用，只保持潛在的萌發(fā)力，稱為隱藏的生命。一旦環(huán)境條件合適，芽孢便可以萌發(fā)成營養(yǎng)細胞。一般認為，芽孢是在生長后期、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏時形成的，因而是適應不良環(huán)境的產(chǎn)物。但實際上，可能不完全是如此。有研究人員在培養(yǎng)枯草芽孢桿菌時，曾作過追蹤觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在接芽孢種培養(yǎng)4 h后即有芽孢生成；以后每隔4 h觀察一次，芽孢數(shù)均呈比例增長；至24 h時，約半數(shù)產(chǎn)生芽孢；48 h后，全部變成芽孢，表明在此情形下營養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)向芽孢形成有一定的概率，芽孢開始形成不必等到生長后期，更不必等到生長完全停止[13]。一般情況下，當菌體處于不利條件時才產(chǎn)生芽孢，如果營養(yǎng)條件太差，雖然芽孢形成率高，但芽孢總數(shù)過低；營養(yǎng)條件過好時，雖有利于菌體生長但不易形成芽孢，在短時間內(nèi)無法達到高芽孢形成率。所以進行產(chǎn)芽孢條件研究非常必要[14]。因此，本研究以無拮抗反應的并具有解磷解鉀作用的促生菌株地衣芽孢桿菌（Baclicus lincheniformis）DY-1和膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）XK為混菌發(fā)酵研究對象，采用單因素試驗和正交試驗對這兩株混菌發(fā)酵的最佳產(chǎn)芽孢的條件進行優(yōu)化，以期為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)和復合微生物肥料的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

地衣芽孢桿菌（Baclicus lincheniformis）DY-1和膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）XK：河南省科學院生物研究所保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

YMA液體培養(yǎng)基：甘露醇10 g/L，酵母粉1 g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，NaCl0.1g/L，CaSO40.2g/L，Rh微量元素液4 mL/L（Rh微量元素液：H3BO35 g/L，Na2MnO45 g/L），pH 6.8～7.0.

混菌發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉5g/L，豆粕0.75g/L，KNO30.75g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，NaCl0.1g/L，MnSO4·2H2O 0.25g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O0.25g/L，CaSO40.2g/L，Rh微量元素液4 mL/L，pH 7.0～8.0。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉5 g，用5 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至7.0，用去離子水定容至1 L。

硅酸鹽細菌搖瓶固體培養(yǎng)基：淀粉5.0g，酵母浸粉1 g，K2HPO42.0 g，MgSO40.5 g，CaCO30.1g，F(xiàn)eCl35 mg，瓊脂粉5 g，用蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 儀器與設備

JA1103N電子天平：上海民橋精密科學儀器有限公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；EMS-4A磁力攪拌器：上海鷹迪儀器設備有限公司；XMTD-8222恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；HYG-A恒溫搖床：江蘇太倉市實驗設備廠；303A-1型恒溫培養(yǎng)箱：上海榮豐科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株之間的拮抗試驗

地衣芽孢桿菌（B.lincheniformis）DY-1和膠凍樣芽孢桿菌（B.mucilaginosus）XK菌株間的拮抗反應測試采用平板擴散對峙法，將一種菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的菌懸液2%接種到液體YMA發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)48 h，各取100 μL發(fā)酵液分別涂布YMA培養(yǎng)基平板，用打孔器打孔；然后分別將發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min取上清，取一種菌株的發(fā)酵液上清50 μL滴加在涂布有另一種菌株的平板孔中，以無菌水作陰性對照，將2株供試菌兩兩進行抑菌試驗，每個處理做3次重復，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后觀察有無抑菌圈形成。

1.3.2 單因素試驗

將膠凍樣芽孢桿菌XK和地衣芽孢桿菌DY-1種子液分別按一定接種比例以適當?shù)慕臃N量接種于混菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于180 r/min搖床上恒溫培養(yǎng)一定時間后，取發(fā)酵液1 mL，80℃水浴20 min，將發(fā)酵液按101～106倍比稀釋后，取104、105、106涂布于LB平板，37℃培養(yǎng)24h后芽孢計數(shù)。分別考察兩種菌的接種比例（1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1（V/V））、接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）、培養(yǎng)溫度（25℃、30℃、35℃、37℃、40℃）、培養(yǎng)基初始pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、培養(yǎng)時間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）對混合發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)芽孢數(shù)的影響。

1.3.3 正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以產(chǎn)芽孢數(shù)（Y）為評價指標，選擇培養(yǎng)溫度（A）、初始pH值（B）、膠凍樣芽孢桿菌XK∶地衣芽孢桿菌DY-1（C）、培養(yǎng)時間（D）為因素，采用4因素3水平的正交試驗對混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢條件進行優(yōu)化，正交試驗優(yōu)化因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for spore-producing conditions optimization

1.3.4 芽孢計數(shù)

芽孢計數(shù)法參考周德慶[15]所介紹的方法，芽孢平板計數(shù)是在80℃水浴加熱20 min后采用平板菌落計數(shù)法檢測芽孢的形成數(shù)量。

1.3.5 7.5 L發(fā)酵罐中試發(fā)酵試驗

在最優(yōu)發(fā)酵條件下，利用Eppendorf 7.5 L發(fā)酵罐，在設定發(fā)酵溫度，發(fā)酵時間，初始pH值、攪拌速度等發(fā)酵參數(shù)的條件下進行中試混菌發(fā)酵試驗。觀察記錄發(fā)酵參數(shù)的變化，并用涂布平板計數(shù)法進行芽孢計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株拮抗反應測試

微生物間的拮抗作用，一般是指一種微生物的生命活動或其代謝產(chǎn)物，抑制或干擾另一種微生物生命活動的現(xiàn)象。通過平板對峙試驗結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌（Baclicus lincheniformis）DY-1和膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）XK無拮抗反應，可以進行混菌發(fā)酵。

2.2 單因素試驗

2.2.1 接種比例對混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響

圖1 菌株XK與DY-1接種比例對混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響Fig.1 Effect of inoculation proportion of strain XK and DY-1 on spore production by mixed bacteria fermentation

由圖1可知，不同接種比例對芽孢數(shù)的影響比較大，當膠凍樣芽孢桿菌XK和地衣芽孢桿菌DY-1種子液的接種比例為4∶1（V/V）時，混菌發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)芽孢數(shù)最多，為9.65×109CFU/mL；隨著XK∶DY-1接種比例的增加，混菌發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)芽孢數(shù)開始減少。這可能是因為膠凍樣芽孢桿菌XK生長速度較地衣芽孢桿菌慢的緣故。因此，選擇膠凍樣芽孢桿菌XK和地衣芽孢桿菌DY-1種子液的最佳接種比例為4∶1（V/V）進行正交試驗優(yōu)化。

2.2.2 接種量對混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響

圖2 接種量對混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響Fig.2 Effect of inoculum on spore production by mixed bacteria fermentation

由圖2可知，隨著接種量的增加，混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢數(shù)變化不大，這可能是因為接種量增加到一定在程度時，導致單位體積的菌體密度增大，從而影響菌株生長和芽孢的形成。當接種量為5%時，混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢最多，為1.13×1010CFU/mL。因此，選擇接種量5%為最佳。

2.2.3 培養(yǎng)溫度對混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響

圖3 培養(yǎng)溫度對混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響Fig.3 Effect of culture temperature on spore production by mixed bacteria fermentation

由圖3可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢數(shù)迅速增加，這是因為在一定溫度范圍內(nèi)，適當提高培養(yǎng)溫度能促進菌株的生長和芽孢的形成，當培養(yǎng)溫度在35～40℃范圍內(nèi)時，產(chǎn)芽孢較多；當培養(yǎng)溫度為37℃時產(chǎn)芽孢最多，為1.23×1010CFU/mL。因此，選擇培養(yǎng)溫度為37℃進行正交試驗優(yōu)化。

2.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響

圖4 初始pH值對混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響Fig.4 Effect of initial pH on spore production by mixed bacteria fermentation

由圖4可知，當發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值由5.0升高至8.0時，混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢數(shù)量逐漸增加，當初始pH值為8.0時，產(chǎn)芽孢數(shù)最多，為1.12×1010CFU/mL；再繼續(xù)增加pH值，混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢數(shù)開始下降，這可能是因為pH值增大，發(fā)酵液溶液堿性增強，不利于菌株的生長和芽孢的形成。因此，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基最佳初始pH值為8.0進行正交試驗優(yōu)化。

2.2.5 培養(yǎng)時間對混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響

由圖5可知，隨著發(fā)酵時間的延長，混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢數(shù)也隨之增加，當培養(yǎng)時間＞36 h后，芽孢數(shù)增加緩慢，當培養(yǎng)時間48 h之后，產(chǎn)芽孢數(shù)逐漸趨于穩(wěn)定，當培養(yǎng)時間為72 h時產(chǎn)芽孢數(shù)反而略有所減少，可能是因為隨著發(fā)酵時間的延長，代謝產(chǎn)物增多和菌株密度過大所致。因此，選擇培養(yǎng)時間為48 h進行正交試驗優(yōu)化。

圖5 培養(yǎng)時間對混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響Fig.5 Effect of culture time on spore production by mixed bacteria fermentation

2.3 培養(yǎng)條件的正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，接種量對混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢數(shù)影響不顯著，因此選擇培養(yǎng)溫度（A）、初始pH值（B）、菌株XK∶DY-1接種比例（C）、培養(yǎng)時間（D）4個因素，以產(chǎn)芽孢數(shù)（Y）為評價指標，采用正交試驗對混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢條件進行優(yōu)化，正交試驗優(yōu)化因素與水平見表2。

表2發(fā)酵產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化結(jié)果與分析

Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for spore-producing conditions optimization

試驗號ABCD芽孢數(shù)（/×108CFU·mL-）111111182.0 2122238.0 31333135.5 4213268.5 52213202.0 62321112.0 7312322.5 8323150.5 9331291.5 k1118.5091.00158.50114.80 k2127.5096.8357.5066.00 k354.83113.0084.83120.00 R72.6722.00101.0054.00

由表2可知，極差結(jié)果分析顯示，影響混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢數(shù)的因素主次關系為C＞A＞D＞B，即接種比例＞培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)時間＞初始pH值。其最優(yōu)組合為A2B3C1D3，即混菌發(fā)酵最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為37℃，初始pH值為8.0，膠凍樣芽孢桿菌XK和地衣芽孢桿菌DY-1種子液的接種比例為4∶1（V/V），培養(yǎng)時間60 h。在此條件下，進行3次驗證試驗，混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢數(shù)為2.02×1010CFU/mL。

2.4 7.5 L發(fā)酵罐小試

在最優(yōu)發(fā)酵條件下，利用Eppendorf 7.5 L發(fā)酵罐進行中試混菌發(fā)酵試驗，具體發(fā)酵參數(shù)變化如圖6所示，由圖6可知，在發(fā)酵過程中，發(fā)酵罐溶氧（dissolve of oxygen，DO）和發(fā)酵液pH值變化較大。在發(fā)酵約12 h時，發(fā)酵罐溶氧DO開始突然降低，此時的pH值也降低，說明此時菌株開始進入對數(shù)生長期；當發(fā)酵約16 h后，發(fā)酵罐溶氧DO又突然升高，而此時發(fā)酵液pH值開始逐漸增加；當發(fā)酵約19 h后，溶氧DO達到最低，發(fā)酵液pH值又開始逐漸降低，說明混合菌株已經(jīng)開始進入對數(shù)生長后期；當發(fā)酵約25 h后，溶氧DO又逐漸升高，發(fā)酵液pH值雖有所降低，但變化不大，說明此時混合菌株已經(jīng)達到生長穩(wěn)定期，芽孢已經(jīng)開始形成。通過7.5 L發(fā)酵罐小試試驗可以清楚地觀察到：隨著發(fā)酵時間的延長，溶氧DO和發(fā)酵液pH值等發(fā)酵參數(shù)的變化，及時了解菌株生長和芽孢形成情況。

圖67 .5 L發(fā)酵罐中試試驗在40 h內(nèi)各參數(shù)的變化Fig.6 Changes of the parameters of 7.5 L fermentor pilot scale tests in 40 h

在發(fā)酵60 h后放罐，對混合發(fā)酵菌液進行倍比稀釋，通過平板計數(shù)法計算出混菌發(fā)酵液中芽孢總數(shù)高達1.09× 1011CFU/mL，遠高于搖瓶發(fā)酵所產(chǎn)芽孢數(shù)（2.02×1010CFU/mL）。

3 結(jié)論

本研究通過上述單因素試驗和正交試驗得出混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢最佳條件為膠凍樣芽孢桿菌XK和地衣芽孢桿菌DY-1種子液的接種比例4∶1（V/V），培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間60h，pH8.0，在此最佳發(fā)酵條件下，利用Eppendorf7.5L發(fā)酵罐進行混菌發(fā)酵產(chǎn)芽孢，其芽孢數(shù)可高達1.09×1011CFU/mL，得出了混菌發(fā)酵基本工藝參數(shù)的變化規(guī)律。采用混菌發(fā)酵模式不但可以節(jié)約發(fā)酵時間，而且還可減低生產(chǎn)成本。從而為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)微生物肥料提供了科學依據(jù)。

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TS201.3

0254-5071（2017）05-0095-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.020

2016-12-05

2012年河南省重大科技專項（121100110100）；2014年河南省轉(zhuǎn)制機構(gòu)研究發(fā)展專項[豫財政(2014)383號]；2015年河南省科學院生物研究所有限責任公司/中科院微生物研究所應用微生物技術聯(lián)合實驗室專項基金項目

王繼雯（1970-），女，副研究員，碩士，研究方向為農(nóng)業(yè)微生物。

*通訊作者：陳國參（1963-），男，研究員，碩士，研究方向為農(nóng)業(yè)微生物。