桃褐腐病菌拮抗酵母的篩選、鑒定及其抑菌活性初探

王晨，張殿朋，南立軍，盧彩鴿，劉婭*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京100094；3.楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南楚雄675000）

桃褐腐病菌拮抗酵母的篩選、鑒定及其抑菌活性初探

王晨1，2，張殿朋2，南立軍3，盧彩鴿2，劉婭1*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京100094；3.楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南楚雄675000）

以北京平谷桃果實(shí)表皮上分離得到的45株酵母菌為出發(fā)菌株，采用平板對(duì)峙法，篩選對(duì)桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）具有較高拮抗作用的生防酵母菌。結(jié)果表明，共篩選出具有較好抑制效果的酵母菌6株，其中菌株MLL-9-1拮抗活性最強(qiáng)，對(duì)桃褐腐病菌的抑菌率達(dá)77.91%；活體篩選試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株對(duì)桃褐腐病的抑制率達(dá)50.30%。生防相關(guān)性狀檢測(cè)結(jié)果顯示，該菌株能夠產(chǎn)生蛋白酶，透明圈直徑達(dá)30.5 mm，說(shuō)明該菌主要通過(guò)分泌蛋白酶達(dá)到抑制病原菌的效果。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)及26S rDNA序列分析，鑒定該菌為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。

桃褐腐病菌；拮抗酵母；篩選鑒定；葡萄汁有孢漢遜酵母

WANG Chen1,2,ZHANG Dianpeng2,NAN Lijun3,LU Caige2,LIU Ya1*
(1.College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832000,China;2.Institution of Plant and Environment Protection, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science,Beijing 100094,China;3.School of Chemistry and Life Sciences, Chuxiong Normal University,Chuxiong 675000,China)

桃褐腐病別名果腐病，是一種分布廣泛的果實(shí)病害，對(duì)核果類(lèi)果實(shí)破壞力極強(qiáng)，既可以作用于田間的果實(shí)，大量破壞或殺死成熟果實(shí)，導(dǎo)致果實(shí)產(chǎn)量降低，也可以作用于貯藏期間的果實(shí)，引發(fā)采后生理病害，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。美澳型核果褐腐病菌（Monilinia fructicola）、核果褐腐病菌（Monilinia laxa）和仁果褐腐病菌（Monilinia fructigena）[1]均是常見(jiàn)的桃褐腐病病原菌，其中病原菌M.fructicola引起的桃褐腐病是桃腐敗的最主要原因[2]。當(dāng)前主要采用氣調(diào)貯藏、機(jī)械冷藏等物理方法與化學(xué)合成農(nóng)藥相結(jié)合防治桃褐腐等真菌病害[3]，但存在成本高、化學(xué)藥劑污染環(huán)境和危害人體健康等不足。已有研究表明，利用微生物生防菌劑可以有效避免這些問(wèn)題[4]，能抑制桃采后褐腐病的微生物主要包括絲狀真菌[5-6]、酵母[7-9]和細(xì)菌[10-12]。與其他絲狀真菌相比，酵母菌分泌出來(lái)的抑菌物質(zhì)沒(méi)有過(guò)敏源等有害物質(zhì)，對(duì)人體的毒害作用微乎其微[13]，且酵母菌的營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單，易于培養(yǎng)，利于大規(guī)模生產(chǎn)，因此，生防酵母的開(kāi)發(fā)備受關(guān)注。

為了尋找防治桃褐腐病的生防酵母，本研究針對(duì)分離自北京市平谷區(qū)的45株酵母菌，采用離體試驗(yàn)和活體試驗(yàn)相結(jié)合的方法從中篩選出對(duì)桃褐腐病具有生防效果的優(yōu)良菌株，確定菌株的分類(lèi)學(xué)地位，初步了解其抑菌活性，以期為桃采后病害的生物防治提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母菌：分離北京市平谷區(qū)采集的桃果實(shí)，共45株；桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）：由北京市農(nóng)林科學(xué)院生防微生物研究室從京郊桃產(chǎn)區(qū)采集的感病桃子上分離、純化和保存；桃：北京農(nóng)林科學(xué)院附近市場(chǎng)銷(xiāo)售的鮮桃，品種為久保，要求果實(shí)大小、成熟度、色澤較為一致。

葡萄糖（分析純）：中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；GoldView核酸染料（生物試劑）：北京艾比根生物技術(shù)有限公司；2×Taq聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、酵母基因組脫氧核糖核酸（desoxyribonucleic acid，DNA）快速提取試劑盒：博邁德生物技術(shù)有限公司。

酵母菌株活化培養(yǎng)基：酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基（加硫酸鏈霉素，終質(zhì)量濃度為100 mg/mL）[2]；菌株分離與平板對(duì)峙培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[14]；生防相關(guān)性狀檢測(cè)培養(yǎng)基[15]：CAS培養(yǎng)基（檢測(cè)嗜鐵素）、幾丁質(zhì)培養(yǎng)基（檢測(cè)幾丁質(zhì)酶）、脫脂牛奶瓊脂培養(yǎng)基（檢測(cè)蛋白酶）、剛果紅培養(yǎng)基（檢測(cè)纖維素酶）、Pikovskaya's瓊脂培養(yǎng)基（檢測(cè)磷酸酯酶）。

除脫脂牛奶瓊脂培養(yǎng)基需在115℃條件下滅菌20 min外，其余培養(yǎng)基均在121℃條件下滅菌20 min后待用。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-60型電泳儀：北京市六一儀器廠；Mastercycler nexus型PCR儀：德國(guó)Eppendorf公司；Gel Doc XR+and ChemiDoc XRS+型分子成像系統(tǒng)：伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；SX-700型TOMY快速自動(dòng)高壓滅菌儀：南京非同科學(xué)儀器有限公司；LHR-100型低溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生防酵母菌株的離體篩選

采用平板對(duì)峙法，將桃褐腐病菌接種于PDA平板上，28℃恒溫培養(yǎng)3 d，自菌落邊緣用直徑為7 mm無(wú)菌不銹鋼打孔器打取菌片，用無(wú)菌接種針移植于PDA平板上，菌絲面朝下。在距桃褐腐病菌菌片4.0 cm處用接種環(huán)取酵母菌株劃線，以?xún)H接種桃褐腐病菌菌片的平板為對(duì)照（CK）；重復(fù)3次，28℃恒溫培養(yǎng)，每天記錄病原菌半徑，6 d后計(jì)算抑制率[16]。抑菌率計(jì)算公式如下：

1.3.2 生防酵母菌株的活體篩選

以離體篩選出的生防酵母作為復(fù)篩菌株。選取大小、成熟度、色澤較為一致的桃子，先用1%次氯酸鈉溶液浸泡消毒1 min，用無(wú)菌蒸餾水沖洗，然后用打孔器（直徑為3 mm）在桃果實(shí)表面打出4個(gè)對(duì)稱(chēng)的傷口，用移液器在傷口上滴加30 μL濃度為1×105CFU/mL的桃褐腐病菌孢子懸浮液，25℃放置2h，自然風(fēng)干，再接種30 μL濃度為1×108CFU/mL的酵母菌懸液。以無(wú)菌水和桃褐腐病菌孢子懸浮液作對(duì)照，晾干后置于25℃、相對(duì)濕度95%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察，6 d后記錄桃果實(shí)的病斑直徑（十字交叉法），計(jì)算抑菌率。每個(gè)處理選取15個(gè)果實(shí)，2個(gè)重復(fù)。抑菌率計(jì)算公式如下：

1.3.3 生防酵母菌株的生防相關(guān)性狀檢測(cè)[15]

將篩選獲得的生防酵母菌在28℃下培養(yǎng)24 h，然后點(diǎn)種于1.1中制備的生防相關(guān)性狀檢測(cè)培養(yǎng)基平板上（每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)），28℃培養(yǎng)72 h，根據(jù)平板上暈圈或透明圈直徑大小初步檢測(cè)菌株產(chǎn)生防物質(zhì)的能力。

1.3.4 菌株鑒定

形態(tài)觀察：將所篩選的酵母菌株接種于YPD平板上，28℃活化培養(yǎng)2 d后觀察菌株的菌落形態(tài)、大小、顏色、透明度、突起和邊緣情況。用顯微鏡觀察菌株的菌體形態(tài)，并拍照。

生理生化檢測(cè)：參考《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[17]對(duì)菌株的生理生化指標(biāo)進(jìn)行鑒定。

分子鑒定：采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株的基因組DNA。采用酵母菌PCR擴(kuò)增通用引物（NL1-f：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAA；G/NL4-r：GGTCCG TGTTTCAAGACGG），反應(yīng)擴(kuò)增體系45 μL：2×TaqMix 20μL；NL11μL；NL41μL；基因組DNA3μL；ddH2O20μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s；55℃退火45 s；72℃延伸1 min；35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。產(chǎn)物均用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目標(biāo)條帶經(jīng)切膠回收純化后，送至北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)定的序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與現(xiàn)有的近緣菌株序列比較。進(jìn)化距離的計(jì)算采用鄰接法，進(jìn)化樹(shù)分支模式的穩(wěn)定性用MEGA v.5.0軟件分析，采用bootstrap法，重復(fù)次數(shù)為1 000，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防酵母菌株的離體篩選

表1 離體試驗(yàn)生防酵母菌株對(duì)桃褐腐病菌的抑菌活性Table 1 Antibacterial activity of antagonistic yeasts onM.fructicola in vitrotests

采用平板對(duì)峙法對(duì)45株酵母進(jìn)行離體篩選，發(fā)現(xiàn)6株酵母菌對(duì)桃褐腐病具有一定的拮抗活性，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，根據(jù)抑菌率，篩選出3株拮抗活性最高的菌株，即菌株MLL-9-1、MLL-17和MLL-23，對(duì)桃褐腐病菌的抑菌率分別為77.91%、76.90%和65.38%，病斑直徑分別為19.88 mm、20.79 mm和24.62 mm，抑菌效果明顯優(yōu)于對(duì)照組和其他3株菌（P＜0.05）。其中，菌株MLL-9-1對(duì)桃褐腐病的抑制效果最為明顯。

2.2 生防酵母菌株的活體篩選

對(duì)初篩的3株酵母菌進(jìn)行活體篩選的復(fù)篩試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，處理6 d后菌株MLL-9-1、MLL-17和MLL-23對(duì)桃褐腐病菌的抑菌率分別為50.30%、43.41%和30.08%；生防菌處理6 d后的桃褐腐病病斑直徑分別為29.81 mm、33.94 mm和41.94 mm，其中菌株MLL-9-1的病原菌菌落直徑顯著優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05）。綜合離體和活體的抑菌活性篩選結(jié)果，最終確定菌株MLL-9-1為最優(yōu)菌株。

表2 初篩酵母菌懸浮液對(duì)桃褐腐病菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of preliminary screening yeasts suspension onM.fructicola

2.3 菌株MLL-9-1的生防相關(guān)性狀檢測(cè)

將菌株MLL-9-1在生防相關(guān)性狀檢測(cè)培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)72 h后，觀察其產(chǎn)生防物質(zhì)情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，菌株MLL-9-1在蛋白酶檢測(cè)平板上能夠形成明顯的透明圈，其直徑達(dá)到30.5 mm。在嗜鐵素、幾丁質(zhì)酶、磷酸酯酶以及纖維素酶的檢測(cè)平板上并沒(méi)有水解透明圈現(xiàn)象出現(xiàn)，說(shuō)明菌株MLL-9-1主要通過(guò)分泌蛋白酶降解組成病原菌細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)進(jìn)而達(dá)到抑制桃褐腐病菌的效果。

圖1 菌株MLL-9-1產(chǎn)蛋白酶檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Detection results of protease-producing strain MLL-9-1

2.4 菌株MLL-9-1的鑒定

2.4.1 菌株培養(yǎng)形態(tài)及菌體特征

將所篩選的酵母菌株MLL-9-1接種于YPD培養(yǎng)基上28℃活化培養(yǎng)，2 d后觀察菌株培養(yǎng)形態(tài)特征，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌株MLL-9-1在100倍光學(xué)顯微鏡下菌體細(xì)胞呈球形或橢圓形（2.4～2.7 μm×4.0～4.8 μm），單個(gè)，具有運(yùn)動(dòng)性；在YPD培養(yǎng)基上菌株MLL-9-1的菌落呈乳白色，濕潤(rùn)，粘稠，易挑起，表面光滑，隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，菌落變厚，邊緣整齊，表面無(wú)褶皺。

圖2 菌株MLL-9-1的菌株形態(tài)(A)及菌落特征(B)Fig.2 Strain morphology(A)and colony characteristics(B)of strain MLL-9-1

2.4.2 生理生化特征

菌株MLL-9-1的生理生化特性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，該菌在pH 7.5、8.5的環(huán)境下正常生長(zhǎng)，在pH 9.5的環(huán)境下不能生長(zhǎng)。能利用葡萄糖、蔗糖、山梨糖、纖維二糖。在35℃和37℃下生長(zhǎng)良好，40℃下不能生長(zhǎng)。

表3 菌株MLL-9-1的生理生化特性檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection results of physiological and biochemical characteristics of strain MLL-9-1

2.4.3 分子生物學(xué)鑒定

以菌株MLL-9-1基因組DNA為模板，酵母通用引物NL1/NL4擴(kuò)增其26S rDNA序列，PCR產(chǎn)物約為700 kbp的單一條帶，經(jīng)序列測(cè)定，獲得菌株MLL-9-1的26S rDNA序列，將該序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnologyinformation，NCBI）上在線BLAST比對(duì)，選取排在比對(duì)結(jié)果前面的部分同源序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，菌株MLL-9-1與Hanseniaspora uvarum strain Li（EU188623.1）的26S rDNA序列處于同一分支，相似度達(dá)到了100%。綜合形態(tài)觀察以及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，確定菌株MLL-9-1為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。

圖3 菌株MLL-9-1的26S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain MLL-9-1 based on 26S rDNA gene sequences

3 結(jié)論

本研究先后采用平板對(duì)峙法和桃活體試驗(yàn)，篩選出1株對(duì)桃褐腐病菌具有顯著抑制效果的酵母菌株MLL-9-1。離體試驗(yàn)和活體試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株對(duì)桃褐腐病菌的抑菌率分別為77.91%和50.30%。生防相關(guān)性狀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該菌能夠分泌蛋白酶，表明它可能主要通過(guò)分泌蛋白酶降解組成病原菌細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)達(dá)到抑制病原菌的效果。經(jīng)菌株形態(tài)、生理生化特性和分子生物學(xué)鑒定，確定菌株MLL-9-1為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。菌株MLL-9-1是1株很有應(yīng)用前景的生防功能菌，為深入開(kāi)發(fā)應(yīng)用該生防菌株提供了理論基礎(chǔ)。

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S476

0254-5071（2017）05-0063-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.013

2016-11-13

兵團(tuán)博士資金專(zhuān)項(xiàng)（2014BB006）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31460031）；石河子大學(xué)高層次人才科研啟動(dòng)資金專(zhuān)項(xiàng)（RCZX201431）

王晨（1991-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。

*通訊作者：劉婭（1974-），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。