蘭州熊蜂（Bombus lantschouensis）SMPD基因原核表達誘導條件的優(yōu)化

韓 蕾董 捷黃家興和紹禹吳 杰

（1云南農(nóng)業(yè)大學東方蜜蜂研究所，昆明650201；2中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)部授粉昆蟲生物學重點開放實驗室，北京100093）

蘭州熊蜂（Bombus lantschouensis）SMPD基因原核表達誘導條件的優(yōu)化

韓 蕾1,2董 捷2黃家興2和紹禹1吳 杰2

（1云南農(nóng)業(yè)大學東方蜜蜂研究所，昆明650201；2中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)部授粉昆蟲生物學重點開放實驗室，北京100093）

蘭州熊蜂(Bombus lantschouensis)是我國優(yōu)良熊蜂蜂種，已成功實現(xiàn)人工飼養(yǎng)并應用于設施作物授粉。鞘磷脂磷酸二酯酶（SMPD）是一種水解酶，參與鞘磷脂代謝過程并起關鍵作用。本研究從誘導溫度、IPTG濃度及誘導時間三個因素對SMPD基因的原核表達進行優(yōu)化，以期獲得最佳原核表達條件。結果表明：誘導溫度與誘導時間是影響SMPD蛋白表達量的主要因素，而誘導劑IPTG濃度影響較小。當溫度為10℃，IPTG終濃度為0.1 mM，誘導時間為32 h時，目的蛋白表達量高，特異性好，能夠滿足該蛋白后續(xù)純化實驗要求。本研究結果為進一步開展SMPD蛋白功能研究奠定重要基礎。

蘭州熊蜂；原核表達；SMPD基因；誘導條件

1 引言

鞘磷脂磷酸二酯酶（sphingomyelin phosphodiesterase,SMPD）是一種水解酶，能水解神經(jīng)鞘磷脂生成神經(jīng)酰胺[1]，參與細胞凋亡、生長抑制等生理病理活動。研究發(fā)現(xiàn)該基因與哺乳動物的壽命和某些疾病相關，Kenichi Horinouchi等[2]利用基因敲除技術敲除小鼠SMPD基因后，小鼠出現(xiàn)生長緩慢、神經(jīng)退化及壽命縮短等變化。隨后，Schneider等[3]首次在尼曼匹克?。∟iemann.Pick Disease，NPD)患者中發(fā)現(xiàn)SMPD基因處于缺乏狀態(tài)。此外，高軍等[4]通過RNA干擾技術發(fā)現(xiàn)該蛋白能夠參與哺乳動物卵巢的保護，研究表明SMPD基因被激活后釋放到細胞表面，水解細胞膜上的鞘磷脂酶，導致神經(jīng)酰胺水平在數(shù)秒到數(shù)分鐘內(nèi)迅速上升，從而阻斷鞘磷脂酶的表達并抑制卵母細胞在抗腫瘤治療過程的凋亡。

在昆蟲中，SMPD基因的研究較少。Kraut等[5]在研究神經(jīng)鞘脂類對果蠅發(fā)育和疾病的作用中發(fā)現(xiàn)：果蠅飼喂糖水后，鞘磷脂酶和神經(jīng)酰胺水平下調(diào)，而脂肪酸水平上調(diào)，因此推測該脂類可能在抑制脂肪酸合成中發(fā)揮作用。2012年，Joshua等[6]發(fā)現(xiàn)通過siRNA技術沉默妊娠期雌性舌蠅SMPD基因，導致雌性舌蠅的妊娠期延長，子代數(shù)量和羽化能力降低，子代熱耐受力受損，共生菌減少以及影響子代繁殖力等一系列問題。因此，昆蟲SMPD基因可能參與昆蟲的生殖過程。然而，關于SMPD基因在熊蜂上的研究還未見報道，蘭州熊蜂（Bombus lantschouensis）是我國良種熊蜂之一，被應用于溫室作物授粉[7]。因此，開展熊蜂SMPD基因研究，對該基因在熊蜂中的作用具有重要的指導意義。

前期實驗已通過PCR擴增了SMPD基因片段，并成功構建了原核表達載體pCold-II-SMPD；該載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，經(jīng)異丙基-β-D巰基半乳糖苷（IPTG）誘導后表明有融合目的蛋白表達。因此，本研究擬對蘭州熊蜂SMPD基因原核表達條件進行優(yōu)化，以期獲得高量表達SMPD蛋白，為制備SMPD蛋白的抗血清及進一步功能研究奠定基礎。

2 材料與方法

2.1 菌液的活化及其鑒定

pCold-II-SMPD重組質(zhì)粒的BL21（DE3）重組菌由本研究室保存。按照1∶50將含pCold-II-SMPD重組質(zhì)粒的重組菌添加到5 ml含氨芐青霉素（AMP）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 rpm/min震蕩培養(yǎng)過夜；提取pCold-IISMPD重組質(zhì)粒（中科瑞泰生物科技有限公司，北京）并用EcoRⅠ、SacⅠ限制性內(nèi)切酶（New England Biolabs，美國）雙酶切鑒定。

2.2 重組菌IPTG誘導濃度的優(yōu)化

取一管活化后的菌液按照1∶50加到5 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 rpm/min振蕩培養(yǎng)；待菌液OD600達到0.4~0.6時，冰浴10 min，15℃放置30 min，加入誘導劑IPTG，使其終濃度分別為0、0.1、0.3、0.5、0.7和1.0 mM，放入15℃中誘導24 h，震蕩速度為160 rpm/min。

2.3 重組菌IPTG誘導溫度的優(yōu)化

取一管活化后的菌液按照2.2中的方法進行誘導前樣品準備，IPTG終濃度分別為0、0.1、0.3、0.5、0.7和1.0 mM，分別放入4和10℃中誘導24 h，震蕩速度為160 rpm/min。

2.4 重組菌誘導時間的優(yōu)化

取一管活化后的菌液按照2.2中的方法進行誘導前樣品準備，根據(jù)確定最適IPTG濃度和最適溫度，以160 rpm/min分別誘導8、16、24、32 h。

菌液誘導結束后于4℃、12000 rpm/min離心5 min；棄上清液，向菌體沉淀中加入1.5 ml PBS懸浮沉淀，再進行上述離心，如此重復3次進行菌體漂洗；按照細菌蛋白提取試劑盒（康為世紀生物科技有限公司，北京）的方法進行蛋白提取；將提取獲得的上清和沉淀分別加入上樣緩沖液混勻，100℃煮沸5 min；各取7 μl。通過12%SDS-PAGE電泳檢測，考馬斯亮藍R250染色液染色30 min；最后，用脫色液脫色至條帶清晰，掃描分析。

3 結果與分析

3.1 重組質(zhì)粒鑒定

將pCold-II-SMPD重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和SacⅠ雙酶切及電泳后，獲得兩個大小約為900和4800 bp條帶，與SMPD基因片段和pCold-II質(zhì)粒片段長度一致（圖1），酶切鑒定結果表明，所得重組質(zhì)粒為目的重組質(zhì)粒，經(jīng)活化后的菌液可直接用于后續(xù)實驗。

圖1 pCold-II-SMPD重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

3.2 不同溫度與IPTG濃度對SMPD蛋白表達量的影響

通過對SMPD重組菌進行不同溫度與IPTG濃度組合誘導，結果表明：溫度對總蛋白的表達量影響較大，隨著溫度升高，總蛋白表達量呈遞增的趨勢；當誘導溫度相同時，不同IPTG濃度對重組蛋白的表達量影響較小，經(jīng)比較分析確定該蛋白誘導最優(yōu)的溫度和IPTG濃度組合為10℃和0.1 mM（圖2）。

3.3 不同誘導時間對SMPD蛋白表達量的影響

將SMPD蛋白以優(yōu)化后的最適溫度和IPTG濃度進行不同時間誘導表達，結果顯示：誘導溫度為10℃，誘導劑IPTG濃度為0.1 mM時，誘導時間在8、16、24和32 h時該蛋白均有表達，但在32 h時表達量最高。（圖3）。

4 討論

通過原核表達獲得大量目的蛋白是深入開展基因功能研究的前提，而原核表達過程中，蛋白表達量不僅受目的基因序列的影響，同時也與表達菌株、表達系統(tǒng)、誘導劑IPTG濃度、誘導時間和誘導溫度等因素相關[8-11]。本研究首次對熊蜂SMPD基因的原核表達的誘導溫度、誘導劑濃度及誘導時間進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)各優(yōu)化條件對原核表達的影響程度不同，其中誘導溫度及誘導時間影響較大，而IPTG濃度影響較小。

在本研究中，隨著IPTG濃度的升高，SMPD蛋白表達量未出現(xiàn)明顯變化，此結果與陳雪燕等[12]研究結果一致。由于IPTG作為原核表達的誘導劑，具有不被菌體代謝、誘導效果長久且誘導效率高[13]等優(yōu)點，但是高濃度的IPTG會對菌株產(chǎn)生一定的毒害作用，因此，在誘導效果沒有顯著差異的情況下，選擇0.1 mM為最適誘導劑濃度。原核表達的誘導溫度不僅影響菌體的生長，同時也影響重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性和融合蛋白的表達水平，本研究在比較4、10和15℃這三個誘導溫度時，發(fā)現(xiàn)總蛋白表達量隨溫度升高呈遞增趨勢。其中，SMPD目的蛋白表達量逐漸增高，但與此同時非目的蛋白的表達量也明顯增多，表明溫度的增加也促進了細菌內(nèi)其他蛋白的表達，因此綜合目的蛋白表達量和表達特異性，選擇10℃作為最適誘導溫度。

本次實驗中，蘭州熊蜂SMPD基因在各種誘導條件下均以包涵體形式存在，在細胞破碎后的上清中幾乎未找到目的重組蛋白，而原核表達過程中，包涵體蛋白的形成原因是多方面的。造成本實驗結果的原因可能是由于昆蟲基因利用原核表達系統(tǒng)表達，使得該外源基因表達過程中對表達細胞產(chǎn)生一定的毒性，從而以不可溶的包涵體形式存在。

本研究明確了蘭州熊蜂SMPD基因原核表達的最佳誘導溫度、誘導劑濃度及誘導時間分別為10℃、0.1 mM和32 h。利用優(yōu)化的原核表達條件，可以獲得大量目的蛋白，為后續(xù)蛋白純化、抗體制備及深入開展SMPD基因在蘭州熊蜂表達特性及功能研究奠定了基礎。

圖2 誘導溫度與誘導劑濃度對目的蛋白表達量影響

圖3 誘導時間對目的蛋白表達量影響

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[3]Schneider P B,Kennedy E P.Sphingomyelinase in normal human spleens and in spleens from subjects with Niemann-Pick disease[J].Journal of Lipid Research,1967,8(8):202-209.

[4]高軍，周燦權，張仁禮，等.靶向SMPD1基因的RNA干擾對人成纖維細胞凋亡的保護作用[J].中山大學學報,2007,28(2):159-164.

[5]Kraut R.Roles of sphingolipids in Drosophila development and disease[J].Journal of Neurochemistry,2011,116(5):764-778.

[6]Benoit J B,Attardo G M,Michalkova V,et al.Sphingomyelinase Activity in Mother's Milk Is Essential for Juvenile Development:A Case from Lactating Tsetse Flies[J].Biology of Reproduction,2012, 87(1):1-10.

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Optimization of inducing conditions for prokaryotic expression of SMPD gene from Bombus lantschouensis

Han Lei1,2,Dong Jie2,Huang Jiaxing2,He Shaoyu1,Wu Jie2
(1 Eastern Bee Research Institute,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201，China;2 Key Laboratory for Insect-Pollinator Biology of the Ministry of Agriculture,Institute of Apicultural Research，Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100093，China)

Bombus lantschouensis is an excellent pollinator for greenhouse crop in China.Sphingomyelin phosphodiesterase（SMPD）is a hydrolase enzyme that is involved in sphingolipid metabolism reactions.To increase the expression level of the SMPD protein in E.coli BL21 (DE3),the prokaryotic expression conditions of inducing temperature,IPTG concentration and incubation time were optimized.Results indicated that inducing temperature and time were the main factors affected the expression level of SMPD protein.However,the concentration of IPTG contributed to the express level very few.The optimized conditions for the highest expression level of the target protein are as follows:inducing temperature at 10℃，IPTG concentration is 0.1 mM and incubation time is 32 h.The current study provides a basic knowledge for studying the role of SMPD protein in Bombus lantschouensis in future.

Bombus lantschouensis;prokaryotic expression;SMPD gene;inducing conditions

韓蕾（1992-），女，在讀碩士，E-mail:hanlei2016@126.com

和紹禹（1952-），男，教授，博士生導師，E-mail:kmhsy@163.com；吳杰（1962-），男，博士生導師，E-mail:apis@vip.sina.com