黃芪糖蛋白對膠原誘導性關(guān)節(jié)炎小鼠脾組織T-bet及GATA-3表達的影響

張 娜 趙俊云 薛慧清 劉 慧 李彩彩 楊向竹 周 然

(1 北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院,北京,100029; 2 山西中醫(yī)學院,太原,030024)

黃芪糖蛋白對膠原誘導性關(guān)節(jié)炎小鼠脾組織T-bet及GATA-3表達的影響

張 娜1趙俊云1薛慧清2劉 慧1李彩彩1楊向竹1周 然2

(1 北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院,北京,100029; 2 山西中醫(yī)學院,太原,030024)

目的:探討黃芪糖蛋白對膠原誘導性關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced Arthritis,CIA)小鼠特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3表達的影響,闡述黃芪糖蛋白治療膠原誘導性關(guān)節(jié)炎小鼠的免疫作用機制。方法:建立牛Ⅱ型膠原誘導的小鼠關(guān)節(jié)炎模型,隨機分為CIA模型組、氫化可的松陽性對照組、黃芪糖蛋白低劑量組、中劑量組、高劑量組;HE染色觀察CIA小鼠脾組織損傷程度;采用流式細胞術(shù)檢測CIA小鼠外周血IFN-γ和IL-4的水平;Western blot法檢測CIA小鼠脾組織中T-bet和GATA-3蛋白的表達。結(jié)果:與模型組比較,黃芪糖蛋白改善了CIA小鼠脾組織損傷情況,減輕炎性反應細胞浸潤,下調(diào)了外周血IFN-γ和IL-4水平(P<0.05);同時,降低了T-bet和GATA-3蛋白的表達(P<0.05)。結(jié)論:黃芪糖蛋白對CIA小鼠的治療作用,可能是與降低T-bet、GATA-3表達,調(diào)整Th1/Th2功能失衡有關(guān)。

黃芪糖蛋白;牛Ⅱ型膠原誘導性關(guān)節(jié)炎小鼠;GATA-3;T-bet

類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一個以累及周圍關(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)炎性反應性的自身免疫性疾病[1],在世界范圍內(nèi)患病率為0.01%～1.07%不等,最終將導致關(guān)節(jié)畸形、功能喪失,具有很高的致殘率。因RA病因和發(fā)病機制尚不明確,目前對RA尚無特效治療方法。研究己證明正常生理狀態(tài)下Th1與Th2細胞分化存在著一種動態(tài)平衡與交互抑制,Th1/Th2細胞分化的動態(tài)平衡一旦被打破,T細胞就會朝著Th1細胞分化占優(yōu)勢或Th2細胞分化占優(yōu)勢的“漂移狀態(tài)”發(fā)展,機體因此而發(fā)病。因此T細胞亞群Th1、Th2分化失衡被認為是誘導RA發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。

黃芪的藥理研究顯示其具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛和免疫調(diào)節(jié)等作用,但黃芪對RA Th1/Th2漂移的干預實驗還鮮有報道。黃芪糖蛋白(Huang Qi Glycoprotein,HQGP)是本研究組從膜莢黃芪中提取到一種具有免疫抑制活性的物質(zhì),并已申請專利[2]。實驗研究表明HQGP對小鼠脾淋巴細胞體外增殖具有明顯的抑制作用[3-4]。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)HQGP對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)的關(guān)節(jié)炎性反應有明顯的改善作用[5]。本文復制小鼠CIA模型,通過病理形態(tài)學觀察、特異轉(zhuǎn)錄因子的表達,初步探討HQGP對CIA小鼠的免疫作用機制。本實驗是以Th1、Th2的2個特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3來觀察CIA小鼠的Th1/Th2細胞分化及HQGP干預后表達變化,以期揭示HQGP對CIA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 BALb/c雄性小鼠,60只,體重16～18 g,清潔級,購于北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證號:SCXK(京)2009-0015)。

1.2 藥物 HQGP乳劑,由山西中醫(yī)學院提供。

1.3 試劑與儀器 弗氏完全佐劑,sigma公司;膠原蛋白Ⅱ型(牛),Chondrex公司;Anti-T-bet Purified、Anti-GATA-3 Purified eBioscience公司;β-actin、HRP標記羊抗兔IgG,北京博奧森生物技術(shù)有限公司;HRP標記羊抗小鼠IgG、四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-tetramethylenediamine,TEMED),北京康為世紀生物科技有限公司;苯甲基磺酰氟(Phenyl Methyl sulfonyl fluoride,PMSF)、聚偏氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride,PVDF)微孔轉(zhuǎn)移膜、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒、Tween-20、濃縮膠緩沖液(Upper stock or stacking buffer)、分離膠緩沖液(Lower stock or separating buffer)、過硫酸銨(Ammonium Persulfate,AP)、5%脫脂奶粉、Tris、SDS、BCA蛋白定量試劑盒,均由Solarbio公司提供;Cell Stimulation Cocktail(PMA+Ionomysin+BFA),Sigma公司;APC/Cy7 anti-mouse CD3、FITC anti-mouse CD4、PE anti-mouse IL-4、APC anti-mouse IFN-y,美國BioLegend公司。JY600C型電泳儀,北京君益東方電泳設備有限公司;酶聯(lián)免疫檢測儀,Tecan公司;流式細胞儀,美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

1.2.1.1 分組 將造模成功的小鼠50只隨機分為模型組(CIA)、氫化可的松(HC,10 mg/kg)陽性對照組、HQGP低劑量組(HQGP1,0.5 mg/kg)、HQGP中劑量組(HQGP2,1.0 mg/kg)、HQGP高劑量組(HQGP3,5.0 mg/kg),每組10只。

1.2.1.2 模型制備 雄性BALb/c小鼠適應性飼養(yǎng)1周。按照參考文獻[6]復制CIA模型。模型建立:在超凈工作臺內(nèi)將膠原蛋白Ⅱ型(牛)溶解于0.1 mol/L的醋酸中,在4 ℃冰箱中過夜,然后與1 g/L的弗氏完全佐劑等體積混合,在冰浴下完全乳化,制成弗氏完全佐劑與牛Ⅱ型膠原混合乳劑。于小鼠尾根部皮內(nèi)注射乳劑0.1 mL。將注射當日記為第0天,初次致敏后第21 d再次注射加強免疫。以關(guān)節(jié)腫脹度評分標準評價模型復制是否成功。

1.2.2 給藥方法 第42天給予腹腔注射藥物治療。給藥1次/3 d,共給藥6次。正常組(10只)注射等體積生理鹽水。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 關(guān)節(jié)腫脹度評分 根據(jù)四肢關(guān)節(jié)的病變程度累計積分,計算出關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis Index,AI)。標準為:關(guān)節(jié)無紅腫,0分;小趾關(guān)節(jié)稍腫,1分;趾關(guān)節(jié)和足趾關(guān)節(jié)腫脹2分;踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹,3分;踝關(guān)節(jié)在內(nèi)全部足爪腫脹,4分。4只足爪均評分,每只小鼠最高16分。AI值≥4分造模成功。

1.2.3.2 HE染色觀察脾組織形態(tài) 第57天脫頸處死小鼠,取各組小鼠脾組織,立即放入10%甲醛固定液中,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片,HE染色,加封蓋玻片保存。光學顯微鏡下觀察。

1.2.3.3 流式細胞儀檢測小鼠外周血IFN-γ、IL-4水平 第57天脫頸處死小鼠,取小鼠外周血。流式細胞術(shù)檢測按照說明書進行。外周血淋巴細胞懸液中加入刺激IFN-γ、IL-4分泌的刺激劑,在CO2培養(yǎng)箱中培育4 h。熒光標記輔助性T細胞CD3、CD4抗原,固定細胞,熒光標記胞質(zhì)內(nèi)聚集的IFN-γ、IL-4,流式細胞儀檢測。IFN-γ、IL-4分別特異性在Th1、Th2細胞分泌,因此以IFN-γ、IL-4的量表示Th1、Th2的數(shù)量。

1.2.3.4 Western blot法檢測脾組織中T-bet、GATA-3蛋白的表達 第57天處死小鼠,取各組小鼠脾組織,提取總蛋白,BCA法蛋白定量。取蛋白30 μg上樣,SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,室溫下封閉1 h,加入一抗,4 ℃冰箱封閉過夜;次日TBST脫洗3次,二抗孵育1 h,再脫洗3次后,ECL化學發(fā)光液顯色,X線片曝光,洗片。顯影結(jié)果采用Quantity One軟件計算灰度值,以目標蛋白與內(nèi)參比值反應蛋白表達水平。

2 實驗結(jié)果

2.1 CIA小鼠關(guān)節(jié)腫脹度評分 CIA模型小鼠于注射佐劑后第10天出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫反應,逐漸加重,于第42 d評分均值達到模型標準(≥4)。小鼠同時表現(xiàn)出倦怠,食量減少,活動受到障礙。CIA小鼠AI值變化(圖1)。

圖1 CIA小鼠不同天數(shù)AI值

2.2 HQGP對CIA小鼠脾組織病理切片觀察 常規(guī)HE染色病理切片顯示(圖2),與正常組比較,模型組脾小結(jié)變大,中央動脈周圍淋巴鞘炎細胞增生,炎性反應水腫導致組織疏松;與模型組比較,各治療組改善了炎細胞浸潤增生情況。

圖2 各組小鼠的脾組織形態(tài)學觀察(HE染色,光鏡下×40)

注：A正常組B模型組C氫化可的松組D HQGP低劑量組E HQGP中劑量組F HQGP高劑量組，↑指示中央動脈。

2.3 HQGP對CIA小鼠外周血Th1、Th2比例的影響 實驗結(jié)果如表1。與正常組比較,模型組小鼠外周血IFN-γ、IL-4比例升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療后,與模型組比較,HC組和HQGP低、中劑量組IFN-γ、IL-4比例降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時,表1還表明,HQGP低、中劑量組對比模型組,Th1降低的幅度大于Th2降低的幅度。

2.4 HQGP對T-bet、GATA-3蛋白表達的影響 利用Western blot檢測脾組織T-bet、GATA-3蛋白的表達。雜交結(jié)果如圖3所示,數(shù)據(jù)見表2。與正常組比較,CIA模型組T-bet、GATA-3表達升高(P<0.05);與模型組比較,HC組和HQGP低、中劑量組T-bet、GATA-3的表達降低(P<0.05),HQGP高劑量組T-bet、GATA-3表達降低,但差異無統(tǒng)計學意義。表2結(jié)果還顯示,HQGP低、中劑量組分別與模型組比較,T-bet降低幅度比GATA-3降低幅度大。

表1 HQGP對CIA小鼠外周血Th1、Th2比例的影響

注:與正常組比較，*P<0.05;與模型組比較，△P<0.05。

圖3 CIA小鼠脾組織T-bet、GATA-3蛋白Western blot

注：1-6泳道:正常組、模型組、HC組、HQGP低劑量組、HQGP中劑量組、HQGP高劑量組。

表2 CIA小鼠脾組織中T-bet與GATA-3蛋白的表達

注:與正常組比較，*P<0.05;與模型組比較，△P<0.05。

3 討論

目前,RA的病因、發(fā)病機制并不是十分清楚,為了更好地研究RA的病因、發(fā)病機制及其治療方法,國內(nèi)外眾多學者成功建立了許多與人類RA類似的動物模型。如AA模型、CIA模型,其中CIA模型是類風濕性關(guān)節(jié)炎常用的經(jīng)典動物模型。在建立模型的過程中,動物品系、注射部位、手法、注射劑量以及膠原是否充分混勻、乳化是否完全,都會影響到CIA造模的成功率。本研究采用的是近交系BALb/c雄性小鼠,選取小鼠尾根部皮內(nèi)注射,進行2次免疫,兩次免疫時間間隔21 d,根據(jù)對CIA小鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分、關(guān)節(jié)腫脹程度的評測,結(jié)果顯示,CIA小鼠病變癥狀明顯。

隨著對RA發(fā)病機制的深入研究,不斷出現(xiàn)越來越多的治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的藥物,但始終沒有比較讓人滿意的治療方法,中藥類治療藥物作為天然藥物,具有整體調(diào)理、減輕不良反應的優(yōu)勢。其有效成分在治療RA中表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。有研究顯示,五藤湯辨證加減療法對于類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療具有顯著的臨床療效,且治療靈活性高,不良反應少[7]。由陽和湯化裁而來的補腎通督膠囊可明顯改善腎虛寒凝型RA患者Th1/Th2的比例失衡[8]。益氣活血解毒方能夠通過調(diào)控RA外周血T淋巴細胞的增殖和分化,維持體內(nèi)自身免疫應答的穩(wěn)態(tài),抑制炎性反應的發(fā)生,緩解因免疫炎性反應造成的關(guān)節(jié)損傷,這可能是該方治療RA的關(guān)鍵作用機制[9]。姜黃素衍生物FM0807對佐劑性類風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠有較好療效[10]。蠲痹顆粒對膠原誘導性小鼠關(guān)節(jié)炎具有防治作用[11]。健脾化濕通絡中藥新風膠囊可改善AA大鼠踝關(guān)節(jié)病理組織學損傷程度[12]。風濕寧膠囊可調(diào)節(jié)CIA大鼠炎性反應因子的分泌,恢復Th1/Th2的平衡[13]。黃芩莖葉總黃酮能夠一定程度上減輕CIA小鼠的炎性反應癥狀,調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞平衡[14]。

黃芪,屬補氣類中藥,其在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、延緩衰老等方面都表現(xiàn)出活性,具有調(diào)節(jié)免疫等諸多藥理作用[15]。氫化可的松是臨床療效確切的常用藥物,具有抗炎和免疫抑制作用,所以選為陽性對照藥。在本文中,我們成功復制了小鼠CIA模型,研究HQGP發(fā)揮免疫抑制作用的可能途徑及其效果。

免疫功能紊亂的研究一直占據(jù)第一位,被認為是RA發(fā)生的主要發(fā)病機制之一,T細胞介導的自身免疫應答反應在RA的發(fā)病機制中起到重要作用。

Th1和Th2細胞均來自初始T細胞(Naive T cell,Tn),Tn在不同的細胞因子微環(huán)境下通過激活Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導子與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus Kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription,JAK/STAT)信號轉(zhuǎn)導通路,分別活化下游各自的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子T-bet(T-box Expressed in T cells)和GATA-3(GATA-binding Protein-3),繼而誘導Tn分化為Th1、Th2亞群。T-bet和GATA-3分別作為特異性調(diào)控Th1和Th2分化的轉(zhuǎn)錄因子彼此之間相互調(diào)節(jié)。Th1細胞主要分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α等細胞因子,其中IFN-γ是Th1細胞特征性細胞因子,具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用。Th2主要產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細胞因子,其中IL-4是Th2細胞分泌的特征抗炎性反應細胞因子,它可抑制滑膜巨噬細胞和Th1、Th17細胞合成炎性反應細胞因子及抑制血管新生,還具有保護軟骨作用[16]。

很多研究表明,在RA患者中Th1明顯增多并占優(yōu)勢,促炎性反應Th1細胞及其分泌的IFN-γ與抗炎性反應Th2細胞及其分泌的IL-4之間的失衡在RA發(fā)病機制中具有重要作用[17]。在以Th1反應為主的炎性反應晚期往往會有逐漸增強的Th2反應出現(xiàn),其作用是阻止Th1反應介導損傷。劉喜德等實驗結(jié)果提示淋巴細胞表達Th1表型可能是CIA起始疾病的關(guān)鍵步驟,在CIA的進展期,是以IFN-γ水平升高的Th1類細胞增多為主,而IFN-γ表達升高可能與疾病的嚴重性相關(guān),說明CIA大鼠外周血存在Th1/Th2失衡[18]。郭明等應用流式細胞術(shù)從細胞水平也證實了Th1細胞和Th2細胞參與RA整個病程的演變,不同時期CIA小鼠體內(nèi)二者呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律,發(fā)病早期Th2細胞并不能抑制增多的Th1細胞,不足以抵制CIA惡化,至病情進展到中期和晚期Th2細胞開始有所升高抑制CIA病情發(fā)展,使RA癥狀趨于穩(wěn)定[19]。

任舒婷等通過檢測RA患者外周血及關(guān)節(jié)液中IL-4、IL-6、IFN-γ等表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA患者外周血和關(guān)節(jié)液中IL-4和IFN-γ水平均比正常對照組高,Th1/Th2的失衡引起RA炎性反應性損傷,其誘導的免疫性炎性反應是主要表現(xiàn)[20]。

實驗結(jié)果顯示,CIA組小鼠的脾細胞中T-bet、GATA-3表達明顯增高,與正常組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);相應的CIA組外周血IFN-γ、IL-4的比例也升高,與正常組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),即外周血中Th1、Th2的比例增大,與特異性轉(zhuǎn)錄因子呈現(xiàn)出相同的變化趨勢。T-bet表達的增高,促使Tn向Th1轉(zhuǎn)化,外周血中Th1比例增高;同理GATA-3表達的增高,部分Tn也向Th2轉(zhuǎn)化,外周血中Th2比例也增高。但T-bet與Th1的增高幅度均大于GATA-3與Th2的增高。說明造模后CIA小鼠Th1分泌炎性反應細胞因子占優(yōu)勢,機體抵抗炎性反應發(fā)生自然也同時提高Th2分泌抗炎因子,但增加的幅度遠不及Th1,致使機體患病,表現(xiàn)CIA病癥。

本實驗中CIA小鼠經(jīng)HQGP治療后,脾細胞中T-bet、GATA-3的表達降低,外周血中Th1、Th2的比例也相應降低,與模型組比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。脾組織中轉(zhuǎn)錄因子表達的變化同樣與外周血中Th1、Th2的變化一致。與模型組比較發(fā)現(xiàn),HQGP治療組T-bet與Th1的降低幅度均大于GATA-3與Th2的降低,也說明HQGP的治療抑制了Th1的分化,同時其分泌的炎性反應細胞因子也減少。Th2沒有Th1降低的幅度大,使機體處于抗炎相對優(yōu)勢,癥狀好轉(zhuǎn)。本實驗是在第57天取材,即藥物治療了16 d,治療時間短,Th2還未完全占有優(yōu)勢,因此在與模型組比較時,仍然表現(xiàn)出降低。

本文表明,HQGP對于CIA小鼠的治療作用可能是通過不同程度的降低脾組織中T-bet、GATA-3的表達實現(xiàn)的,這樣初始Tn細胞分化為Th1、Th2均減少,但Th1、Th2降低的幅度明顯不同,抗炎細胞因子相對占優(yōu)勢,但還未完全糾正Th1、Th2細胞平衡紊亂。是否繼續(xù)延長HQGP的治療時間,HQGP的免疫調(diào)節(jié)作用是否還與其他相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和通路具有相關(guān)性還有待深入研究。

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(2016-07-07收稿 責任編輯：王明)

Effect of Astragalus Glycoproteins on T-bet and GATA-3 Expression in Mice Spleen with Collagen-induced Arthritis

Zhang Na1, Zhao Junyun1, Xue Huiqing2, Liu Hui1,Li Caicai1, Yang Xiangzhu1，Zhou Ran2

(1SchoolofBasicMedicalScience，BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 2ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Taiyuan030024,China)

Objective:To explore the effects of Astragalus glycoproteins on collagen-induced arthritis mice′s specific transcription factors, T-bet and GATA-3, expression, and to clarify the immune mechanism of Astragalus glycoprotein on the treatment in collagen-induced arthritis mice. Methods:CIA model was induced by bovine Ⅱcollagen in mice. Mice were randomly divided into a CIA model group, a hydrocortisone positive control group, a Astragalus glycoprotein low dose group, a middle dose group and a high dose group. HE was used to observe the CIA mice spleen tissues damage. IFN-γ and IL-4 level were measured with flow cytometry in CIA mice. Western blot was used to analyze T-bet and GATA-3 protein expression. Results:Compared with the model group, Astragalus glycoprotein improved spleen tissue damage in CIA mice, and inhibited the infiltration of inflammatory cells. Astragalus glycoprotein reduced IFN-γand IL-4 level (P<0.05) and T-bet and GATA-3 protein expression (P<0.05). Conclusion:The mechanisms of action of Astragalus glycoprotein on CIA mice may be related to the decrease of T-bet and GATA-3 expression and function balance of the Th1 and Th2 cells.

Astragalus glycoprotein；CIA；GATA-3；T-bet

國際科技合作專項(編號:2013DFA30700)

張娜(1987.11—),女,碩士研究生,研究方向:免疫藥理學方向,E-mail:zhangnaanna@126.com

楊向竹(1970.11—),女,博士,副教授,中醫(yī)學院實驗教學中心副主任,研究方向:中藥的現(xiàn)代物質(zhì)基礎,E-mail:xiangzhuy@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.05.039