濃縮型獸用雙黃連口服液的急性毒性及亞慢性毒性試驗

吳苑瀅　宋漫玲　谷俐嬡　楊劍　韋英益　胡庭俊

摘要：[目的]評價濃縮型獸用雙黃連口服液的用藥安全性，為其臨床用藥提供參考依據(jù)。[方法]以昆明系小鼠為試驗對象，通過開展?jié)饪s型獸用雙黃連口服液的急性毒性及亞慢性毒性試驗，確定其臨床應用的主要毒性作用及毒性作用靶器官。其中，急性毒性試驗設20.00、10.00、5.00、2.50和1.25g/kg5個劑量組，試驗開始當天在24h內分2-3次對小鼠進行灌胃給藥；最大耐受量試驗用藥劑量為240.00g/kg，試驗開始當天在24h內分2次對小鼠進行灌胃給藥，每次0.80mL/只；亞慢性毒性試驗設每天灌服0.16、0.08和0.04mL/只3個劑量組，連續(xù)灌胃給藥28d。[結果]急性毒性試驗小鼠灌胃給藥后30min內精神萎靡，安靜，呼吸變慢，但30mind恢復正常，未出現(xiàn)中毒癥狀和死亡現(xiàn)象，未能測出半數(shù)致死量（LD₅₀）。小鼠對濃縮型獸用雙黃連口服液的最大耐受量大于240.00g/kg。亞慢性毒性試驗期間，各用藥組小鼠的體重、臟器（肝臟、脾臟和。腎臟）指數(shù)和血清學指標（谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮和肌酐含量）與空白對照組相比均無顯著差異（P>0.05）；病理組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，僅高劑量組小鼠的肝臟有損傷，肝細胞有點狀壞死灶，肝細胞索凌亂，細胞界限模糊不清，細胞核著色減弱，其他臟器組織切片均無異常變化。[結論]濃縮型獸用雙黃連口服液對小鼠無急性毒性作用，長期連續(xù)用藥也無亞慢性毒性作用，安全性較高。

關鍵詞：小鼠；濃縮型獸用雙黃連口服液；急性毒性；最大耐受量；亞慢性毒性

中圖分類號：S853.74 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）11-2086-06

0引言

[研究意義]雙黃連是由金銀花、黃芩、連翹三味中藥精制而成的方劑，其主要功效是辛涼解表、清熱解毒（張志美等，2010；劉剛和趙華，2013）?！吨袊F藥典》規(guī)定：雙黃連口服可用于治療貓、犬和雞等動物的感冒發(fā)熱?，F(xiàn)代藥理學也研究證實，雙黃連具有抗病毒、抗菌抗炎和增強機體免疫力等多重功效。目前市面上已有的獸用雙黃連制劑包括口服液、注射液、顆粒劑、散劑和粉劑等（楊海涵等，2009），但隨著雙黃連在獸醫(yī)臨床上的推廣應用，上述制劑品種已無法滿足多樣化和個性化的臨床需求。因此，加強獸用雙黃連新劑型的研發(fā)對滿足各種臨床需求及促進其推廣應用具有重要意義。[前人研究進展]至今，有關雙黃連制劑在獸醫(yī)臨床上的應用已有較多報道。汪勇等（2006）通過母畜子宮內膜炎臨床治療試驗，發(fā)現(xiàn)雙黃連注射液對家畜無毒副作用，且能增強家畜抵抗力，是治療母畜子宮內膜炎的首選藥物。周翠珍等（2008）以不同劑量雙黃連可溶性粉劑對人工感染的雞傳染性支氣管炎進行預防和治療，結果表明，雙黃連可溶性粉劑防治雞傳染性支氣管炎的效果顯著。徐海瑛等（2012）研究表明，雙黃連口服液和青霉素G聯(lián)用對金黃色葡萄球菌的抑菌濃度指數(shù)（FIC）為0.125，二者對金黃色葡萄球菌的聯(lián)合藥敏結果呈協(xié)同作用。趙增成等（2014）通過對比9種中藥方劑對雞大腸桿菌病的防治效果，發(fā)現(xiàn)雙黃連口服液無論在體外或體內對大腸桿菌均具有一定的防治效果。關于雙黃連制劑的毒理學研究，解黎雯等（1999）研究表明，給小白鼠灌服雙黃連口服液的劑量達225g/kg時，小白鼠全部健康存活，且對體重、血液生化指標和主要臟器系數(shù)均無顯著影響；周德剛等（2011）通過急性毒性試驗證實，雙黃連口服液對小白鼠的最小致死量范圍為49.2～60.8g/b，相當于禽類臨床用量的111.8～138.2倍，即臨床應用具有一定安全性；賀一新等（2017）研究證實，雙黃連口服液（僅適用于兒童）濃縮膏對幼年大鼠全身臟器和組織無相關毒性作用，安全性較好。[本研究切入點]濃縮型獸用雙黃連口服液是本課題組針對雞風熱感冒研制而成，臨床用藥試驗證實給藥后3～5d病雞精神狀態(tài)明顯好轉且咳嗽減少，給藥后11d病雞各方面逐漸恢復正常，治療效果明顯，但目前關于濃縮型獸用雙黃連口服液的毒理學研究尚無文獻報道。[擬解決的關鍵問題]通過開展?jié)饪s型獸用雙黃連口服液的急性毒性及亞慢性毒性試驗，確定其臨床應用的主要毒性作用及毒性作用靶器官，并評價用藥安全性，為濃縮型獸用雙黃連口服液的臨床用藥提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

濃縮型獸用雙黃連口服液為河南牧翔動物藥業(yè)有限公司的中試產品（100mL/瓶），生產批號20140208，規(guī)格3.0g/mL；谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮、肌酐檢測試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；昆明系小鼠（15.00～22.00g/只）購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，雌雄各半。主要儀器設備有AidaTD-5A臺式低速離心機、CD-UPT-1純水儀、AB104-L分析天平（瑞士梅特勒）、ALPHARA-8旋轉蒸發(fā)儀、UV-1800型紫外可見分光光度計、DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋和尼康YS100生物顯微鏡等。

1.2急性毒性試驗

首先進行預試驗，將20只小鼠隨機分成5組，每組4只，分籠飼養(yǎng)。濃縮型獸用雙黃連口服液設A（20.00g/kg）、B（10.00g/kg）、C（5.00g/kg）、D（2.50g/kg）和E（1.25g/kg）5個劑量組，于試驗開始當天在24h內分2～3次對小鼠進行灌胃給藥。連續(xù)觀察7d，詳細記錄小鼠的飲食、飲水變化及有無中毒或死亡現(xiàn)象出現(xiàn)。給藥第8d將全部供試小鼠頸椎脫臼處死，解剖觀察其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和腸道等器官有無異常變化。若預試驗有小鼠死亡，則按死亡組給藥劑量估計死亡率靠近0和100%的劑量范圍，為急性毒性試驗的正式試驗提供依據(jù)。若預試驗無小鼠死亡，則需進行藥物的最大耐受量試驗。采用寇氏法計算供試藥物的半數(shù)致死量（LD₅₀）及95%可信限范圍。

1.3最大耐受量試驗

隨機挑選20只小鼠（小鼠給藥體重均按20.00g/只計），給藥劑量240.00g/kg，于試驗開始當天在24h內分2次對小鼠進行灌胃給藥，每次0.80mL/只。給藥后24h內觀察小鼠是否發(fā)生中毒反應，隨后每日觀察小鼠的飲食、精神狀態(tài)、自主活動、糞便情況等1～2次，并做好記錄。連續(xù)觀察7d，試驗期間保持各飼養(yǎng)管理條件一致。給藥第8d將全部供試小鼠頸椎脫臼處死，解剖觀察其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和腸道等器官有無異常變化。

1.4亞慢性毒性試驗

將80只小鼠隨機分為4組，每組20只（雌雄各半），分籠飼養(yǎng)，每籠10只。根據(jù)急性毒性試驗和最大耐受量試驗結果分別設空白對照組及高劑量組（24.00g/kg）、中劑量組（12.00g/kg）和低劑量組（6.00g/kg）。高劑量組小鼠每天灌胃給藥0.16mL/只，中劑量組小鼠每天灌胃給藥0.08mL/只，低劑量組小鼠每天灌胃給藥0.04mL/只；空白對照組小鼠自由飲水。連續(xù)用藥28d。每日觀察小鼠的一般健康狀態(tài)，包含采食與飲水、活動、發(fā)病及死亡情況等。第1次給藥前稱重，此后每7d稱重一次，共5次。第29路組小鼠稱重、眼眶采血后頸椎脫臼處死，對處死小鼠進行全面檢查，采集其肝臟、脾臟和腎臟稱重并記錄，計算肝臟、脾臟和腎臟指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器重（mg）/體重（g）。經小鼠眼眶采集的血液先進行白細胞總數(shù)計數(shù)（n=80），同時離心收集血清，-20℃保存或按相關檢測試劑盒說明測定小鼠血清中的谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮和肌酐含量。采集的肝臟、脾臟和腎臟稱重后，以10%中性福爾馬林固定，用于制作組織切片。

1-.5統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0進行方差分析和多重比較。

2結果與分析

2.1急性毒性試驗結果

急性毒性試驗觀察發(fā)現(xiàn)，灌胃給藥后30min內小鼠精神萎靡，安靜，呼吸變慢，30min后精神狀態(tài)恢復正常，可采食飲水；24h內小鼠未出現(xiàn)中毒癥狀。連續(xù)觀察7d，所有小鼠的食欲、精神狀態(tài)及采食、飲水、排便等活動正常，無中毒癥狀和死亡現(xiàn)象出現(xiàn)。經剖檢觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、胃、腸道等主要臟器無異常變化。因無小鼠死亡，未能計算出濃縮型獸用雙黃連口服液的LD₅₀，而需進行最大耐受量試驗以檢驗藥物安全性。

由表1可看出，灌服不同劑量濃縮型獸用雙黃連口服液后，小鼠的體重均有所增長，但各劑量組間差異不顯著（P>0.05，下同）；各劑量組小鼠的平均增重范圍為4.57～6.19g/只，增重率為21.42%～29.01%，組間差異均不顯著。

2.2最大耐受量試驗結果

在最大耐受量試驗期間，小鼠也未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，灌胃給藥后30min內小鼠精神萎靡，不愿動，呼吸變慢，30min后精神狀態(tài)恢復正常，可采食飲水；24h內小鼠未出現(xiàn)中毒癥狀。連續(xù)觀察7d，均無中毒癥狀和死亡現(xiàn)象出現(xiàn)，所有小鼠的食欲、精神狀態(tài)及采食、飲水、排便等活動正常。給藥后第8d剖檢觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、胃、腸道等臟器均未出現(xiàn)任何肉眼可見的特征性病理變化。在體重增重方面，小鼠平均增重2.92g/只，增重率為13.45%。根據(jù)藥物毒理學評價標準判定，當藥物LD₅₀>5g/kg時，該藥物屬于實際無毒性物質。本研究中，濃縮型獸用雙黃連口服液的最大耐受量試驗口服劑量達240.00g/kg，小鼠仍健康存活，表明濃縮型獸用雙黃連口服液對小鼠的安全性很高。

2.3亞慢性毒性試驗

2.3.1臨床表現(xiàn) 在亞慢性毒性試驗期間，3個藥物劑量組小鼠活動自如，排泄物無異常，正常飲食，未見異常行為，也未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。在體重增重方面，3個用藥組小鼠的體重變化趨勢與空白對照組基本一致，各處理組間均無顯著差異（圖1）。

2.3.2臟器指數(shù) 剖檢觀察發(fā)現(xiàn)，各處理組小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟的形態(tài)、顏色、質地均正常，無明顯的肉眼可見病變。中、高劑量組小鼠的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)略高于空白對照組（表2），但差異不顯著，說明經胃灌服濃縮型獸用雙黃連口服液不會導致小鼠實質臟器損傷或異常變化。

2.3.3血清生化指標 連續(xù)給藥28d后，小鼠血清中的谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮和肌酐含量隨給藥劑量的增加呈逐漸上升趨勢，但與空白對照組相比差異均不顯著（表3）；白細胞計數(shù)結果也表明，高、中、低劑量組小鼠的白細胞數(shù)與空白對照組相比差異均不顯著。說明經胃灌服濃縮型獸用雙黃連口服液對小鼠的白細胞及肝臟、腎臟功能均未產生明顯影響。 2.3.4臟器組織形態(tài)結構 取各處理組小鼠的肝臟、脾臟和腎臟制作病理組織切片，經HE染色后，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，高劑量組小鼠的肝臟有損傷，肝細胞有點狀壞死灶，肝細胞索凌亂，細胞界限模糊不清，細胞核著色減弱（圖2和圖3）；中、低劑量組小鼠的肝臟組織切片未見異常病理變化。各處理組小鼠腎臟組織切片中腎小管、腎小球輪廓清晰可辨，無顆粒變性或明顯的炎癥變化；脾臟組織切片中紅髓、白髓和脾小體清晰，也無明顯的病理變化。說明長期灌服濃縮型獸用雙黃連口服液的用藥劑量達24.00g/kg時，會影響小鼠肝臟組織形態(tài)結構，即肝細胞受到一定程度的損傷。

3討論

雙黃連具有抗病毒、抗菌、抗炎癥、調節(jié)免疫等多重功效（程慧等，2011；劉剛和趙華，2013），尤其對乙型鏈球菌、藤黃微球菌、大腸桿菌、肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等有很強的殺菌或抑菌作用（楊海涵等，2009），在臨床上多用于治療呼吸、消化和泌尿系統(tǒng)疾病，且療效顯著（董文剛，2010）。本研究結果表明，經胃灌服濃縮型獸用雙黃連口服液的小鼠生長發(fā)育良好，無論是雌性還是雄性，其體重均能保持穩(wěn)定的增長趨勢，與空白對照組相比無顯著差異；連續(xù)給藥28d后，小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟的形態(tài)、顏色和質地均正常，無明顯的肉眼可見病變，其肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)與空白對照組的差異也不顯著。血液白細胞數(shù)量增加通常見于感染、應激（手術、創(chuàng)傷等）和急性慢性白血病等。本研究的亞慢性毒性試驗結果表明，高、中、低劑量組小鼠的白細胞數(shù)與空白對照組相比差異不顯著，進一步說明濃縮型獸用雙黃連口服液對小鼠的安全性很高。

谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮和肌酐4項血清學生化指標在獸醫(yī)毒理學研究中主要用于測定肝膽腎功能。谷丙轉氨酶又稱谷氨酸轉氨酶或丙氨酸氨基轉移酶，其含量升高可能預示著肝臟發(fā)生異常變化，如肝損傷和各類肝炎等。本研究通過檢測谷丙轉氨酶含量能了解濃縮型獸用雙黃連口服液對小鼠肝臟的損傷情況。谷草轉氨酶也是預示肝功能異常的指標，且與動物體內的蛋白代謝密切相關。當機體肝臟損傷必然導致血清中的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶上升（呂瓊霞等，2011）。肌酐分為血清肌酐和尿肌酐，是評價腎功能的主要指標之一（李海霞等，2006）。血清肌酐含量較高時表明腎功能出現(xiàn)問題，腎臟代謝能力降低，致使某些有害毒素無法正常排出體外。腎功能受損時常見尿素氮等指標上升，因此尿素氮也是評價腎小球濾過的主要指標之一（萬貞元等，2014）。本研究的亞慢性毒性試驗結果顯示，連續(xù)給藥28d后，各劑量組小鼠血清中的谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮、肌酐含量與空白對照組相比差異均不顯著，表明濃縮型獸用雙黃連口服液對小鼠的肝臟、腎臟功能無不良影響。

本研究還采集小鼠的肝臟、脾臟和腎臟制作病理組織切片，經HE染色后，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)僅高劑量組小鼠的肝臟有損傷，肝細胞有點狀壞死灶，肝細胞索凌亂，細胞界限模糊不清，細胞核著色減弱，其他臟器組織切片均無異常變化，其原因可能是長期灌服高劑量（24.00g/kg）濃縮型獸用雙黃連口服液會對小鼠肝臟細胞造成輕微損傷。但綜合其他試驗結果，認為濃縮型獸用雙黃連口服液對小鼠仍具有較高的安全性。

4結論

濃縮型獸用雙黃連口服液對小鼠無急性毒性作用，長期連續(xù)用藥也無亞慢性毒性作用，安全性較高。

（責任編輯蘭宗寶）