柑橘品種莖段離體培養(yǎng)條件的優(yōu)化及微芽嫁接試驗(yàn)

吳思夢　劉冰　蔣軍喜　陳椿松　熊磊　周英　鄢明峰

摘要：[目的]優(yōu)化柑橘品種莖段離體培養(yǎng)條件并開展微芽嫁接（試管內(nèi)莖尖嫁接）試驗(yàn)，為培育無毒柑橘組培種苗提供參考依據(jù)。[方法]對溫州蜜柑和紐荷爾臍橙成年態(tài)枝條進(jìn)行不同濃度HgCl₂和NaClO消毒，篩選適宜組培利用的柑橘外植體消毒方式、采集季節(jié)及激素配比；開展嫁接砧木種子消毒和微芽嫁接試驗(yàn)，分析兩個(gè)柑橘品種微芽嫁接的萌發(fā)狀況。[結(jié)果]溫州蜜柑外植體的最適消毒方法為70%酒精+1.0‰HgCl₂消毒6min處理兩次；紐荷爾臍橙外植體的最佳消毒方法為70%酒精+15.0%NaClO處理兩次；采集成年態(tài)柑橘莖段進(jìn)行離體培養(yǎng)的最佳時(shí)期為夏季；在MS固體培養(yǎng)基中添加1.0mg/L6-芐氨基嘌呤（6-BA）和0.1mg/L萘乙酸（NAA）均有利于兩個(gè)柑橘品種外植體腋芽萌發(fā)。砧木種子最適消毒方法為剝?nèi)?nèi)外種皮+70%酒精+1.5%NaClO溶液處理；兩個(gè)柑橘品種微芽嫁接的萌發(fā)率較低，分別為10.00%和6.67%，但嫁接成功后柑橘苗長勢良好。[結(jié)論]于夏季剪取溫州蜜柑和紐荷爾臍橙成年態(tài)枝條帶芽莖段，分別經(jīng)70%酒精+1.0‰HgCl₂消毒6min處理兩次、70%酒精+15.0%NaClO處理兩次，在添加1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA的MS固體培養(yǎng)基中接種，可獲得最佳的培養(yǎng)效果。利用微芽嫁接技術(shù)嫁接的柑橘苗長勢良好，可在提高其嫁接萌發(fā)率基礎(chǔ)上推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：溫州蜜柑；紐荷爾臍橙；外植體消毒；微芽嫁接

中圖分類號(hào)：S666.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）11-2034-05

0引言

[研究意義]我國柑橘生產(chǎn)規(guī)模較大，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，但近年來柑橘病害日益加重。世界上已報(bào)道的柑橘病毒和類病毒超過40種，嚴(yán)重影響柑橘產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，而微芽嫁接（試管內(nèi)莖尖嫁接）技術(shù)可脫除柑橘中的多種病害（劉科宏等，2016）。Mu-rashinge等（1972）創(chuàng)立了微芽嫁接技術(shù)，即利用莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合嫁接技術(shù)獲得無菌苗。莖尖組織培養(yǎng)是微芽嫁接的前期工作，但目前柑橘成年態(tài)莖段組織培養(yǎng)技術(shù)尚未成熟，組培過程中莖段污染率高且受季節(jié)影響，芽體增殖分化受激素影響，制約了相關(guān)生物技術(shù)在柑橘生產(chǎn)上的應(yīng)用（鄧才生等，2009；喬芬等，2011）。因此，優(yōu)化柑橘莖段離體培養(yǎng)條件并開展微芽嫁接試驗(yàn)，對提高柑橘莖尖組織培養(yǎng)效率及發(fā)展柑橘產(chǎn)業(yè)具有重要意義。[前人研究進(jìn)展]鄧才生等（2009）研究認(rèn)為，使用1‰HgCl₂對柑橘外植體消毒可獲得理想的消毒效果；李麗（2014）研究發(fā)現(xiàn)，使用5%和10%NaClO對柑橘外植體進(jìn)行消毒可獲得較理想的消毒效果。在促進(jìn)腋芽萌發(fā)方面，陳澤雄等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，柑橘莖段在添加1.0mg/L6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.2mg/L萘乙酸（NAA）的培養(yǎng)基中腋芽萌發(fā)率更高；周海霞（2010）研究認(rèn)為，培養(yǎng)基中添加1.0mg/L6-BA+0.5mg/L吲哚丁酸（IBA）+0.5mg/LGA3更有利于紅江橙腋芽萌發(fā)；李麗（2014）研究發(fā)現(xiàn)，1.0mg/L6-BA+0.5mg/L吲哚-3-乙酸（IAA）+1.0mg/L赤霉素（GA3）更有利于柑橘腋芽萌發(fā)。在柑橘嫁接萌芽方面，羅君琴等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，柑橘的嫁接萌發(fā)率為0-20%；隆雨薇（2015）研究認(rèn)為，柑橘試管內(nèi)嫁接萌發(fā)率較低，僅4.5%，不同品種問存在差異，嫁接萌發(fā)率亟待提高。[本研究切入點(diǎn)]目前，針對篩選紐荷爾臍橙和溫州蜜柑莖段組織離體培養(yǎng)最佳消毒方法、采集時(shí)期及培養(yǎng)基中激素配比培育優(yōu)質(zhì)柑橘脫毒苗的研究報(bào)道較少，且柑橘微芽嫁接后嫁接苗萌發(fā)率較低，關(guān)于溫州蜜柑和紐荷爾臍橙微芽嫁接的研究也鮮見報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問題]以溫州蜜柑和紐荷爾臍橙的成年態(tài)莖段（半木質(zhì)化新梢）為外植體，篩選適合其消毒的最佳方法、最佳采集時(shí)期及培養(yǎng)基中的激素配比，開展嫁接砧木種子消毒和微芽嫁接試驗(yàn)，為培育優(yōu)質(zhì)柑橘無菌苗木提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2016年5月在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院進(jìn)行。供試溫州蜜柑和紐荷爾臍橙的成年態(tài)莖段均采自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)園，砧木為檸檬種子。試劑：70%酒精、NaClO溶液（1.5%、5.0%、10.0%和15.O%）、1.0‰HgCl₂、蔗糖、瓊脂粉、6-BA、NAA、MS培養(yǎng)基、MT培養(yǎng)基。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1外植體采集 于晴天14：00，剪取柑橘植株無病蟲害、半木質(zhì)化夏梢，裝入潔凈塑料袋帶回實(shí)驗(yàn)室。剪去葉片，經(jīng)自來水沖洗后先用洗衣粉浸泡10min，再用自來水沖洗10min。將枝條剪成8cm長的帶芽莖段。

1.2.2外植體消毒及培養(yǎng) 分別采用5種方法對柑橘莖段進(jìn)行消毒處理。其中方法A、B和C為70%酒精處理1min→（15.0%、10.0%和5.0%）NaClO滅菌20min→無菌水沖洗→放置48h→（15.0%、10.0%和5.0%）NaClO消毒30min→無菌水沖洗；方法D和E為70%酒精處理1min→1.0‰HgCl2₂消毒（3和6min）→無菌水沖洗_÷放置48h→1.0‰HgCl₂消毒（3和6min）→無菌水沖洗。經(jīng)消毒的莖段插入MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基添加30.0g/L蔗糖、7.0g/L瓊脂和1.0mg/L6-BA。培養(yǎng)條件：溫度（26+1）℃，光暗周期12h/12h。兩個(gè)柑橘品種的每處理均使用30條外植體，3次重復(fù)。培養(yǎng)10d后統(tǒng)計(jì)萌芽率和污染率。

萌芽率（%）=萌芽且未污染數(shù)/總腋芽數(shù)×100

污染率（%）=污染數(shù)/總腋芽數(shù)x100

1.2.3外植體采集季節(jié)篩選 分別剪取溫州蜜柑和紐荷爾臍橙的春梢（4～6月）、夏梢（7～8月）和秋梢（9～10月），按照1.2.1方法采集帶芽莖段并分別按照

1.2.2中的方法E和方法A進(jìn)行消毒和培養(yǎng)，10d后統(tǒng)計(jì)污染率。不同時(shí)期采集的每品種莖段30條，3次重復(fù)。

1.2.4激素配比篩選 分別將最優(yōu)消毒方法消毒的兩個(gè)柑橘品種莖段接種于下列含不同激素配比的MS固體培養(yǎng)基（表1）中，每處理均接種30條莖段，3次重復(fù)。12d后統(tǒng)計(jì)外植體的出芽數(shù)。

1.2.5砧木種子消毒與培養(yǎng) 微芽嫁接前需培育無菌砧木苗。選取充實(shí)飽滿的檸檬種子分別進(jìn)行A、B、C和D消毒處理，A為70%酒精處理30s→1.5%NaCl0溶液處理20min→無菌水清洗；B為剝?nèi)ネ夥N皮+70%酒精處理30s→1.5%NaClO溶液處理20min→剝?nèi)?nèi)種皮→無菌水清洗；C為70%酒精處理30s→1.0‰HgCl₂處理10min→無菌水清洗；D為剝?nèi)ネ夥N皮→70%酒精處理30s→1.0‰HgCl₂處理10min→剝?nèi)?nèi)種皮→無菌水清洗。

種子消毒后置于MT固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度（264-1）℃、暗培養(yǎng)。每處理50粒種子，3次重復(fù)。14d后統(tǒng)計(jì)種子的污染率和發(fā)芽率。

污染率（%）=污染種子數(shù)/接種種子總數(shù)×100

發(fā)芽率（%）=萌芽且未污染種子數(shù)/接種種子總數(shù)×100

1.2.6微芽嫁接試驗(yàn)取 1.2.4中最佳激素配比培養(yǎng)基培養(yǎng)的兩個(gè)柑橘品種外植體的萌芽各30個(gè)，分別與1.2.5中培養(yǎng)成功的砧木進(jìn)行微芽嫁接，嫁接后的試管苗置于液體嫁接培養(yǎng)基MT中，培養(yǎng)基中加入75.0g/L蔗糖，用濾紙橋支撐嫁接苗在試管中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度（26±1）℃、光暗周期16h/8h。觀察嫁接苗生長情況及萌發(fā)率。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以Dun-cans法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1不同外植體消毒方法的消毒效果比較

由表2可知，溫州蜜柑和紐荷爾臍橙外植體的最適消毒方法明顯不同。其中，溫州蜜柑外植體經(jīng)兩次1.0‰HgCl2消毒6min（E方法）的污染率最低，為20.21%，萌芽率最高，為64.62%；減少HgCl2消毒時(shí)間（D方法）的溫州蜜柑外植體污染率顯著升高（P<0.05，下同），萌芽率顯著降低；溫州蜜柑外植體經(jīng)NaClO消毒（A、B和c方法）的污染率顯著高于HgCl2消毒6min，說明溫州蜜柑外植體消毒應(yīng)選擇用兩次1.0‰HgCl₂消毒6min。經(jīng)兩次15.0%NaClO消毒（A方法）的紐荷爾臍橙外植體污染率為19.08%，與HgCl2消毒6min的污染率差異不顯著（P>0.05），萌芽率顯著高于HgCl₂消毒6min；隨著NaClO濃度的下降（B和C方法），污染率顯著升高，萌芽率顯著降低，說明紐荷爾臍橙外植體消毒方式應(yīng)選擇15.0%NaClO消毒兩次。

2.2不同外植體采集季節(jié)對消毒效果的影響

表3結(jié)果表明，溫州蜜柑和紐荷爾臍橙的外植體消毒效果均受季節(jié)影響。溫州蜜柑夏梢的污染率為20.21%，顯著低于春梢的33.57%和秋梢的29.67%；紐荷爾臍橙夏梢的污染率（19.08%）也顯著低于春梢（38.75%）和秋梢（39.49%）。說明夏季采集的外植體消毒效果更理想，更有利于組織培養(yǎng)。理的出芽數(shù)顯著高于其他兩個(gè)6-BA濃度處理，說明6-BA誘導(dǎo)芽體萌發(fā)的最佳濃度為1.0mg/L；不同濃度NAA對芽體萌發(fā)的影響差異較小，其中，6-BA濃度為1.0mg/L時(shí)，0.1、0.5和1.0mg/LNAA處理的出芽數(shù)差異不顯著。

2.3不同激素配比對外植體萌芽效果的影響

由表4可知，6-BA和NAA濃度分別為1.0和0.1mg/L時(shí)，兩個(gè)柑橘品種外植體腋芽的萌芽情況最佳，溫州蜜柑和紐荷爾臍橙的出芽數(shù)分別為3.72和3.59個(gè)；NAA濃度為0.1mg/L時(shí)，1.0mg/L6-BA處

2.4不同消毒方法對砧木種子萌發(fā)的影響

由表5可知，剝?nèi)?nèi)外種皮、用1.5%NaClO消毒（B方法）的砧木種子污染率為3.47%，發(fā)芽率為96.30%，未剝?nèi)?nèi)外種皮、用1.5%NaClO溶液消毒（A方法）的砧木種子污染率為5.56%，發(fā)芽率為89.19%，兩種消毒方法的污染率和發(fā)芽率均存在顯著差異，說明剝?nèi)シN子的內(nèi)外種皮能解除休眠，有效促進(jìn)種子萌發(fā)；HgCl2消毒雖可獲得更低的污染率，但發(fā)芽率也更低。因此，柑橘嫁接砧木種子的最適消毒方法為剝?nèi)?nèi)外種皮，并使用1.5%NaClO溶液消毒。

2.5微芽嫁接結(jié)果

兩個(gè)柑橘品種進(jìn)行微芽嫁接各30株，其中，溫州蜜柑嫁接成功3株，萌發(fā)率為10.00%；紐荷爾臍橙嫁接成功2株，萌發(fā)率為6.67%，兩個(gè)品種的萌發(fā)率均偏低。嫁接成功后1個(gè)月，嫁接苗葉片展開，嫁接后2個(gè)月，多數(shù)葉片展開，生長情況良好（圖1）。

3討論

成年態(tài)柑橘莖段攜帶有大量微生物，進(jìn)行組織培養(yǎng)后易產(chǎn)生污染，找尋適當(dāng)?shù)南痉椒ń档屯庵搀w污染率是進(jìn)行后續(xù)組培研究的前提。多數(shù)文獻(xiàn)指出，使用最佳消毒方法對柑橘成年態(tài)外植體進(jìn)行消毒，其污染率仍達(dá)10%～30%（徐定華等，2007；Shok-rollahetal，2009；胡選萍和陳志遠(yuǎn)，2014；HilfandLewis，2016）。本研究中，兩個(gè)柑橘品種外植體均進(jìn)行兩次消毒，第1次消毒時(shí)，部分微生物未被徹底殺死，放置48h后，多數(shù)菌體萌發(fā)，但在第2次消毒中被殺死，有效提高了消毒效果；紐荷爾臍橙莖段使用10%NaClO溶液消毒，污染率為23.52%，與王子成等（2005）對臍橙莖段進(jìn)行滅菌的污染率（24.88%）相近。羅君琴等（2007）研究認(rèn)為，溫州蜜柑外植體使用HgCl₂消毒時(shí)間過短則滅菌效果不佳，污染率較高，影響萌芽；滅菌時(shí)間超過6min，消毒液的毒害作用會(huì)導(dǎo)致萌芽率下降，以滅菌6min的效果較佳，萌芽率為57.5%。本研究結(jié)果與其相似，經(jīng)HgCl₂消毒6min的溫州蜜柑外植體萌芽率為64.62%。

本研究結(jié)果表明，外植體采集季節(jié)對污染率有較大影響，以夏季采集莖段的消毒效果最佳，溫州蜜柑污染率僅20.21%，紐荷爾臍橙污染率僅19.08%，低于李麗（2014）對夏季柑橘外植體消毒后的污染率（30.0%）。江西省春季溫暖且濕度較大，有利于微生物生長繁殖；夏季溫度高，干燥炎熱，微生物活力下降、數(shù)量減少；秋季溫度適宜，微生物又快速繁殖，因此，采集柑橘莖段進(jìn)行離體培養(yǎng)的最佳時(shí)期應(yīng)為夏季。在組織培養(yǎng)過程中，誘導(dǎo)成年態(tài)柑橘莖段萌芽存在一定難度，培養(yǎng)基中的激素配比對外植體萌發(fā)有一定影響（WuandXia，2005）。6-BA可促進(jìn)芽的生長分化，如陳澤雄等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基中添加1.0mg/L6-BA的柑橘莖段平均出芽數(shù)最多；李凱等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，NAA和6-BA的良好配比能使芽的分化效果達(dá)到最佳，1.0mg/L6-BA與0.2mg/LNAA配比下化州橘紅莖段的出芽數(shù)為3.0個(gè)。本研究中，在MS培養(yǎng)基中添加1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA的溫州蜜柑和紐荷爾臍橙莖段出芽數(shù)最多，分別為3.72和3.59個(gè)，與陳澤雄等（2007）、李凱等（2011）的研究結(jié)果相似。

微芽嫁接是將不帶毒的莖尖分生組織嫁接到不帶毒的砧木苗上進(jìn)行試管培養(yǎng)以獲得無毒苗木的一項(xiàng)嫁接技術(shù)，可解決組培苗生根難、生長慢等問題，其前提是需培育無菌砧木（陳洪明等，2014）。本研究中，微芽嫁接所用砧木為以新鮮檸檬種子經(jīng)脫去內(nèi)外種皮減少其萌發(fā)阻力，打破休眠，并使用NaClO消毒后培育而成，污染率較低，培養(yǎng)效果較佳，為微芽嫁接打下了基礎(chǔ)，與羅君琴等（2010）的研究結(jié)果相似。本研究中微芽嫁接成功率較低，溫州蜜柑和紐荷爾臍橙嫁接苗的萌發(fā)率僅分別為10.00%和6.67%，但嫁接成功后的柑橘苗長勢良好，與羅君琴等（2007）、隆雨薇（2015）的研究結(jié)果相似。因此，后續(xù)研究需重點(diǎn)解決微芽嫁接萌發(fā)率低的問題。

4結(jié)論

于夏季剪取溫州蜜柑和紐荷爾臍橙成年態(tài)帶芽莖段，分別經(jīng)70%酒精+1.0‰HgCl₂消毒6min處理兩次，70%酒精+15.0%NaClO處理兩次，在添加1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA的MS固體培養(yǎng)基中接種，可獲得較佳的培養(yǎng)效果。利用微芽嫁接技術(shù)嫁接的柑橘苗長勢良好，可在提高其嫁接萌發(fā)率基礎(chǔ)上推廣應(yīng)用。

（責(zé)任編輯思利華）