辣椒病毒病病原種類檢測(cè)初報(bào)

陳靈芝，張茹，魏兵強(qiáng)，王蘭蘭

摘要：針對(duì)甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所辣椒組育苗棚、試驗(yàn)地以及近郊辣椒種植田病毒病發(fā)病嚴(yán)重問(wèn)題，開展了病毒病病原種類鑒定，并比較了雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（DAS-ELISA）和簡(jiǎn)易試紙條對(duì)同一種病毒的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果檢測(cè)出了TMV、PVV和PVS 3種病毒，其中TMV為優(yōu)勢(shì)種群，侵染率高達(dá)66.7%，未發(fā)現(xiàn)CMV侵染。試驗(yàn)結(jié)果表明，DAS-ELISA法和簡(jiǎn)易試紙條法對(duì)同一種病毒檢測(cè)結(jié)果基本一致。

關(guān)鍵詞：辣椒；病毒；檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S436.418.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-1463（2017）11-0017-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2017.11.006

A Preliminary Report on Detection of Pathogenic Species of

Virus Disease in Pepper

CHEN Lingzhi， ZHANG Ru， WEI Bingqiang， WANG Lanlan

（Institute of Vegetables， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：We use DAS-ELISA method to indentify the pathogenetic virus and compare the result between DAS-ELISA and immunostrip. The result detects three virus： TMV、 PVV、 PVS， and TMV is the prevalent pathogenic virus， the detection rate is 66.7%. TMV is the daninatnt species， CMV isnt detected. The detection results between DAS-ELISA and immunostrip is almost accordance.

Key words：Pepper；Virus；Identification

辣椒病毒病是近年來(lái)危害辣椒生產(chǎn)的重要病害。植株一旦被病毒病感染，常表現(xiàn)為葉片皺縮、斑駁、黃化、花葉、壞死、畸形和植株矮化，且發(fā)病率極高，傳播迅速，易造成嚴(yán)重減產(chǎn)，產(chǎn)量損失在20%～70%[1 ]。近幾年來(lái)辣椒病毒病由原來(lái)的次要病害逐漸上升為主要病害，危害逐年加重，嚴(yán)重影響了辣椒的產(chǎn)量、品質(zhì)[2 - 3 ]。據(jù)報(bào)道，至少有45種病毒可侵染辣椒和甜椒，且多數(shù)國(guó)家以煙草花葉病毒（Tobacco mosaicvirus，TMV）和黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）侵染最為普 遍[4 - 7 ]。在我國(guó)已鑒定出病毒種類有15種，多數(shù)地區(qū)以TMV及CMV為優(yōu)勢(shì)種群。甘肅省近年來(lái)辣椒病毒病危害日趨嚴(yán)重，已逐漸上升為辣椒生產(chǎn)上的主要病害，對(duì)病毒病進(jìn)行準(zhǔn)確的診治是有效防控的前提。從2014年至今，我們?cè)诟拭C省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所辣椒組育苗棚、試驗(yàn)地以及近郊辣椒種植地均發(fā)現(xiàn)辣椒幼苗和成株疑似侵染病毒病，主要癥狀表現(xiàn)為幼苗從第1片真葉畸形，葉片皺縮、黃化，個(gè)別植株生長(zhǎng)點(diǎn)壞死。此后，隨著幼苗生長(zhǎng)及定植，癥狀有所緩解，在9、10月份，辣椒采收后期，葉片皺縮、黃化、畸形癥狀加重。在甘肅省辣椒主產(chǎn)區(qū)白銀、武威等地調(diào)研中也發(fā)現(xiàn)辣椒生產(chǎn)中有此類癥狀出現(xiàn)。

我們通過(guò)調(diào)查甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所辣椒育苗棚、試驗(yàn)地、近郊辣椒種植地病毒病發(fā)病情況，采集病樣，針對(duì)CMV、TMV、PVX、PVY、PVV、PVS、PVM、PVA等8種病毒，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（DAS-ELISA）、簡(jiǎn)易試紙條進(jìn)行檢測(cè)和鑒定，以明確辣椒病毒病的種類及優(yōu)勢(shì)種群，為病害的診斷、抗病育種和綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

2015 — 2016年在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所辣椒育苗棚、試驗(yàn)地和近郊辣椒種植地調(diào)查病毒病發(fā)生情況，并采集疑似病毒樣品77份。樣品保存于4 ℃冰箱中。

2015年3月在育苗棚采集病樣25份，2016年3月和9月在育苗棚、試驗(yàn)地、近郊辣椒種植地采集病樣47份，健康樣品5份，分別進(jìn)行CMV、TMV、PVX、PVY、PVV、PVS、PVM、PVA雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（DAS-ELISA）檢測(cè)和CMV、TMV簡(jiǎn)易試紙條檢測(cè)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（DAS-ELISA）

用于DAS-ELISA檢測(cè)的抗體及陽(yáng)性、陰性對(duì)照樣品為美國(guó)Agdia公司產(chǎn)品。取采集到的新鮮待測(cè)樣品按0.1 g/mL加入樣品抽提緩沖液中充分研磨，將樣品、陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照分別加入到酶聯(lián)板反應(yīng)孔中，室溫條件下于黑暗潮濕環(huán)境中孵育2 h。具體檢測(cè)步驟參照產(chǎn)品說(shuō)明書。

1.2.2 CMV、TMV簡(jiǎn)易試紙條檢測(cè) 購(gòu)自北京中檢葆泰生物技術(shù)有限公司代理的美國(guó)Agdia產(chǎn)品。抽取2016年3、9月份在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所育苗棚、試驗(yàn)地采集的16份中的11份，其中9份為病樣，2份無(wú)病癥的樣品作為陰性對(duì)照。具體檢測(cè)步驟參照產(chǎn)品說(shuō)明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀表現(xiàn)

在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所辣椒育苗棚、試驗(yàn)田、近郊辣椒種植地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，辣椒病毒病普遍發(fā)生。苗期發(fā)病時(shí)期可提前至第1片真葉，表現(xiàn)為葉片上卷、畸形。隨著苗齡的增大，癥狀有所緩解，植株4～5層新葉表現(xiàn)為健康。幼苗定植后，隨著抗性的提高及采用防控措施，病毒病病情進(jìn)一步得到緩解。在采收后期，伴隨蟲害，病毒病發(fā)病嚴(yán)重，癥狀也復(fù)雜多樣，諸如明脈、斑駁、花葉、皺縮、畸形、黃化、壞死和矮化等。

2.2 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（CMV、TMV、PVX、PVY、PVV、PVS、PVM、PVA）法檢測(cè)

在采集到的辣椒病樣中檢出TMV、PVV和PVS 3種病毒，其中TMV的總檢出率為66.7%，PVV為33.3%，PVS為10%，沒(méi)有檢出CMV。TMV和PVV復(fù)合侵染的檢出率為16%，TMV、PVV和PVS復(fù)合侵染的檢出率為3.6%。表明甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所辣椒育苗棚和近郊試驗(yàn)地侵染辣椒的主要病毒為TMV，為優(yōu)勢(shì)病毒種群。

2.3 簡(jiǎn)易試紙條檢測(cè)

從表2看出，在TMV檢測(cè)中，列出的11份樣品中有9份病樣DAS-ELISA TMV酶標(biāo)儀讀數(shù)均超過(guò)了陰性對(duì)照的2倍，且在酶標(biāo)板上呈現(xiàn)出明顯的顯色反應(yīng)，結(jié)果呈陽(yáng)性。對(duì)9份病樣進(jìn)行簡(jiǎn)易試紙條檢測(cè)，結(jié)果均呈陽(yáng)性，9份病樣DAS-ELISA檢測(cè)結(jié)果與簡(jiǎn)易試紙條檢測(cè)的完全一致。2份健康樣品ⅠD7、m62 DAS-ELISA TMV酶標(biāo)儀讀數(shù)分別為0.509、0.06，酶標(biāo)板上分別呈陽(yáng)性和陰性，而簡(jiǎn)易試紙條檢測(cè)結(jié)果均呈陰性，2種檢測(cè)方法對(duì)ⅠD7的檢測(cè)結(jié)果不一致。在CMV檢測(cè)中，列出的11份樣品中，DAS-ELISA TMV酶標(biāo)儀讀數(shù)均為零，在酶標(biāo)板上呈無(wú)色反應(yīng)，結(jié)果呈陰性；對(duì)11份樣品進(jìn)行簡(jiǎn)易試紙條檢測(cè)，結(jié)果均呈陰性，2種檢測(cè)方法檢測(cè)的結(jié)果完全一致。

以上結(jié)果表明，DAS-ELISA和簡(jiǎn)易試紙條對(duì)同一種病毒檢測(cè)結(jié)果基本一致。但二者的檢測(cè)成本相差較大，據(jù)推算，進(jìn)行DAS-ELISA檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)1個(gè)樣本的成本為25元，而用簡(jiǎn)易試紙條檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)1個(gè)樣本的平均成本為40元。

3 小結(jié)與討論

對(duì)甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所辣椒育苗棚和近郊試驗(yàn)地病毒病病原種類進(jìn)行了鑒定，其檢測(cè)出TMV、PVV和PVS 3種病毒，其中TMV為優(yōu)勢(shì)種群，侵染率高達(dá)66.7%，與文朝慧等[8 ]檢測(cè)的甘肅省河西地區(qū)病毒優(yōu)勢(shì)種群一致，但河西地區(qū)CMV侵染率為33.3%，而本試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)CMV侵染。PVV 和 PVS是世界各地侵染馬鈴薯主要病毒之一，導(dǎo)致馬鈴薯種性退化、嚴(yán)重減產(chǎn)和品質(zhì)降低，其侵染辣椒的報(bào)道較少。大多數(shù)病毒均可通過(guò)蚜蟲傳播，甘肅省近年來(lái)保護(hù)地蔬菜種植面積日益擴(kuò)大，導(dǎo)致蚜蟲發(fā)生量增加，加上種苗的異地運(yùn)輸?shù)燃铀倭酥参锊《镜膫鞑ァ?/p>

血清學(xué)方法是檢測(cè)病毒病病原的首選技術(shù)，檢測(cè)中使用最多的是DAS-ELISA。ELISA檢測(cè)的靈敏度較高，可檢測(cè)到濃度為0.1～10 ng/mL的病毒，而且檢測(cè)的通量大，但存在操作步驟繁瑣、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)等缺陷。利用簡(jiǎn)易試紙條檢測(cè)病毒具有簡(jiǎn)單、快捷的優(yōu)點(diǎn)，1個(gè)樣品的檢測(cè)在5～6 min完成，適合田間即時(shí)檢測(cè)。本試驗(yàn)比較了CMV和TMV DAS-ELISA法和簡(jiǎn)易試紙條法的檢測(cè)結(jié)果，表明DAS-ELISA和簡(jiǎn)易試紙條對(duì)同一種病毒檢測(cè)結(jié)果基本一致。以成本考慮，田間即時(shí)檢測(cè)應(yīng)采用簡(jiǎn)易試紙條法。

本試驗(yàn)采集樣品有限，并且僅對(duì)8種病毒進(jìn)行了檢測(cè)，有些表現(xiàn)病毒病癥狀的樣品還未確定毒原，樣品中是否還存在其它侵染辣椒的病毒種類如 ToMV、TSWV、和 PMMoV 等仍需進(jìn)一步鑒定。

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（本文責(zé)編：陳 珩）