四川稻城傳統(tǒng)干酪中乳酸菌的分離鑒定及功能研究

劉絨梅 田圓圓 耿琦 史健陽(yáng) 張?jiān)? 孫群

摘 要：為獲取具優(yōu)良加工性能和降解膽固醇功能的乳酸菌，從四川稻城兩類(lèi)傳統(tǒng)干酪（牦牛奶餅、酥油奶餅）中分離篩選得到7株乳酸菌，經(jīng)16S rRNA序列鑒定有5株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。對(duì)其進(jìn)行耐酸、耐膽鹽、表面疏水性及自聚合能力、抑菌和降膽固醇檢測(cè)，結(jié)果表明，7株菌均具一定的耐酸和耐膽鹽能力，在pH 3.5和0.1%膽鹽濃度條件下可生長(zhǎng)；菌株N-4疏水性達(dá)29.57%，N-8自聚能力達(dá)66.09%；菌株N-8對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈分別為11.17 mm和15.00 mm，抑菌能力均強(qiáng)于其他菌株；菌株N-1可降解培養(yǎng)基中的膽固醇，降解率達(dá)31.77%，有望利用其發(fā)酵生產(chǎn)具降膽固醇能力的新型功能性乳制品。綜上，從傳統(tǒng)干酪中分離篩選的乳酸菌具有潛在的益生功能，可應(yīng)用于功能性乳制品開(kāi)發(fā)。

關(guān)鍵詞：傳統(tǒng)干酪；乳酸菌；功能特性；膽固醇

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-5124（2017）12-0058-05

Abstract： In order to obtain lactic acid bacteria（LAB） of excellent processing properties and beneficial functions of lowering cholesterol， seven strains of lactic acid bacteria were isolated from two kinds of traditional cheese from Daocheng， Sichuan， among which five were identified as Lactobacillus plantarum by 16S rRNA sequence. All strains were subjected to acid and bile salt resistance， surface hydrophobicity and self-aggregation， antibacterial and cholesterol-lowering test. The results showed that all the bacterial strains had a certain degree of acid resistance and bile salt tolerance， and they could grow under the conditions of pH 3.5 and 0.1% bile salt. The hydrophobicity of N-4 was 29.57% and the self-aggregation capacity of N-8 was 66.09%； The antibacterial activity of N-8 to Escherichia coli and Staphylococcus aureus was the strongest， with the inhibition zone being 11.17 mm and 15.00 mm， respectively. The strain N-1 can degrade the cholesterol in the medium， and the degradation rate was 31.77%， and it is expected to be applied on the development of new functional dairy products with the ability of lowering cholesterol. In conclusion， LAB strains isolated from traditional cheese has a potential probiotic function.

Keywords： traditional cheese； lactic acid bacteria； function properties； cholesterol

0 引 言

傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品具有悠久的歷史，其蘊(yùn)含著豐富的微生物資源，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。稻城縣地處中國(guó)四川省西南邊緣，屬于青藏高原東南部屬康巴藏區(qū)的甘孜藏族自治州，傳統(tǒng)發(fā)酵而成的奶制品是當(dāng)?shù)氐闹匾称?。這些傳統(tǒng)奶制品是通過(guò)本土菌株發(fā)酵而成，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期馴化，具有優(yōu)良性狀的菌株得以保留。大量研究表明，傳統(tǒng)乳制品中的優(yōu)勢(shì)菌株為乳酸菌[1-2]。從傳統(tǒng)乳制品中分離篩選得到的乳酸菌具有多種益生功能，并對(duì)人體有多種功效，得到了廣泛的應(yīng)用[3]。目前研究最多的是新疆、內(nèi)蒙古一帶的傳統(tǒng)發(fā)酵乳，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)過(guò)10年的研究，在2007年建立起了中國(guó)第一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的乳酸菌菌種資源庫(kù)[4]，而西南地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳中乳酸菌的相關(guān)研究相對(duì)較少。此外，乳制品中乳酸菌生物多樣性隨不同地區(qū)和制作方式而不同。因此，從不同地區(qū)不同種類(lèi)的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離、篩選具優(yōu)良性能和功能的乳酸菌菌種，對(duì)新型和功能性乳品及其他發(fā)酵行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

本研究從四川稻城地區(qū)2類(lèi)常見(jiàn)的傳統(tǒng)乳制品（奶餅、酥油奶餅）中分離篩選到15株乳酸菌，對(duì)初篩后的7株乳酸菌進(jìn)行耐酸、耐膽鹽、表面疏水性及自聚合能力、抑菌和降膽固醇試驗(yàn)的研究，最終得到1株可在體外將膽固醇降解31.77%的植物乳桿菌N-1，其余菌株也表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)，豐富了西南地區(qū)功能乳酸菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣 品

兩份干酪樣品（奶餅、酥油奶餅）采自四川省稻城縣木拉鄉(xiāng)卡龍村，是當(dāng)?shù)啬撩癜l(fā)酵的牦牛乳制品。

1.1.2 菌 種

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），系本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.3 試 劑

鄰苯二甲醛（98%），牛膽鹽（上海源葉生物科技公司）；膽固醇（上?；菔郎噭┯邢薰荆?。

MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉6.0 g，吐溫80 1.0 mL，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，純水1 L，pH自然（加1.5%～2.0%瓊脂為固體培養(yǎng)基）。

MRS-膽固醇培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中添加不同濃度的牛膽鹽，并加入膽固醇使培養(yǎng)基中膽固醇終濃度為100 μg/mL。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸出物5.0 g，氯化鈉10.0 g，純水1 L，pH自然（加1.5%～2.0%瓊脂為固體培養(yǎng)基）。

PBS緩沖液：磷酸二氫鉀0.2 g， 磷酸氫二鈉1.15 g，氯化鈉8 g，氯化鉀0.2 g，加入800 mL 純水?dāng)嚢枞芙?，濃鹽酸調(diào)至相應(yīng)pH值，定容至1 L。

1.2 儀器與設(shè)備

AFZ-100Z-U 超純水儀（美國(guó)艾科浦公司）；PS-25精密pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；BX53F光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；UV-2600紫外分光光度計(jì)（日本SHIMADZU公司）；TGL-16G臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠(chǎng)）；TS-1小型搖床（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.3 方 法

1.3.1 菌株的分離、純化及初篩

兩份樣品各稱(chēng)取10 g，于裝有90 mL無(wú)菌水的錐形瓶中充分?jǐn)嚢瑁糜趽u床振蕩60 min，使樣品完全分散。吸取懸液，10倍梯度稀釋分別涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，肉眼觀(guān)察挑取不同形態(tài)和大小的單菌落，平板劃線(xiàn)純化3次。革蘭氏染色，觸媒試驗(yàn)初步確定為疑似乳酸菌，將純化好的菌株保存于50%甘油中，-40 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

將分離純化得到的菌株以10%的接種量分別在pH 3.5和含0.1%牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h，分別測(cè)定0 h和20 h的OD600。對(duì)在這兩個(gè)條件下均可生長(zhǎng)的菌株進(jìn)一步研究。

1.3.2 菌株鑒定

采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA，細(xì)菌通用引物27F/1492R擴(kuò)增16S rRNA，將測(cè)得的16S rRNA序列進(jìn)行NCBI BLAST比對(duì)。

1.3.3 菌株耐酸和耐膽鹽試驗(yàn)

耐酸試驗(yàn)：將活化三代的乳酸菌以1%的接種量分別接種至pH為3.5、2.5、2.0的PBS緩沖液中，37 ℃靜置培養(yǎng)3 h，梯度稀釋平板法測(cè)定乳酸菌活菌數(shù)。

耐膽鹽試驗(yàn)：將活化三代的乳酸菌以1%的接種量分別接種至含0.1%、0.2%、0.3%的牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)5 h，梯度稀釋平板法測(cè)定乳酸菌活菌數(shù)。

1.3.4 疏水性和自聚力試驗(yàn)

疏水性試驗(yàn)參考Sadishkumar[5]的方法稍加修改。乳酸菌于37 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)24 h， 4 ℃，5 000 g離心5 min，棄上清，收集菌體沉淀。pH值為7.4的無(wú)菌PBS緩沖液洗滌菌體沉淀2次，重懸于無(wú)菌的PBS緩沖液中，調(diào)整菌懸液的吸光值（OD600 nm）為0.8±0.05（A0）。取2 mL菌懸液與2 mL二甲苯充分振蕩混勻，室溫靜置30 min。小心吸取水相，于600 nm下測(cè)定吸光值（A1）。

表面疏水性=（1-A1/A0）×100%

自聚力試驗(yàn)參考Todorov等[6]的方法稍加修改。菌懸液制備同疏水性試驗(yàn)，取4 mL菌懸液，室溫靜置24 h。小心吸取上層1 mL，于600 nm下測(cè)定吸光值（A24）。

自聚力=（1-A24/A0）×100%

1.3.5 抑菌試驗(yàn)

以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，乳酸菌發(fā)酵液4 ℃，10 000 g離心 10 min，其上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。將濃度為105 CFU/mL的指示菌培養(yǎng)液100 μL分別涂布于LB固體平板上，用鑷子夾取已滅菌的牛津杯放到 LB 固體培養(yǎng)基上，牛津杯中滴加200 μL除菌的乳酸菌上清液。37 ℃培養(yǎng) 16 h后，測(cè)量抑菌圈的直徑。

1.3.6 體外降膽固醇能力

體外降解膽固醇試驗(yàn)參照Shehata等[7]的方法并加以修改。將活化三代的乳酸菌按1%的接種量接種至MRS-膽固醇培養(yǎng)基，37 ℃ 120 r/min搖床培養(yǎng)24 h。4 ℃下10 000 g離心 10 min，取1 mL上清液于具塞比色管，加入1 mL 33%的KOH和2 mL無(wú)水乙醇，渦旋振蕩90 s，37 ℃水浴15 min，冷卻至室溫，加入2 mL無(wú)菌水和3 mL正己烷，渦旋振蕩60 s，靜置10 min，取上層液體1 mL于新的試管65 ℃水浴蒸干，加入2 mL鄰苯二甲醛-冰乙酸溶液（0.5 mg/mL），混勻，室溫避光反應(yīng) 10 min，加入1 mL 濃硫酸終止反應(yīng)，靜置 10 min，測(cè)其在 550 nm處吸光值。

降解率=（1-A1/A0）×100%

式中：A1——接種乳酸菌的培養(yǎng)液經(jīng)上述處理后的OD值；

A0——未接種乳酸菌的培養(yǎng)液經(jīng)上述處理后的OD值。

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)平行，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離初篩的乳酸菌及鑒定

初步分離到20株疑似乳酸菌的菌落，革蘭氏染色、觸媒試驗(yàn)確定5株非乳酸菌。對(duì)其余15株進(jìn)行耐酸及耐膽鹽初篩，只有7株能在pH 3.5和0.1%膽鹽濃度條件下生長(zhǎng)，對(duì)其進(jìn)行16S rRNA鑒定，結(jié)果如表1所示。7株菌中有5株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），分別是N-1，N-4，N-5， N-8，S-3，而N-2和S-7被鑒定為L(zhǎng)actobacillus sp.。

2.2 耐酸和耐膽鹽能力

乳酸菌耐酸試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。隨著pH值的下降，7株乳酸菌的活菌數(shù)明顯減少。當(dāng)pH值為2.5時(shí)，活菌數(shù)下降3～4個(gè)數(shù)量級(jí)，當(dāng)pH值為3.5時(shí)，除S-3和S-7外，其余5株菌的存活率達(dá)95%以上，表明篩選到的乳酸菌對(duì)酸有一定的耐受性。

乳酸菌耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。隨膽鹽濃度升高，7株乳酸菌的活菌數(shù)呈遞減趨勢(shì)。當(dāng)膽鹽濃度為0.1%時(shí)，存活率均在95%以上，當(dāng)膽鹽濃度為0.2%時(shí)，乳酸菌的活菌數(shù)還能保持在106 CFU/mL。表明篩選到的乳酸菌對(duì)膽鹽有一定的耐受性。

2.3 疏水性和自聚合能力

細(xì)菌表面疏水性和自聚合能力常作為益生菌對(duì)腸道黏附特性的初篩指標(biāo)[8]。乳酸菌疏水性和自聚力試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。7株乳酸菌的疏水性和自聚力相差不大，其中菌株N-4的疏水性較高，達(dá)29.57%，而菌株N-8的自聚能力最強(qiáng)，達(dá)66.09%。

2.4 抑菌試驗(yàn)

乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)常見(jiàn)致病菌和條件致病菌的抑菌效果如表5所示。7株乳酸菌發(fā)酵上清液抑制金黃色葡萄球菌的能力強(qiáng)于大腸桿菌，其中菌株N-8對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力最強(qiáng)，抑菌圈直徑分別為11.17 mm和15.00 mm。

2.5 乳酸菌體外降膽固醇能力

7株乳酸菌體外降解膽固醇試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。菌株N-1降解膽固醇的能力最強(qiáng)，達(dá)31.77%，S-7次之，為27.64%。

3 討 論

本研究從兩類(lèi)干酪樣品中分離初篩選到7株乳酸菌，通過(guò)16S rRNA基因序列分析，其中有5株為植物乳桿菌（L. plantarum），占分離菌株的絕大部分。這與Sun等[9]從青海海南州、海西州和海北州等地區(qū)采集的自然發(fā)酵牦牛乳中植物乳桿菌（L. plantarum） 和乳酸乳球菌乳酸亞種（Lc. lactis subsp.lactis）為優(yōu)勢(shì)菌群的研究相符；與之不同的是，張和平[10]研究表明四川地區(qū)自然發(fā)酵乳優(yōu)勢(shì)菌為嗜熱鏈球菌（S. thermophilus）和瑞士乳桿菌（L. helveticus），而B(niǎo)ao等[11]研究表明四川紅原草原20份酸牦牛乳中嗜熱鏈球菌（S. thermophilus）是優(yōu)勢(shì)菌群。這表明不同地區(qū)和不同制作方式的傳統(tǒng)發(fā)酵乳中乳酸菌生物多樣性不同，優(yōu)勢(shì)菌群也不同。趙建[12]的研究表明植物乳桿菌SP-3不僅能夠加快干酪體系中蛋白質(zhì)的水解進(jìn)程，促進(jìn)干酪成熟，還能提高產(chǎn)品的風(fēng)味強(qiáng)度和風(fēng)味接受度。

乳酸菌作為一種益生菌，只有具有良好的耐酸和耐膽鹽能力才能發(fā)揮益生作用。非空腹?fàn)顟B(tài)下人體胃液的pH值在2.5～3.5的范圍內(nèi)波動(dòng)，小腸中膽鹽的質(zhì)量濃度在0.03%～0.3%范圍內(nèi)波動(dòng)[13]。7株乳酸菌在pH 3.5和0.1%膽鹽濃度的條件下存活率達(dá)90%以上，可在胃腸道存活，具有一定的益生潛力。菌株N-4的疏水性最高，而菌株N-8的自聚力最高，均高于Das等[14]文獻(xiàn)所報(bào)道，表明這兩株菌對(duì)腸道的黏附性可能較強(qiáng)。

研究表明，乳酸菌對(duì)致病菌有一定抑制作用，其代謝物得到廣泛應(yīng)用[15-16]。菌株N-8發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有較強(qiáng)的抑菌能力，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，過(guò)多膽固醇的攝入會(huì)導(dǎo)致高血脂癥，進(jìn)而會(huì)引發(fā)冠心病等心腦血管疾病，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[17]。已有研究表明乳酸菌對(duì)膽固醇的降低有積極作用[18]。而篩選得到的菌株N-1可在體外將膽固醇降解31.77%，與之相似的是劉曉強(qiáng)[19]從傳統(tǒng)酸肉中篩選得到一株高效降膽固醇的消化乳桿菌CT24，其降低率達(dá)31.23%。因此，該菌株有望添加到功能性食品中進(jìn)一步研究、開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。

4 結(jié)束語(yǔ)

本研究篩選得到的7株乳酸菌來(lái)自四川稻城傳統(tǒng)乳制品，有利于西南地區(qū)乳酸菌資源的收集。通過(guò)功能篩選，獲得了2株具有潛在價(jià)值的乳酸菌，即一株有較強(qiáng)抑菌能力，另一種有較強(qiáng)降膽固醇能力，可為乳酸菌在功能性食品中的應(yīng)用提供參考。

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（編輯：莫婕）