HPLC法檢測(cè)明綠萌動(dòng)過程中牡荊素和異牡荊素含量變化規(guī)律

萬(wàn)婭瓊 程江華 吳翔

摘要 [目的]為更好地利用安徽明綠資源，開展了綠豆萌動(dòng)試驗(yàn)中牡荊素和異牡荊素的含量變化規(guī)律及其高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)方法研究。[方法]對(duì)安徽特產(chǎn)明綠進(jìn)行萌動(dòng)40 h，每4 h取樣1次，并用HPLC方法對(duì)樣品中牡荊素、異牡荊素含量進(jìn)行檢測(cè)。[結(jié)果]萌動(dòng)過程中牡荊素、異牡荊素基本上處于波動(dòng)下降趨勢(shì)，但在萌動(dòng)8 h時(shí)含量最高，分別為0.57、1.02 mg/g，在16 h時(shí)含量最低，并且異牡荊素含量是牡荊素含量的2倍左右。[結(jié)論]HPLC法檢測(cè)牡荊素、異牡荊素方法可靠，明綠萌動(dòng)過程中，8 h時(shí)牡荊素、異牡荊素含量較高。

關(guān)鍵詞 明光綠豆；牡荊素；異牡荊素；萌動(dòng)

中圖分類號(hào) TS205 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）25-0105-02

Abstract [Objective] In order to make better use of Anhui Mingguang mung bean resources，the vitexin and isovitexin content changes and HPLC detection methods were studied in the experiment of mung bean sprout.[Method] To sprout Mingguang mung bean for 40 h， and take sample 1 time per 4 h， vitexin and isovitexin content were detected by HPLC method. [Result] In the process of germination， the content of vitexin and isovitexin basically was in a downward trend， but in the germination of 8 h was the highest， respectively 0.57 and 1.02 mg/g， at the time of 16 h was the lowest， and the isovitexin basically was about 2 times the contents of vitexin. [Conclusion] HPLC method was used to detect Vitexin， isovitexin， the method is reliable， in the process of germinating mung bean， Vitexin and isovitexin were higher at 8 h.

Key words Mung bean；Vitexin；Isovitexin；Sprouting time

綠豆（Mung bean）為豆科豇豆屬綠豆[Vigna radiata（Linn.）Wilczek.]的成熟種子，別名青小豆（因其顏色青綠而得名）、菉豆、植豆等。綠豆原產(chǎn)于中國(guó)、印度、緬甸等國(guó)家，在我國(guó)已有2 000多年的栽培史，現(xiàn)在廣泛分布于東亞各國(guó)，非洲、歐洲、美國(guó)也有少量種植。明綠是安徽明光特產(chǎn)綠豆的簡(jiǎn)稱，因其色澤碧綠、粒大皮薄、湯清易爛、味香爽口等特點(diǎn)和清熱解毒、抗過敏等作用，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)享有很高的聲譽(yù)。

綠豆?fàn)I養(yǎng)成分全面，既是調(diào)節(jié)飲食的佳品，又是食品工業(yè)的重要原料，也是重要的藥材和化妝品添加劑。中醫(yī)認(rèn)為，綠豆味甘、性涼、歸心胃經(jīng)，具有清熱解毒、解暑除煩、利水消腫、清膽?zhàn)B胃、潤(rùn)腸通便、明目、降血糖、降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗過敏、保護(hù)肝臟和心血管、增強(qiáng)免疫力、排鉛等功效[1]。現(xiàn)代研究表明，這些功效與綠豆中含有的功能成分天然植物黃酮碳苷類化合物牡荊素和異牡荊素相關(guān)[2]。牡荊素和異牡荊素的生物活性已引起國(guó)內(nèi)外研究人員的極大關(guān)注，近年來就牡荊素抗心肌梗死[3]、抗炎鎮(zhèn)痛[4]、降血壓、抗菌、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]等方面藥理作用進(jìn)行了大量的研究。由于牡荊素和異牡荊素是同分異構(gòu)體[7]，基本結(jié)構(gòu)均為二羥基異黃酮，因此2個(gè)化合物在液相色譜條件下常合并在一起較難分離。該研究通過優(yōu)化色譜條件，使牡荊素和異牡荊素兩峰得到很好地分離，且峰形良好，出峰時(shí)間短，提高了工作效率。

筆者以安徽明綠為原料，研究其萌發(fā)過程中牡荊素和異牡荊素的變化規(guī)律，旨在為開發(fā)明綠深加工產(chǎn)品提供實(shí)踐依據(jù)。同時(shí)為更好地滿足人們對(duì)天然活性成分牡荊素日益增長(zhǎng)的需求，使其為人類的健康和保健做出更大貢獻(xiàn)，也為人們以綠豆及其萌芽作為食品、保健品及化妝品原料的高效應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與主要試劑。

原料：明光綠豆，徽王食品有限公司；綠豆不同時(shí)間萌動(dòng)的樣品（包括實(shí)驗(yàn)室和中試樣品）。

主要試劑：乙醇（分析純）、乙酸（色譜純）、乙腈（色譜純），上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；娃哈哈純凈水；牡荊素、異牡荊素標(biāo)準(zhǔn)品，上海優(yōu)純生物科技有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備。

Shimadzum LC-20A高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器；Alltech C18柱 （4.6×250 mm，5 μm）色譜柱；電熱鼓風(fēng)干燥箱，型號(hào)DHG-9023A；生化培養(yǎng)箱，型號(hào)SPX-70；超聲波清洗儀，型號(hào)XO25-12DTD；電子天平，型號(hào)ML104；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，型號(hào)N-1100。

1.2 方法

1.2.1 綠豆萌動(dòng)工藝[8]。

綠豆→篩選→清洗→消毒→純水清洗→浸泡→發(fā)芽→取樣→干燥→粉碎。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備。

精確稱量牡荊素、異牡荊素標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，加甲醇制成0.1 mg/mL的母液，備用。

1.2.3 明綠萌動(dòng)后樣品處理。

綠豆粉碎，過60目篩，稱取1.00 g粉末，按固液比1∶20（g∶mL）用75%乙醇溶液溶解，超聲波振蕩60 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)，再用乙腈定容，過0.45 μm有機(jī)膜，濾液備用，此為待測(cè)樣品溶液。

1.2.4 牡荊素、異牡荊素的測(cè)定色譜條件。

色譜條件：色譜柱為Alltech C18，流動(dòng)相為A為乙腈，B為0.2%乙酸，0～20 min，B由5%→25%；20～30 min，B由25%→90%；流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為365 nm，柱溫箱溫度35 ℃，樣品進(jìn)樣量均為10 μL，以峰面積（A）和質(zhì)量濃度（C，mg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；按信噪比S/N=3計(jì)算檢測(cè)限。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡荊素和異牡荊素高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)結(jié)果

牡荊素、異牡荊素對(duì)照品圖譜見圖1。由圖1可見，牡荊素出峰時(shí)間為19.685 min，異牡荊素出峰時(shí)間為20.392 min。

2.2 綠豆萌動(dòng)工藝及過程中牡荊素、異牡荊素變化規(guī)律

挑選籽粒飽滿的明光綠豆，自來水清洗，體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇消毒5 min，純水清洗3遍。在生化培養(yǎng)箱中，采用培養(yǎng)皿+上蓋紗布模式萌動(dòng)，及時(shí)補(bǔ)充水分，25 ℃黑暗試驗(yàn)，發(fā)芽時(shí)間設(shè)定為從0 h開始，每4 h取樣1次，到40 h時(shí)一共取11個(gè)樣品，每個(gè)樣品取樣后及時(shí)在高低溫培養(yǎng)箱中，60～70 ℃下干燥含水量低于14%，冷卻后，4 ℃下密封避光保存，備用。

每個(gè)樣品按照“1.2.3”的方法處理，進(jìn)樣，檢測(cè)結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，在綠豆萌動(dòng)過程中牡荊素、異牡荊素和兩者總和基本處于波動(dòng)下降趨勢(shì)，在8 h時(shí)處于萌動(dòng)過程中的含量高峰期，分別為0.57、1.02、1.59 mg/g，在16 h時(shí)含量最低，分別為0.15、0.34、0.49 mg/g。在0～4和8～16 h時(shí)間內(nèi)，牡荊素、異牡荊素下降最為明顯，在0～4 h內(nèi)兩者含量分別減少了37.8%和37.5%。整個(gè)發(fā)芽過程中牡荊素和異牡荊素的含量變化趨勢(shì)基本一致，且異牡荊素含量基本保持在牡荊素含量2倍的水平。

3 結(jié)論與討論

牡荊素和異牡荊素是綠豆種子中含有的主要黃酮類物質(zhì)，這2類物質(zhì)在綠豆種子中含量最高，自萌芽開始，含量呈現(xiàn)波浪式下降趨勢(shì)，這說明萌芽綠豆中的牡荊素、異牡荊素可能是作為代謝原點(diǎn)和雙向代謝物質(zhì)，并且在0～4、8～16 h代謝作用激烈，逐漸轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，在8、28 h又轉(zhuǎn)化為牡荊素和異牡荊素。因此，如果要利用萌動(dòng)的明光綠豆中牡荊素和異牡荊素，最佳萌動(dòng)時(shí)間為8 h。

試驗(yàn)可知，萌動(dòng)后的綠豆具有更廣泛的生物活性和豐富的次生代謝產(chǎn)物，該試驗(yàn)只是考察了牡荊素、異牡荊素在明綠萌動(dòng)過程中的變化趨勢(shì)，其他的蛋白質(zhì)、氨基酸等未作分析，課題組下一步擬對(duì)萌芽綠豆中其他營(yíng)養(yǎng)成分變化規(guī)律進(jìn)行分析，了解綠豆萌動(dòng)過程中代謝途徑及變化規(guī)律，為萌動(dòng)綠豆在食品等相關(guān)領(lǐng)域的利用提供理論依據(jù)。

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