質(zhì)子輻射誘變玉米M2代形態(tài)變異與RAPD分析

邊曉萌　田安然　耿金鵬　丁蘭　龔佳夢(mèng)　胡金山　曹天光

摘要[目的]研究不同劑量質(zhì)子輻射（PR）的白馬牙玉米M2代的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)和基因組DNA水平上的變異情況。[方法]對(duì)白馬牙玉米干種子進(jìn)行5種不同劑量的輻射處理，研究M2代玉米生長(zhǎng)狀況，采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)研究M2代損傷和變異。[結(jié)果]發(fā)芽率隨著劑量的增加先升高后降低，20、30 Gy處理的發(fā)芽率均高于對(duì)照，20 Gy處理最高；空稈率隨著劑量的增加呈先升高后降低再升高再降低的馬鞍型曲線，其中20 Gy和50 Gy處理最低，40 Gy處理空稈率最高，達(dá)29.4%；光合速率PR組顯著低于對(duì)照，隨著劑量的增加呈馬鞍形曲線；籽粒千粒重隨著劑量的增加呈馬鞍形曲線，10、20和40 Gy處理顯著高于對(duì)照，50 Gy處理低于對(duì)照。綜合考慮發(fā)芽率、空稈率、千粒重，對(duì)白馬牙玉米M2代產(chǎn)量的有益變異多的輻射劑量依次為20、10和30 Gy。RAPD試驗(yàn)分析中16條隨機(jī)引物擴(kuò)增出142條條帶，其中多態(tài)性條帶71條，多態(tài)性比例達(dá)57.3%，各PR組變異率為20.2%～32.3%；各組在遺傳相似度0.73附近處聚為2類(lèi)，10 Gy組與50 Gy組聚為1類(lèi)，表明其變異程度較大，其他組與對(duì)照聚為1類(lèi)。[結(jié)論]該研究可為今后輻射誘變玉米產(chǎn)生有益變異和培育新品種提供輻射劑量的指導(dǎo)和參考，也為拓展玉米種質(zhì)奠定一定的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞質(zhì)子輻射誘變；玉米；馬鞍形曲線；RAPD分析

中圖分類(lèi)號(hào)S513文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）33-0149-04

The M2 Morphological Variation and RAPD Analysis of Maize Irradiated by Proton

BIAN Xiaomeng，TIAN Anran，GENG Jinpeng，CAO Tianguang* et al

（Institution of Biophysics，School of Science，Hebei University of Technology，Tianjin 300401）

Abstract[Objective]The growth and development，morphology and variation of genomic DNA level in the M2 of maize were studied in different doses of proton radiation （PR）.[Method]Maize seeds were irradiated by different doses of proton（10、20、30、40、50 Gy）.We studied the growth status of M2 of maize，and studied the M2 damage and variation with RAPD molecular marker technology.[Result] The germination rate increased firstly and then decreased with the increase of the dose.The germination rate of 20 Gy and 30 Gy groups were higher than the control，and the 20 Gy groups was the highest.The empty bar rate was a saddle shaped curve，the minimum was at 20 Gy and 50 Gy，the highest was at 40 Gy and up to 29.4%.The photosynthetic rate of the maize of irradiation groups was significantly lower than the control，it showed saddle shaped curve with the dose increasing.The thousandgrain weight also showed saddle shaped curve with the dose increasing，its values of the groups of 10 Gy，20 Gy and 40 Gy were significantly higher than the control and the minimum was at 50 Gy.Comprehensive considering the germination rate，the empty bar rate and the thousandgrain weight，the radiation dose of producing useful variation of maize M2 generation was in the order 20 ，10 and 30 Gy.16 random primers were used on Random Amplified Polymorphic DNA，called RAPD experiment.All primers amplified 142 bands，71 polymorphism bands.The polymorphism bands ratio reached 57.3%，and the variation rate of irradiation group was between 20.2% and 32.3%.The result of genetic similarity clustering analysis showed that those groups were clustered into two categories.One included the 10 Gy group and the 50 Gy group，and the variation was high.The other included the 20，30 and 40 Gy groups and the control.[Conclusion]These works can provide a guidance and reference of radiation dose for the radiation induced maize to produce beneficial mutations and cultivate new varieties，and may lay a certain foundation for expanding the maize germplasm.

Key wordsProton radiation mutation； Maize； Saddle shaped curve；RAPD analysis

玉米為一年生禾本科草本植物，是目前全世界總產(chǎn)量最高的糧食作物，也是我國(guó)第一大農(nóng)作物。除食用外，玉米深加工產(chǎn)業(yè)處于快速增長(zhǎng)階段，現(xiàn)階段的玉米生產(chǎn)不能滿足日益增長(zhǎng)的需求，然而提高玉米種植面積已經(jīng)非常困難，這就需要培育新的單產(chǎn)高的玉米品種。玉米種質(zhì)資源是玉米育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，而玉米種質(zhì)資源的遺傳脆弱性，已成為制約玉米育種發(fā)展的“瓶頸”因素。玉米種質(zhì)擴(kuò)增、改良和創(chuàng)新已成為其育種研究的重要發(fā)展方向[1]。近年來(lái)，隨著輻射誘變技術(shù)迅速發(fā)展，越來(lái)越多的研究將這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用到植物育種方面。對(duì)玉米的輻射誘變手段主要是采用重離子[2-3]、γ射線[4]以及航天搭載[5]等。質(zhì)子輻射生物效應(yīng)的研究一直以哺乳動(dòng)物及其細(xì)胞材料為主，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較多[6]。20世紀(jì)90年代研究人員才開(kāi)始用質(zhì)子輻照植物種子，唐掌雄等[7]利用質(zhì)子輻射麥類(lèi)種子發(fā)現(xiàn)，M1代苗高和根長(zhǎng)的變化與輻照劑量和射線能量有關(guān)；王彩蓮等[8]用質(zhì)子輻照水稻，獲得了矮稈和千粒重增加等有益突變的新材料；孫遜等[9]利用質(zhì)子束處理甜瓜種子發(fā)現(xiàn)，質(zhì)子束處理對(duì)細(xì)胞染色體有一定的致畸效應(yīng)，致畸類(lèi)型以微核比例較高，并經(jīng)6代選育獲得了甜瓜早熟品種；施巾幗等[10]研究質(zhì)子對(duì)小麥的誘變效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，不同能量的質(zhì)子對(duì)小麥M1代生物損傷效果不同，能量越高損傷越嚴(yán)重，至6 MeV時(shí)損傷達(dá)到最大后隨能量的提高又有所降低。目前質(zhì)子輻射植物的生物效應(yīng)主要集中在形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理?yè)p傷等方面，而采用隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA分子標(biāo)記技術(shù)（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）對(duì)質(zhì)子輻射誘變玉米的相關(guān)研究較少[11-12]。

該研究利用中國(guó)原子能科學(xué)研究院的串列加速器產(chǎn)生的質(zhì)子對(duì)白馬牙玉米干種子進(jìn)行了5種不同劑量的輻射處理，研究了M2代玉米生長(zhǎng)狀況，采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)研究了M2代損傷和變異，為進(jìn)一步輻射誘變玉米產(chǎn)生有益變異提供輻射劑量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和參考，為拓展種質(zhì)資源和培育玉米新品種提供參考，也為探索質(zhì)子輻射誘變玉米的理論機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試材料是由河北省遷安市隆興農(nóng)業(yè)科技示范場(chǎng)提供的白馬牙玉米干種子，經(jīng)質(zhì)子輻射（PR）后播種，采集二代（M2）的玉米葉片，以未經(jīng)質(zhì)子輻射（0 Gy）的玉米種子播種采集的二代葉片作為對(duì)照（CK）。

1.2誘變處理采用中國(guó)原子能科學(xué)研究院串列加速器國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的串列加速器（HI-13）對(duì)玉米種子進(jìn)行質(zhì)子輻射，輻射劑量分別為10、20、30、40、50 Gy。

1.3光合速率測(cè)定

在37 ℃下于生長(zhǎng)發(fā)育期選取生長(zhǎng)一致、無(wú)病蟲(chóng)害的成熟葉片，測(cè)得凈光合速率，在同一時(shí)間每個(gè)處理組測(cè)8株，取其平均值作為此處理組的光合速率。試驗(yàn)使用的是北京益康農(nóng)科技有限公司的ECA-PB0402光合測(cè)定儀。

1.4RAPD分子標(biāo)記

1.4.1DNA提取及有關(guān)檢測(cè)。采用TIANGEN公司的DNA提取試劑盒，提取玉米PR組及對(duì)照的DNA，經(jīng)凝膠電泳成像系統(tǒng)（1%瓊脂糖凝膠）檢測(cè)，觀察DNA的完整性。隨后采用紫外分光光度計(jì)對(duì)所提取的樣品逐一進(jìn)行吸光度檢測(cè)，DNA樣品的OD260/OD280的值均為1.8～2.0，DNA純度較好。

1.4.2體系優(yōu)化及引物篩選。采用25 μL體系優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果：10.8 μL超純水、2.5 μL Buffer、2.5 μL Dye、2 μL dNTP、4 μL引物、1.2 μLTaq酶、2 μLDNA模板。進(jìn)一步以對(duì)照的DNA為模板，選用140種隨機(jī)引物在一定條件下逐一擴(kuò)增，后采用凝膠電泳成像系統(tǒng)（1.5%瓊脂糖凝膠）檢測(cè)，觀察擴(kuò)增結(jié)果，選出條帶穩(wěn)定性好、清晰度高、帶型豐富的16條隨機(jī)引物備用（表1）。

1.4.3PCR擴(kuò)增。采用美國(guó)Bio公司的實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增。使用上一步驟中優(yōu)化后的體系；擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min；36 ℃ 1 min；72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃保存；擴(kuò)增產(chǎn)物在含有EB的1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離，電泳緩沖液為1×TAE，最后用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS軟件的單因素方差分析和LSD多重比較對(duì)光合速率測(cè)定結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

根據(jù)RAPD隨機(jī)引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖結(jié)果，擴(kuò)增陽(yáng)性記為1，擴(kuò)增陰性記為0，建立數(shù)據(jù)庫(kù)。采用NTsys軟件對(duì)各處理組玉米進(jìn)行聚類(lèi)分析。各統(tǒng)計(jì)量定義如下：多態(tài)性條帶比例=多態(tài)性條帶數(shù)/對(duì)照擴(kuò)增條帶數(shù)×100%；種子發(fā)芽率=發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù)×100%；空稈率=空稈株數(shù)/成活總株數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1玉米M2代種子發(fā)芽率和空稈率

發(fā)芽率能夠更直觀地顯示種子的出苗狀況，玉米的空稈率可直接影響其產(chǎn)量高低，這2項(xiàng)數(shù)據(jù)對(duì)準(zhǔn)確估算玉米產(chǎn)量影響較大。PR組以及對(duì)照各播種20粒種子，統(tǒng)計(jì)其發(fā)芽率和空稈率，結(jié)果如圖1所示。隨劑量增加發(fā)芽率先增高后降低，PR 10 Gy處理與對(duì)照相同，為90%，20、30 Gy處理高于對(duì)照，20 Gy處理發(fā)芽率最高，40、50 Gy處理低于對(duì)照。隨劑量增加空桿率呈現(xiàn)先升高（10 Gy）后降低（20 Gy）再增高（40 Gy）又降低（50 Gy）的馬鞍型曲線，其中40 Gy處理空稈率高達(dá)29.4%，20、50 Gy處理空稈率為0。

2.2玉米M2代主要性狀及產(chǎn)量變異

穗高比（穗部高與株高之比）能在一定程度反映植株的抗倒伏能力，千粒重是體現(xiàn)種子大小與飽滿程度的一項(xiàng)指標(biāo)，也是田間預(yù)測(cè)產(chǎn)量時(shí)的重要依據(jù)。測(cè)量玉米的株高、穗位、千粒重，計(jì)算穗高比，并采用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，隨劑量增加，株高先降低后增高，其中20 Gy處理株高顯著降低；穗位無(wú)顯著變化；穗高比先增高后降低再增高，20 Gy處理穗高比顯著增加；千粒重先增高后降低再增高再降低，除50 Gy處理偏低外其他組都有所增加，其中10、20、40 Gy處理較其他處理顯著增加。

2.3玉米光合速率情況

光合作用提供植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的物質(zhì)和能量，是作物產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)。該試驗(yàn)白馬牙玉米光合速率的測(cè)量結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，隨劑量的增加，光合速率先降低后增加再降低又增加，PR組的光合速率均顯著低于對(duì)照組。

2.4基因組DNA多態(tài)性

在該試驗(yàn)反應(yīng)條件下，16條隨機(jī)引物（表1）對(duì)PR不同劑量組和處理進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出142條條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物為200～3 000 bp，其中多態(tài)性條帶71條，多態(tài)性比例為57.3%。RAPD結(jié)果顯示，16個(gè)引物擴(kuò)增均出現(xiàn)不同程度多態(tài)性，主要表現(xiàn)為擴(kuò)增條帶的缺失、增加和深淺的變化。部分電泳結(jié)果見(jiàn)圖3，其中箭頭所指為條帶的缺失或增加，引物A2在800～1 200 bp時(shí)，10、20 Gy處理各增加1條，50 Gy處理增加2條；引物A10在800～1 200 bp時(shí)，50 Gy處理缺失1條，500～800 bp時(shí)，10、50 Gy處理各增加1條，20、30、40 Gy處理各增加1條。

為研究不同處理組對(duì)玉米遺傳物質(zhì)的影響，統(tǒng)計(jì)了各處理組的多態(tài)性比例。由表3可知，PR組的多態(tài)性比例為20.2%～32.3%，呈現(xiàn)出隨劑量的增加先增高后降低再增高的趨勢(shì)。10、50 Gy處理明顯高于其他劑量組，表明其變異程度較大。20 Gy處理多態(tài)性最低。結(jié)果表明，質(zhì)子輻射的二代白馬牙玉米在基因水平上變異明顯，在基因多態(tài)性上表現(xiàn)出馬鞍型曲線關(guān)系。

基于遺傳相似度，利用NTsys軟件做聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，遺傳相似度0.73附近處聚為2類(lèi)，其中質(zhì)子20、30、40 Gy處理組與對(duì)照聚為1類(lèi)，質(zhì)子10 Gy與質(zhì)子50 Gy處理聚為1類(lèi)。

3結(jié)論與討論

該研究對(duì)白馬牙玉米種子經(jīng)質(zhì)子輻射后的M2代種子萌發(fā)情況和植株生長(zhǎng)中出現(xiàn)空稈情況做了統(tǒng)計(jì)，發(fā)芽率在0～

50 Gy劑量時(shí)隨著劑量的增加先升高后降低，10 Gy處理與對(duì)照相同，為90%，20、30 Gy處理均高于對(duì)照，20 Gy處理發(fā)芽率最高為100%，40、50 Gy處理低于對(duì)照?？斩捖孰S著劑量增加，在0～50 Gy時(shí)呈現(xiàn)先升高（10 Gy）后降低（20 Gy）再增高（30、40 Gy）又降低（50 Gy）的馬鞍型曲線，其中40 Gy處理空稈率顯著增加，達(dá)29.4%，20、50 Gy處理無(wú)空稈出現(xiàn)。籽粒千粒重隨著劑量的增加，在0～50 Gy時(shí)呈馬鞍形曲線，10、20和40 Gy處理顯著高于對(duì)照（分別較對(duì)照增高15.3%、134%和9.2%），50 Gy處理低于對(duì)照。綜合考慮發(fā)芽率、空稈率、千粒重，白馬牙玉米M2代的產(chǎn)量由高到低依次為處理20、10、30、0（CK）、50和40 Gy。對(duì)白馬牙玉米產(chǎn)量提高的有益變異多的輻射劑量可能為20、10、30 Gy，這可以作為質(zhì)子輻射誘變玉米和下一步研究的參考劑量。

對(duì)質(zhì)子輻射后玉米光合速率測(cè)定的結(jié)果顯示，輻射組的光合速率在0～50 Gy時(shí)隨劑量的增加先降低后增加再降低又增加，且輻射組顯著低于對(duì)照組。唐掌雄等[7]利用質(zhì)子輻射麥類(lèi)種子發(fā)現(xiàn)M1幼苗出現(xiàn)條狀葉綠素缺失的現(xiàn)象。趙洪兵等[13]研究空間環(huán)境誘變小麥葉綠素缺失突變體的光合特性，發(fā)現(xiàn)小麥葉綠素缺失突變體的光合作用受到顯著影響。是否為質(zhì)子輻射白馬牙玉米產(chǎn)生葉綠素缺失進(jìn)而影響光合速率，需要進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

輻射處理植物干種子可對(duì)其產(chǎn)生非遺傳生理?yè)p傷和基因突變。該研究RAPD試驗(yàn)結(jié)果中質(zhì)子輻射10 Gy的多態(tài)性條帶比例最高，為32.3%，其次是質(zhì)子50 Gy，為31.5%，其他組比例均在20%以上，可見(jiàn)質(zhì)子輻射在白馬牙玉米二代植株分子水平上發(fā)生明顯變異。根據(jù)遺傳相似性聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，各組在遺傳相似度0.73附近處聚為2類(lèi)，質(zhì)子10 Gy與50 Gy聚為1類(lèi)，其他組為1類(lèi)。該試驗(yàn)中質(zhì)子10、50 Gy與對(duì)照的遺傳距離較遠(yuǎn)，變異程度較大，結(jié)合聚類(lèi)分析及多態(tài)性條帶比例考慮，質(zhì)子10 Gy與50 Gy影響變異效果相近，且變異率較高。

綜上所述，質(zhì)子輻射白馬牙玉米的M2代，空稈率、籽粒千粒重和光合速率隨劑量增加在0～50 Gy時(shí)呈現(xiàn)馬鞍型曲線。對(duì)白馬牙玉米產(chǎn)量提高的有益變異多的質(zhì)子輻射劑量依次為20、10、30 Gy。RAPD及聚類(lèi)分析結(jié)果顯示質(zhì)子10 Gy與50 Gy聚為1類(lèi)，變異率較高。這可以為質(zhì)子輻射誘變玉米提高產(chǎn)量、最優(yōu)劑量培育玉米新品種、拓展玉米種質(zhì)提供參考，為進(jìn)一步研究輻射引起植物變異的機(jī)理和馬鞍型曲線產(chǎn)生的機(jī)理提供一定的基礎(chǔ)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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