鹽堿土銹腐病拮抗菌的篩選和鑒定

丁婷婷　楊澤斌　董廣蕊　劉勇　賀香草　張鴻雁

摘要[目的]對黑龍江省大慶地區(qū)鹽堿土壤進行嗜（耐）鹽堿菌的篩選。[方法] 采用不同NaCl濃度梯度的Sehgal-Gibbons平板篩選，利用瓊脂塊法獲得對人參銹腐病病原菌有拮抗作用的嗜（耐）鹽堿菌株，并將傳統(tǒng)的形態(tài)學觀察與現(xiàn)代分子生物學技術(shù)相結(jié)合對其進行鑒定。[結(jié)果]從大慶地區(qū)鹽堿土壤中共分離出48株細菌，其中60.4%的菌株為耐鹽菌，其余為中度嗜鹽菌。所有菌株的耐堿能力在pH 8.0～11.0，其中64.6%的菌株耐堿能力高達pH 11.0，除2株為嗜堿菌，其余均為耐堿菌。人參銹腐病毀滅柱孢菌R2拮抗性篩選獲得3株菌，經(jīng)形態(tài)學、生理生化特征及16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，確定3株菌分別為Halomonas elongata、Halomonas xianhensis和Oceanobacillus iheyensis。[結(jié)論]從鹽堿土中獲得3株對人參銹腐病有拮抗作用的嗜（耐）鹽堿菌，并進行了鑒定。

關(guān)鍵詞鹽堿土；拮抗菌；銹腐?。缓Y選；鑒定

中圖分類號S154.3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）33-0142-04

Screening and Identification of Antagonistic Bacteria for Rust Rot from Salinealkali Soil

DING Tingting， YANG Zebin， DONG Guangrui，ZHANG Hongyan* et al

（College of Life Science and Technology， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing， Heilongjiang 163319）

Abstract[Objective] Haloalkaliphilic bacterial strains were screened from salinealkali soil in Daqing City， Heilongjiang Province. [Method]Strains were screened with plate dilution method on different NaCl concentration gradient SehgalGibbons medium. The haloalkaliphilic bacteria with antagonistic activity against rust rot was obtained by plate confrontation method and identified based on morphological observation and modern molecular biology techniques. [Result] 48 strains of bacteria were isolated from salinealkali soil in Daqing City， 60.4% of the strains were grouped into the halotolerant bacteria， and the rest into the moderate halophiles. Alkaline resistance of the strains was between pH 8.0 and 11.0， 64.6% of which pH tolerance reached to pH 11.0. The rest was alkaliresistant bacteria except two basophilic bacteria. 3 strains were obtained by screening antagonistic activity of rust rot C.destructans R2.Morphology，physiological and biochemical characters and phylogeny of 16SrRan gene sequence were analyzed. 3 strains were identified as Halomonas elongate，Halomonas xianhensis and Oceanobacillus iheyensis. [Conclusion] 3 haloalkaliphilic bacterial with antagonistic activity against rust rot were screened and identified from salinealkali soil.

Key wordsSalinealkali soil；Antagonistic bacteria；Rust rot；Screening；Identification

土壤中微生物的生長受到各種環(huán)境因素的影響，鹽堿土中常含有大量有毒難降解的無機鹽，如Ca2+、Mg2+、K+、Na+、Cl-、SO2-4等離子，土壤中微生物長期在此高鹽堿條件下進化選擇，形成了特殊的細胞結(jié)構(gòu)、生理機能和耐鹽機制，并有多種代謝產(chǎn)物可以利用，成為一類潛在的生物資源。近年來嗜（耐）鹽堿微生物的研究引起學者們的關(guān)注[1-2]。

有學者進行了嗜（耐）鹽堿微生物病原菌拮抗性的研究，在河西走廊[3]、新疆荒漠地區(qū)[4]、海洋[5]和鹽場[6]等都有報道，但針對大慶市鹽堿土的研究則很少。大慶市位于黑龍江省西南部、松嫩平原西部，是我國北方土壤鹽漬化較嚴重的區(qū)域之一，鹽漬化土地面積占東北地區(qū)鹽漬土總面積的393%[7]。大慶市的土壤類型以小蘇打（Na2CO3）和大蘇打

（NaHCO3）為主，土壤pH≥8.5，其中會富集多種嗜（耐）鹽堿微生物。該文以大慶市鹽堿土壤為試驗材料，從中獲得具有拮抗性的嗜（耐）鹽堿性能力強的菌株，為該地區(qū)嗜鹽、嗜堿菌多樣性研究獲得更多依據(jù)，為嗜鹽堿菌在病害生物防治方面的進一步應(yīng)用提供菌株來源。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土壤樣品。

從大慶市聯(lián)想科技城（A）、百湖印業(yè)（B）、黎明湖（C）、農(nóng)大北門（D）周邊4個樣地，選取土壤表面具有堿斑的土壤，利用5點取樣法采集5 cm以下表層土壤，裝入無菌袋后帶回實驗室冰箱中保存?zhèn)溆谩２蓸狱c土壤基本化學性質(zhì)見表1。

1.1.2供試菌株。

供試病原菌為毀滅柱孢菌R2（Cylindrocarpon destructans R2），從黑龍江省鐵力市桃山人參基地病根中分離獲得，供試細菌共48株，分離自黑龍江省大慶市鹽堿土。

1.1.3培養(yǎng)基。

菌株分離采用Sehgal-Gibbons（簡寫S-G）培養(yǎng)基[8]，病原菌活化、培養(yǎng)用PDA培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1鹽堿土壤理化性狀測定。

將土樣烘至恒重，磨細過1 mm 篩用于土壤測定。Ca2+、Mg2+含量測定采用EDTA絡(luò)合滴定法；K+、Na+含量測定采用火焰光度計法；Cl-含量測定采用AgNO3滴定法；HCO-3、CO2-3含量測定采用雙指示劑中和法；SO2-4含量測定采用差減法；pH用pH計 [9]。

1.2.2土壤嗜鹽堿細菌分離純化。

1.2.2.1

菌株富集。將采集帶回的土壤樣品混勻，稱取5 g分別置于含5%NaCl的S-G液體培養(yǎng)基中，于31 ℃160 r/min振蕩培養(yǎng)3～5 d。

1.2.2.2

菌株分離純化。將富集的菌懸液經(jīng)稀釋后涂布于含5%、10%和15%NaCl的S-G培養(yǎng)基平板上，于28 ℃培養(yǎng)5～7 d，根據(jù)菌落的生長速度、形狀、大小、顏色、邊緣、濕度和透明度等表型特征的不同，分別用竹簽挑取不同的單菌落，在S-G培養(yǎng)基上以劃線法純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3耐鹽堿性試驗。

1.2.3.1

耐鹽性試驗。配制不同NaCl濃度的S-G固體培養(yǎng)基，分別為0、3%、5%、10%、15%（W/V），每個梯度重復(fù)3次，接種菌株，28 ℃培養(yǎng)3～7 d，觀察菌株生長狀況。

1.2.3.2

耐堿性試驗。將5%NaCl濃度的S-G固體培養(yǎng)基設(shè)置6個pH梯度，分別為6.5、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，每個梯度重復(fù)3次，接種菌株，28 ℃培養(yǎng)3～7 d，觀察菌株生長狀況。

1.2.4拮抗菌的篩選。

將制備好的病原菌菌懸液均勻涂布于PDA平板上，用打孔器從培養(yǎng)3～7 d的待篩細菌平皿中打取直徑為5 mm的細菌瓊脂塊，正置PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)4～7 d，測定抑菌圈直徑及抑菌圈透明度（完全透明，用“+++”表示；出現(xiàn)抑菌圈，但抑制不徹底，抑菌圈內(nèi)菌絲生長差，用“++”或“+”表示；沒有抑菌圈出現(xiàn)，則用“-”表示）。

按公式（1）（2）計算不同抑菌程度的拮抗菌占供試細菌的百分數(shù)（S）和占拮抗細菌的百分數(shù)（A）。根據(jù)拮抗環(huán)寬度、透明度，挑選出有價值的拮抗菌用于后續(xù)試驗。

S=不同抑菌程度拮抗菌株數(shù)供試嗜（耐）鹽堿菌株數(shù)×100%（1）

A=不同抑菌程度拮抗菌株數(shù)供試拮抗嗜（耐）鹽堿菌株數(shù)×100%（2）

1.2.5細菌發(fā)酵液對毀滅柱孢菌抑菌活性的測定。

將細菌發(fā)酵液去菌體后與PDA 培養(yǎng)基按照 1∶4 的比例混合均勻后倒入培養(yǎng)皿，將病原菌餅（5 mm）接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，菌絲面朝上，28 ℃培養(yǎng) 3 d，用十字交叉法測量菌落直徑，得出菌絲生長抑制率，以混合無菌水的 PDA 培養(yǎng)基為對照。

菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

1.2.6拮抗菌的鑒定。

細菌形態(tài)、生理生化特征及總DNA提取參照《常見細菌鑒定手冊》[10]。以基因組DNA為模板，采用PCR方法25 μL反應(yīng)體系擴增16SrDNA，PCR擴增產(chǎn)物測序由上海生工生物工程公司完成。將測序獲得的菌株16SrDNA序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用Blast與數(shù)據(jù)庫中的嗜（耐）鹽堿菌16SrDNA序列進行相似性比較分析，序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析采用MEGA5.0軟件進行。

1.3分析方法

采用Microsoft Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)整理，SPSS 16.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析（LSD法）。

2結(jié)果與分析

2.1嗜（耐）鹽菌篩選

分別在含不同NaCl濃度的S-G培養(yǎng)基中分離出乳白色、橙黃色、淡黃色等不同顏色的菌落。根據(jù)菌落顏色、大小、形狀等表型特征初步計數(shù)，共獲得122株菌，其中5% NaCl培養(yǎng)基的出菌率最高，10% NaCl培養(yǎng)基次之，在15% NaCl培養(yǎng)基中只有極少量的微小菌落出現(xiàn)。

2.2菌株的耐鹽堿性試驗

根據(jù)菌株的生長速度、顏色、形態(tài)等表型特征以及耐受鹽堿的情況，從122株菌中確定48株典型菌株用于后續(xù)試驗。

2.2.1菌株的耐鹽性。

48株菌中，能耐受3%、5%、10%、15%NaCl的菌株分別為1、8、15和24株。可見NaCl濃度為8%～15%是菌株的主要耐鹽濃度。其中19株菌的最適生長NaCl為3%～10%，屬于中度嗜鹽菌，其余菌株均為耐鹽菌（60.4%）。細菌耐鹽性結(jié)果見表2。

2.2.2菌株的耐堿性。

48株代表菌株的耐堿能力均為pH 8.0～11.0，能耐受pH為8.0、9.0、10.0、11.0的菌株分別有5、7、5、31株。64.6% 的菌株耐堿能力高達pH 11.0。有2株能在pH 9.0～11.0條件下生長良好，且都能在pH<7.0的微酸環(huán)境中生長，屬于兼性嗜堿菌，其余菌株均屬于耐堿菌。細菌嗜（耐）堿性結(jié)果見表2。

2.3拮抗性嗜（耐）鹽堿菌篩選

從48株嗜（耐）鹽堿菌細菌中共篩選得到37株對毀滅柱孢菌具有拮抗性的細菌，其中來自A、B、C、D土壤的菌株分別為11、11、7、8株，分別占該土壤分離全部嗜（耐）鹽堿菌的77.8%、73.3%、87.5%、66.7%，占全部48株分離菌的22.9%、22.9%、14.6%、167%。嗜（耐）鹽堿菌對毀滅柱孢菌R2的拮抗性結(jié)果見表3、4。

由表3、4可知，在37株拮抗菌中，對病原菌R2的抑菌圈≥15.0 mm分別為3、2、2和1株，占全部拮抗菌的81%、54%、5.4%和2.7%，A地分離到的最多，拮抗菌拮抗性中等的在B地最多，沒有拮抗性的也是B地最多。

從表3、4還可看出，有8株拮抗菌拮抗作用較強，分別來源于A、B、C、D 4個采樣點。5-a5、10-a1和10-a6來源于A采樣點，5-b0和5-b7來源于B采樣點，10-c6和10-c8來源于C采樣點，D采樣點只有1株10-d1。8株拮抗菌對病原菌的抑制作用皆很強，且拮抗環(huán)完全透明。

安徽農(nóng)業(yè)科學2017年

2.48株細菌無菌發(fā)酵濾液對毀滅柱孢菌的抑制作用

拮抗菌篩選獲得的8株嗜（耐）鹽堿生防菌無菌發(fā)酵濾液對毀滅柱孢菌R2的抑菌活性測定結(jié)果見表5。由表5可知，8株菌對R2生長都有抑制作用，即均能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，抑制R2生長。8株菌168 h抑菌率為19.5%～85.4%，在144 h時，10-d1的抑菌率為85.4%。其中來源于A土壤的10-a6、來源B土壤的5-b7和來源于D土壤的10-d1抑菌效果突出，其他5株菌，最高抑菌率為60.2%（5-b0），最低為354%（10-c6）。

2.5拮抗性嗜（耐）鹽堿菌鑒定

2.5.1形態(tài)和生理生化特征。

10-a6為革蘭氏陽性菌，棒狀，有鞭毛能運動，菌落圓形，乳白色，光滑；5-b7為革蘭氏陰性、需氧菌，短棒狀，不運動；菌落黃色；10-d1為革蘭氏陽性菌，桿狀，有鞭毛能運動，菌落白色或奶酪色，光滑。3株菌生理生化特征見表6。

2.5.2分子生物學鑒定。

將3株嗜（耐）鹽菌的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。結(jié)果顯示，菌株10-d1與Halomonas elongata位于系統(tǒng)進化樹上同一分支，其序列的同源性較高，表明它們的親緣關(guān)系較近。結(jié)合形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特性，鑒定10-d1為Halomonas elongata，10-a6和5-b7分別與Oceanobacillus iheyensis和Halomonas xianhensis的16SrRNA相近，因此將2菌株5-b7和10-a6初步鑒定為Oceanobacillus iheyensis和Halomonas xianhensis。

3結(jié)論與討論

目前，國內(nèi)外對高鹽堿環(huán)境中嗜（耐）鹽、堿菌的研究越來越廣泛。倪志華等[6]從廣東省湛江市徐聞鹽場沉積物中分離得到1株中度嗜鹽菌N522，該菌株產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)，對溫度有較強的耐受性。閻松等[11]采用稻瘟霉法和鹵蟲法獲得鹽單胞菌屬菌株17B，該菌株可能具有抗菌、抗原蟲、抗腫瘤等活性的生物活性物質(zhì)。國內(nèi)外研究者對于人參銹腐病的生物防治研究有了一定的進展。陳書華等[12]從木霉菌來源及篩選方法上進行新的嘗試，通過離體對峙拮抗篩選試驗，將篩選獲得的木霉菌處理人參苗床。Kim[13]報道了在韓國應(yīng)用木霉菌防治人參土傳病害的情況，孫卓等[14]證實了菌株SZ-22較已報道生防細菌Bacillus subtilis抑菌譜寬，具有更為深遠的生防價值[15]。該試驗從大慶市鹽堿土中分離到48株嗜（耐）鹽堿菌，從中獲得3株（10-d1、5-B7、10-a6）對人參銹腐病病原菌毀滅柱孢菌R2具有較好防效的嗜（耐）鹽堿菌株，并對其進行了鑒定，確定3株菌分別為Halomonas elongata、Halomonas xianhensis和Oceanobacillus iheyensis。

人參藥用價值較高，根部是其藥用部位，生物防治意義重大?？蓪@得的3株菌應(yīng)用到人參銹腐病的后續(xù)試驗中，為大慶地區(qū)鹽堿土中嗜鹽堿菌在植物病害生物防治和人參銹腐病生物防治方面的進一步應(yīng)用提供菌株來源。

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