多菌靈殺菌劑對青?；【桶唏R魚的急性毒性研究

熊昭娣　周夢穎　高翔　郭印　謝劍

摘要[目的]研究農(nóng)藥對農(nóng)田環(huán)境及非靶標(biāo)有益生物的影響。[方法]選取青?；【鶴67和斑馬魚作為受試生物，研究多菌靈殺菌劑對其的急性毒性，從而初步評價該殺菌劑農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中對水生生物的潛在風(fēng)險。[結(jié)果]22%多菌靈殺菌劑對青?；【鶴67的EC50為7.70 mg/L，pEC50為2.11；22%多菌靈殺菌劑對斑馬魚的24、48、72、96 h LC50分別為8.53、8.39、8.07和7.64 mg/L；斑馬魚的安全濃度為0.76 mg/L。[結(jié)論]根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》“魚類急性毒性試驗”對魚類毒性評價標(biāo)準(zhǔn)，判斷22%多菌靈殺菌劑對斑馬魚的毒性屬中毒。

關(guān)鍵詞多菌靈；青?；【鶴67；斑馬魚；急性毒性

中圖分類號S948文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）33-0103-03

Acute Toxicity of Carbendazim to Q67 （Vibrio-qinghaiensis sp） and Zebra Fish （Brachydanio rerio）

XIONG Zhaodi1， ZHOU Mengying2， GAO Xiang1， XIE Jian3* et al

（1. Shanghai Vocational College of Agriculture and Forestry， Shanghai 201699；2. Jinshan District Agricultural Technical Extension Station， Shanghai 201507；3. Animal Husbandry and Fishery Bureau of Louxing District， Loudi，Hunan 417000）

Abstract[Objective]Effects of carbendazim on agriculture environment and nontarget beneficial organisms were studied. [Method]Q67 and zebra fish were selected as a test organism to study the acute toxicity of carbendazim ， thus the potential ecological risks of carbendazim to aquatic organisms was preliminarily evaluated . [Result] EC50 to Q67 of 22% carbendazim was 7.70mg/L， pEC50 was 2.11；the 24 h，48 h，72 h and 96 h LC50 of 22% carbendazim to the testing fish were 8.53，8.39，8.07 and 7.64 mg/L， respectively. The safe concentration of carbenzim to zebra fish was 0.76 mg/L. [Conclusion]Acute toxicity of 22% carbendazim to fish is medium according to the “Fish Acute Toxicity Test” of the Chemical Pesticide Environmental Safety Evaluation Test Guidelines.

Key wordsCarbendazim；Q67；Zebra fish；Acute toxicity

我國是農(nóng)業(yè)大國，也是生產(chǎn)和消費農(nóng)藥的大國，農(nóng)藥在防治農(nóng)作物病蟲草害方面發(fā)揮著重用作用，但在使用過程中70%～80%的農(nóng)藥未達(dá)到防治靶標(biāo)的作用，而是直接分散到環(huán)境中，這其中又有部分隨地表徑流進(jìn)入水環(huán)境，一旦農(nóng)藥進(jìn)入水環(huán)境中，就會單獨或與其他污染物混合共同對水體中動植物產(chǎn)生影響，并可能發(fā)生遷移轉(zhuǎn)化進(jìn)入土壤和農(nóng)作物，在食物鏈的循環(huán)中進(jìn)入人體，影響生態(tài)系統(tǒng)和人類健康[1]。

多菌靈屬于苯并咪唑類農(nóng)藥殺菌劑，是1967年由美國杜邦公司開發(fā)的殺菌劑苯菌靈的中間產(chǎn)物，主要用于防治水稻、蔬菜類的病害，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有高效低毒等特點[2]。美國和歐盟國家已將多菌靈列為禁用農(nóng)藥，我國《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB2763—2005）國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定多菌靈在柑橘、香蕉和芒果中殘留最大限量為0.15 mg/kg，歐盟對柑橘和香蕉的規(guī)定分別為5.00和1.00 mg/kg[3]。近年來，對多菌靈的研究較多，如高濃度多菌靈對植物體內(nèi)的多種酶存在影響[4]，廣西和福建荔枝園土壤樣本中，多菌靈殘留的檢出率分別為48.1%和84.0%[4]；田間試驗中在收獲的水稻稻稈和谷殼中發(fā)現(xiàn)殘存的多菌靈，以此作為飼料有一定的風(fēng)險[5]；芝麻[6]、食用菌[7]、蘋果[8]等種植過程中使用多菌靈后會有少量殘留?？梢钥闯?，目前關(guān)于多菌靈的研究主要集中在對農(nóng)產(chǎn)品殘留限量上，而多菌靈對水生生物的毒性研究較少，雖然在Satapornvanit K等[3]的研究中涉及到多菌靈在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用，但未能對其毒性進(jìn)行量化。筆者選取青?；【鶴67和斑馬魚作為受試生物，通過微板毒性分析法和急性毒性試驗，初步評定22%多菌靈殺菌劑對水生生物的潛在風(fēng)險，旨在為多菌靈的安全使用提供借鑒。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗菌種為青海弧菌Q67，菌種的培養(yǎng)與保存參照文獻(xiàn)[9-10]；急性毒性試驗對象為0～1齡斑馬魚；試驗用水位經(jīng)過充分曝氣且經(jīng)過檢測為無氯的自來水，試驗容器為47 cm×58 cm×77 cm的藍(lán)色塑料箱。

試驗所用農(nóng)藥為含22%多菌靈、8%戊唑醇的混合懸浮殺菌劑（江蘇龍燈化學(xué)有限公司）?；瘜W(xué)分子式：C9H9N3O2，相對分子質(zhì)量：191.19，其結(jié)構(gòu)式如下[1]：

圖1多菌靈的結(jié)構(gòu)式

Fig.1Chemical structures of carbendazim

試驗儀器為Infinite M200酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）、DL-CJ-IF超凈工作臺（哈東聯(lián)）、150C型恒溫振蕩培養(yǎng)箱（金壇市億通電子有限公司）、高壓滅菌鍋（Sanyo公司）、BT25S型電子天平（賽多利斯公司）。

1.2發(fā)光細(xì)菌毒性測試方法

多菌靈懸浮殺菌劑的毒性測定采用微板毒性分析法（MTA）[11]。在96孔微板第1橫排的12個孔中均加入100 μL milli-Q 水作為空白對照，在第2橫排的12個孔中分別加入依據(jù)在預(yù)毒性試驗中所得稀釋因子稀釋的12個濃度，濃度從大到小呈幾何級數(shù)遞減，盡可能地使各濃度產(chǎn)生的發(fā)光抑制率（E）比較均勻地分布在最高效應(yīng)與最低效應(yīng)之間，第3、4橫排中13孔設(shè)為第2橫排相應(yīng)各孔樣品的平行試驗，每一個孔都用milli-Q水補足至100 μL，再用12道移液器依次從微板第1～4排各孔中加入100 μL培養(yǎng)好的菌液，使每孔內(nèi)溶液總體積均為200 μL。15 min后，在酶標(biāo)儀上測定各孔相對發(fā)光度（I）。以空白對照組的發(fā)光強度（I1）與各濃度梯度組的發(fā)光強度計算各濃度對青?；【鶴67的發(fā)光抑制率（E）。為獲得高精度毒性數(shù)據(jù)，重復(fù)3板。

1.3急性毒性試驗

據(jù)預(yù)備試驗結(jié)果，按等對數(shù)間距設(shè)立7個濃度組，重復(fù)數(shù)4次。每個試驗容器分別放入15尾受試斑馬魚，按設(shè)定濃度添加試驗藥物。試驗期間，室內(nèi)自然光照，連續(xù)微波充氣，水溫控制在（30±1）℃，毒性試驗時間分別為96 h。

受試前1 d開始停食。試驗過程中不投餌，不換水。定時觀察斑馬魚的活動情況。沉底后鰓蓋微張被視為昏迷，而經(jīng)解剖針輕觸后無明顯反應(yīng)的個體則被視為死亡，準(zhǔn)確記錄24、48、72、96 h的個體死亡數(shù)。

1.4數(shù)據(jù)處理

青?；【鶴67百分比發(fā)光抑制率的計算公式：

E（%）=（1-I2/I1）×100%（1）

式（1）中，E為發(fā)光抑制率；I1為空白組的發(fā)光強度；I2為與毒物作用后的發(fā)光強度。

斑馬魚校正死亡率的計算公式：

w（%）=（q0-c）/（1-c）×100（2）

式（2）中，q0為未校正死亡率，c為對照組死亡率。

仔蝦的安全濃度計算公式[12]：

SC=0.1×96 h LC50（3）

將校準(zhǔn)死亡率換算成概率單位后與相應(yīng)濃度的對數(shù)求

回歸方程，根據(jù)回歸方程計算斑馬魚的半致死濃度LC50。

利用Excel和Origin75統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計，擬合劑量-效應(yīng)曲線，根據(jù)擬合模型計算農(nóng)藥樣品與青海弧菌Q67作用15 min的半效應(yīng)濃度（EC50），并以此判斷農(nóng)藥樣品對青?；【鶴67毒性的大小。

2結(jié)果與分析

2.12種多菌靈殺菌劑對青海弧菌Q67的毒性

作用時間15 min時，22%多菌靈殺菌劑對Q67的劑量-效應(yīng)擬合曲線見圖2。由圖2可知，隨著殺菌劑濃度質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，青?；【鶴67的發(fā)光抑制率逐步升高，兩者呈正相關(guān)；22%多菌靈殺菌劑對青?；【鶴67的EC50為7.70 mg /L，pEC50為2.11。

2.222%多菌靈殺菌劑對斑馬魚的急性毒性作用

22%多菌靈殺菌劑對斑馬魚的急性毒性試驗結(jié)果見表2。22%多菌靈殺菌劑對斑馬魚LC50值隨時間延長而變小，毒性增加，其24、48、72、96 h LC50分別為：8.53、8.39、8.07和7.64 mg/L；斑馬魚的安全濃度為0.764 mg/L。

試驗觀察發(fā)現(xiàn)，低質(zhì)量濃度組的斑馬魚中毒癥狀不明顯；高質(zhì)量濃度組的斑馬魚魚鰓充血，興奮異常，尤其是高濃度處理，隨著試驗時間的增加，試驗對象開始失衡，魚體側(cè)翻，身體扭曲變形，尾部痙攣，在水中上下翻滾，腹部朝上，魚體發(fā)白，逐步出現(xiàn)死亡。

3結(jié)論與討論

目前，將發(fā)光細(xì)菌應(yīng)用于污染物毒性測定是進(jìn)行生物毒性檢驗的毒理學(xué)檢測方法之一，發(fā)光菌主要有海洋費氏弧菌（Vibrio fischeri）和淡水青海弧菌Q67（Vibrio-qinghaiensis sp.-Q67）。青?；【鶴67是1985年我國學(xué)者分離出的一種新型淡水發(fā)光菌[13]，在朱文杰等[14]的共同努力下，建立了使用Q-67為菌種，以Veritas TM 微孔板光度計為發(fā)光強度測試設(shè)備的淡水發(fā)光菌毒性測試方法（MTA法），在pH范圍為65～11.0時均能生長良好，對毒物的反應(yīng)敏感。該方法具有應(yīng)用范圍廣、易于操作、相關(guān)性好、反應(yīng)快速等特點[15]。國內(nèi)研究學(xué)者利用青?；【鶴67對取代酚類、重金屬等環(huán)境污染物進(jìn)行了急性毒性的研究，已取得較好地效果[9]。通常認(rèn)為發(fā)光細(xì)菌的光反應(yīng)是在熒光素酶的催化作用下進(jìn)行的，其還原形式（FMNH2）結(jié)合分子中的NO2、-OH和-NH2等氫鍵結(jié)合，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成黃素單核苷酸、核酸和水，并伴隨著光的釋放過程[10]。當(dāng)青?；【鶴67接觸到農(nóng)藥時，其正常的新陳代謝會受影響，其表現(xiàn)為發(fā)光強度受到抑制，從而反應(yīng)農(nóng)藥的毒性效應(yīng)[11]。

根據(jù)試驗，獲得22%多菌靈殺菌劑對青海弧菌Q67的EC50為7.70 mg /L；若以EC50為毒性指標(biāo)，22%多菌靈殺菌劑對青?；【鶴67的毒性高于敵百蟲（1.06×10-2 mol/L），但低于吡蟲啉（2.64×10-4 mol/L）、抗蚜威（5.12×10-4 mol/L）[16]。姜丹等[17]報道磷酸三苯酯、亞磷酸二芐酯、眼磷酸二苯酯、亞磷酸三丁酯對青?；【鶴67的EC50毒性為1.91×10-5～3.11×10-5 mol/L，其毒性均高于多菌靈，這些有機磷酸酯中含有芳香環(huán)數(shù)為2～3個，從多菌靈的化學(xué)結(jié)構(gòu)可知，多菌靈含有1個苯香環(huán)結(jié)構(gòu)，由此可以進(jìn)一步證實，芳香環(huán)數(shù)越多，污染物對發(fā)光菌Q67的急性毒性越大。鄒立等[18]和汝少國等[19]也認(rèn)為含苯環(huán)結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，其取代基與苯環(huán)形成的離子域大π鍵越大，電子云密度越大，污染物毒性越強。

根據(jù)現(xiàn)行農(nóng)藥對魚類毒性的分級標(biāo)準(zhǔn)（劇毒，LC50 0.1 mg/L；高毒0.1 LC50 1.0 mg/L；中毒，1.0 LC50 10.0 mg/L；低毒，LC50> 10.0 mg/L）[20]，而22%多菌靈殺菌劑96 h LC50為7.64 mg/L，對斑馬魚毒性中毒；研究發(fā)現(xiàn)，22%多菌靈殺菌劑對斑馬魚的毒性大于25%甲霜·霜霉威可濕性粉劑（96 h LC50為120.0 mg/L）[21]、300g/L 雙酰草胺乳油（96 h LC50為31.19 mg/L[21]）和35%吡·異可濕性粉劑（96 h LC50為8905 mg/L）[21]，但小于25%氟蟲腈懸浮劑（96 h LC50為0.60～0.81 mg/L）[20]和10%吡唑草胺乳油（96 h LC50為271 mg/L）[21]。研究發(fā)現(xiàn)，不同農(nóng)藥對斑馬魚的急性毒性沒有規(guī)律可循，這可能與藥劑的活性特點和加工劑型有關(guān)。丁悅等[22]研究發(fā)現(xiàn)50%多菌靈懸浮劑對斑馬魚毒性為低毒；劉彥良等[23]研究發(fā)現(xiàn)20%二甲戊靈微囊懸浮劑及20%二甲戊靈乳油對斑馬魚的96 h LC50分別為57.81和0.31mg/L，二者相差186倍。

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