禽安卡拉病研究進展常超越

常超越　吳同壘　李蘊玉　張建文　張召興　張志強　賈青輝　李佩國

摘要安卡拉病由禽腺病毒C群IV血清型病毒引起，臨床上患病雞以心包積液和肝炎為典型病理變化。近些年，我國不同省份都有病例報道，發(fā)病和死亡情況不盡相同，對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經濟損失。安卡拉病毒有垂直和水平2種傳播方式，可感染多種品系雞群。結合國內外研究，總結了目前安卡拉病毒的生物學特性、流行病學、診斷技術及其防治措施，以期為科學研究和臨床應用提供重要的參考。

關鍵詞安卡拉病；腺病毒；研究進展

中圖分類號S858.31文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）33-0100-03

Research Progress of Fowl Ankara Disease

CHANG Chaoyue，WU Tonglei*，LI Yunyu，LI Peiguo* et al

（Hebei Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine，Hebei Normal University of Science &Technology，Qinhuangdao，Hebei 066004）

AbstractFowl Ankara Disease （FAD for short） was caused by Fowl Aviadenovirus （FAV for short） species C，Strain serotype 4.The typical clinical pathological changes of diseased chickens were pericardial effusion and hepatitis.In recent years，the related cases were reported from different provinces in China，and the incidence and death were different.FAD caused huge economic loss to the poultry industry.FAV was able to been transmitted by vertical and horizontal ways，and infected a variety of flocks.Combined with the latest research at home and abroad，the virus biological characteristics， epidemiology，diagnosis technology and prevention and control methods were summarized to provide the important reference for further research and clinical application.

Key wordsAnkara disease；Fowl Aviadenovirus；Research progress

禽腺病毒（FAV）是腺病毒屬的成員，可引起許多對家禽生產產生重要影響的疾病[1]。1987年在巴基斯坦靠近卡拉奇的安卡拉地區(qū)發(fā)現一種由腺病毒引起禽心包積液和肝炎為典型病理變化的疾病——心包積水綜合征（Hydropericardium syndrome，HPS），又稱安卡拉病、安哥拉?。ˋDV）、荔枝病、心包積水肝炎綜合征（ HHS），經鑒定病原為禽腺病毒4型（FAV-4）。該病毒可導致家禽，尤其是肉雞心包積水、嚴重肝炎，引起較高的死亡率；同時，可引起免疫抑制，造成機體對疫苗的免疫應答失敗，繼發(fā)新城疫、大腸桿菌病等疫病，加劇病情發(fā)展，這是導致高死亡率的原因?？傊?，FAV-4給養(yǎng)雞業(yè)帶來了嚴重的危害。筆者從FAV-4的病原學、安卡拉病的流行病學、檢測方法及防治等方面的研究進展進行綜述，為其科學研究和疾病臨床提供重要的參考。

1安卡拉病原學

安卡拉病毒為腺病毒科禽腺病毒屬（I亞群禽腺病毒）禽腺病毒C群血清Ⅳ型（Fowl adenovirus serotype Ⅳ，FAV-4）。FAV-4病毒粒子無囊膜，呈球形，20面體對稱結構，直徑70～90 nm，線狀的雙股DNA與核蛋白形成直徑60～65 nm的髓芯，被包裹于衣殼內。有12個五鄰體（Penton）、240個六鄰體（Hexon）和纖突蛋白（Fiber1和Fiber2）[2]，五鄰體和纖突的頭節(jié)區(qū)可與細胞表面的病毒受體結合，在病毒感染細胞過程中起著非常重要的作用。資料顯示，Hexon蛋白是最主要的衣殼蛋白，包括位于病毒里面的保守片斷和突出在病毒表面的變異環(huán)，含有特異的中和抗原決定基[3]，也是中和抗體的靶標。

FAV-4病毒粒子可通過平均孔徑為0.1 μm的濾膜，病毒的酸堿耐受度為pH 3～10。與其他腺病毒相比，FAV-4可耐受 60 ℃ 30 min 或 50 ℃ 1 h，但 60 ℃ 1 h 或80 ℃ 10 min 或 100 ℃ 5 min可迅速滅活。另外，5%氯仿或10%乙醚可破壞病毒，使其失去感染性[4]。

2流行病學

1987年安卡拉病在巴基斯坦安卡拉地區(qū)首次被發(fā)現并命名，在短短1年內，該病迅速傳播到巴基斯坦地區(qū)的多數肉仔雞群。1989 年墨西哥的 Queretaro 州暴發(fā)該病，其他5個州的肉雞飼養(yǎng)區(qū)于1990年廣泛發(fā)生該病。1994年，印度德里地區(qū)發(fā)生該病，隨后智利、伊拉克和秘魯也出現該病。近幾年，我國各省市相繼報道了部分養(yǎng)殖場的死亡及發(fā)病情況，常英[5]報道了遼寧省北鎮(zhèn)市曹屯牧業(yè)海蘭褐商品蛋雞3萬只，其中，55日齡海蘭褐商品蛋雞15000只，感染安卡拉病毒，死亡6 500只，死亡率為43.3%；于可響等[6]報道山東部分地區(qū)不同養(yǎng)殖場中，從病死的10～30日齡的肉雞、30～80日齡的蛋雞、20～60日齡的麻雞的肝臟、脾臟和法氏囊等病料組織中分離到10株血清4型腺病毒，對SPF雞均有很強的致病性；陳珍等[7]報道從福建省某雞場死亡的22日齡的肉雞體內分離到腺病毒4型，死亡率為28.3%。此外，吉林、河北、山東、江蘇、安徽、海南等地均有安卡拉病流行的相關報道。

FAV-4有水平傳播和垂直傳播2種方式，傳播能力較強。從感染雞群的品系來看，該病多發(fā)生于肉雞，然而近幾年感染宿主擴大到肉種雞、蛋雞、麻雞、白羽肉雞、三黃雞、土雞等品種，但尚無其他種屬感染安卡拉病的報道。該病潛伏期較短，一般少于2 d，3～5周齡雞突然死亡，死亡率高達80%[8]，持續(xù)1周左右，以后死亡數量開始減少，病程9～15 d[9]。

一直以來，禽腺病毒被認為是一種繼發(fā)性地病原，即需要其他因素的協助才可引起發(fā)病，比如飼養(yǎng)環(huán)境的改變、雞群有免疫抑制病等。但是，從目前的報道和研究看，FAV-4可以原發(fā)性地感染雞群并引起大量的死亡，這也是近幾年人們重視該病和病原的重要原因[10]。

3診斷方法

3.1臨床診斷

發(fā)病初期首先發(fā)生在長勢良好的雞只，發(fā)病快，死亡迅速，來不及表現臨床癥狀。剖檢病死雞可見心臟腫大，心肌松弛，心包內有大量淡黃色積液，內含有膠凍樣物質，個別雞的黃色積液可達10～15 mL；肺臟淤血、出血和水腫；腺胃與肌胃交界處有出血斑；肝臟腫大、色暗、充血、破裂質脆，且肝臟表面有不同程度的出血或壞死，有的呈火山口狀；個別雞腎臟腫脹蒼白，且嚴重的有尿酸鹽沉積；有時可見胸腺和法氏囊萎縮。

3.2動物回歸試驗及病理組織切片

病毒腹腔接種1日齡SPF 雞，接種雞可出現不同程度死亡。袁萬哲等[11]利用含有安卡拉病毒的尿囊液接種雞后，復制出與自然發(fā)病相同的臨床癥狀，出現典型的心包積液、肝炎等特征，病理組織切片也符合該病的特征；梁廣成等[12]利用肌肉注射方式接種3周SPF雞，待雞發(fā)病死亡后，取肝臟切片染色后也發(fā)現相同病變。SPF雞接種試驗是診斷安卡拉病的有效手段，同時證明該病毒可以原發(fā)性地引起雞的死亡。

感染安卡拉病毒死亡雞只肝臟病理切片染色后，顯微鏡觀察到許多灶形、凝固性壞死區(qū)，肝索排列紊亂，肝血竇顯著增寬，充血出血，肝細胞明顯減少，部分肝細胞出現脂肪變性，部分肝細胞核溶解，可見嗜堿性核內包涵體，此為腺病毒的特征性病理變化。另外，心、肺和腎臟中也有一定的組織學病變。

3.3病毒分離鑒定

病毒分離鑒定通常有2種方法，即雞胚分離和細胞分離，病毒分離后上電鏡觀察。

3.3.1雞胚分離。

臨床剖檢和PCR鑒定陽性的病死雞，取肝臟研磨，過濾除菌后，采取絨毛尿囊膜方法接種6～9日齡SPF雞胚，0.1 mL每胚。37 ℃孵育箱孵化24 h后觀察雞胚，剔除死胚，5 d后將剩余胚胎全部置于4 ℃過夜。次日收取尿囊液并凍存，同時觀察雞胚可見絨毛尿囊膜呈灰白色云霧狀且有不同程度的增厚；雞胚發(fā)育不良，皮膚出現明顯的出血點。取部分雞胚研磨制成懸液，同雞胚尿囊液一起進行PCR鑒定，陽性則證明該病毒從雞胚內成功復制并分離。

3.3.2細胞分離。

多數禽腺病毒可以在雞胚中增殖，在雞胚腎細胞、雞腎細胞和雞肝胚細胞上生長[13]，周斌等[14]用雞胚腎細胞培養(yǎng)禽腺病毒江蘇分離株，結果感染病毒后表現出很強的聚集性，形成細胞團或成束狀，最后脫落，其核內存在大量典型的晶格狀排列，大小為70～80 nm的腺病毒顆粒。富強等[15]將禽腺病毒Ⅰ 型和腺病毒Ⅲ型使用雞胚細胞和雞胚腎細胞培養(yǎng)制備的抗原效價作比較發(fā)現兩者無明顯差異。由此可證明腺病毒可以通過細胞培養(yǎng)分離得到。

將感染安卡拉病毒的雞胚尿囊液負染后經透射電子顯微鏡下觀察病毒形態(tài)結構，可見球形、無囊膜的病毒粒子。同時將發(fā)病死亡雞肝制成切片，也可觀察到呈20面體的病毒顆粒，呈星狀分布，具有腺病毒粒子的典型結構。

3.4分子生物學方法

FAV-4是DNA病毒，利用PCR方法可以簡單、快速、敏感的進行診斷，通常取病雞的肝臟或心包積液，提取基因組后進行PCR。設計引物選取的基因常常是hexon基因，全長2 800多堿基。袁萬哲等[16]根據hexon 基因核苷酸序列，設計引物，取提取的DNA擴增后得到hexon基因的部分片段，測序分析表明與國際參考毒株FadV-4 ON1的hexon基因序列具有較高的同源性。王龍等[17]對吉林株腺病毒擴增出的hexon基因進行系統進化樹構建，該毒株與FAV-4處于同一分支。陳珍等[7]從福建一批22日齡肉雞的組織中提取核酸并擴增出與印度分離株核苷酸同源性高達99.4%的hexon基因片段。研究表明，PCR方法敏感性高、快速，但需要相關儀器，只適用于實驗室檢查，而不能廣泛應用于臨床。

3.5血清學技術

3.5.1免疫熒光法。

實時熒光定量PCR技術可對待檢樣品實現定量檢測。國內外運用該技術檢測分型禽腺病毒已較普遍。文艷玲等[18]根據六鄰體基因的保守序列設計引物，建立了檢測Ⅰ群禽腺病毒熒光定量PCR檢測方法，結果顯示，該方法可檢測到每個反應相當于1×102個拷貝的標準品DNA，不與非Ⅰ群禽腺病毒發(fā)生交叉反應，并且用同樣的方法檢測3份Ⅰ群禽腺病毒細胞培養(yǎng)物，結果均為陽性，檢測的病毒含量為1× 106～1×108拷貝/μL。此方法特異、定量、重復性好，可以用于臨床檢測，但其過程繁瑣，需要一定的操作技術。

3.5.2瓊脂擴散法。

抗原和抗體可在瓊脂凝膠中擴散，并由近及遠形成濃度梯度，當抗原、抗體的持異性互相對應時，便可相互結合形成抗原-抗體復合物，分子量相應增加，顆粒增大，故在瓊脂凝膠中不再擴散，在抗原、抗體比例合適的位置形成白色可見的沉淀線，此種沉淀反應稱為瓊脂擴散法（AGP）。張中秋等[19]用雞腺病毒I型接種9日齡雞胚尿囊腔，直接采用感染雞胚尿囊原液制備瓊擴反應抗原，用該抗原對人工感染雞腺病毒抗體進行檢測。這種方法快速、簡便、易于操作，但敏感性較差，檢出率不高，但是可以通過檢測多個血清型來提高敏感性。

3.5.3酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法。

標準化的夾心ELISA法可用于檢測FAV-4感染的雞的各種組織，即肝臟、脾臟、黏液囊、胸腺和腎臟中的禽腺病毒Ⅰ組抗原—心包積水綜合征（IBH-HPS）。陳天驁[20]用純化的Fiber2重組蛋白作為包被抗原，建立了檢測FAV-4抗體的間接ELISA方法。與AGP法測試相比，該測定法更敏感，并且更具體[21]，操作簡便，特異性好，敏感性強，無需復雜的溫度和條件設定，是一種可以廣泛推廣應用的檢測技術。

4防治

目前，該病并無很好的治療藥物，雞安卡拉病所導致的心包積液、肺水腫、肝炎的癥狀，易采用支持療法，通過保肝通腎、止血、增強抵抗力、清熱解毒及加強消毒等方法，可以很好地控制疫病發(fā)展。從目前的文獻報道，總結出雞安卡拉病的常用防治方法。

4.1緊急免疫接種把該場病雞的肝組織勻漿經超聲處理后用福爾馬林滅活制成滅活苗，進行緊急接種能有效降低死亡率。此方法在巴基斯坦早已廣泛應用，并取得顯著效果[22]；或者緊急接種卵黃抗體（采集康復雞群的雞蛋制備）治療，也可以取得理想的效果[23]。

4.2中藥防治

從中醫(yī)上講，該病肝毒郁結不能疏泄，腎虛無力，飲溢心包，心陽陷水。治療原則應為：泄肝毒，溫腎陽，護心脈，利水道。陳秋鵬等[24]研制出以莪術、梔子、杜仲、丹參、芍藥、牽牛子等為主要成分的“加味扶正散”，在安卡拉病的治療中取得了良好的療效，可供參考。

4.3規(guī)范免疫程序，提高機體抵抗力

我國大多數雞場仍未將安卡拉病納入免疫程序，繼而雞體缺乏免疫保護，導致疫情蔓延擴散較快，因此，制定科學免疫程序，做好種雞場腺病毒的凈化及防控工作是目前預防該病的主要措施，但也要慎重選擇使用SPF蛋制作的疫苗[25]。近年來，疫苗污染受到廣泛關注，安卡拉病毒可垂直傳播，所以可通過感染腺病毒的疫苗把病毒傳染給健康雞，從而激活雞身上潛在的腺病毒，促使其發(fā)病。為確保疫苗質量，要加強對疫苗的檢測力度，防止因接種污染疫苗而造成的外源性感染。因此，養(yǎng)殖戶在購買疫苗時，一定要選擇正規(guī)廠家的優(yōu)質疫苗。另外，要從嚴格凈化腺病毒的種雞場購進種蛋或雞苗，同時加強對免疫抑制性疾病，如IBD、MD、ND、AI（ 包括 H5、H9） 、IB 等的免疫，確保免疫效果，旨在提高母源抗體保護性。在免疫過程中嚴格注意消毒，避免交叉污染。

4.4加強飼養(yǎng)管理，減少應激

安卡拉病病毒可通過污染飼料、飲水及其他用具進行水平傳播，加強雞舍內外及周圍環(huán)境的消毒，注重生物安全。定期添加提高免疫力的抗病毒藥物，如黃芪多糖、板藍根類，以有效抵抗該病感染和防止繼發(fā)其他細菌性感染，切忌添加增加肝腎代謝負擔的抗生素類。由于心包積液導致氧氣供應不足是造成死亡的直接原因，因此降低飼養(yǎng)密度、增加負壓通風、提供足夠的氧氣可以有效降低死亡率。實踐證明，早期控制得當，可有效遏制疫病蔓延，雖不能消滅該病，但可將總死亡率控制在 5% 以內，極大降低經濟損失[26]。

6展望

FAV-4是引起禽安卡拉病，即心包積液—肝炎綜合（Hydropericardiumhepatitis syndrome，HHS）的主要病原。病毒可在雞胚腎細胞和肝細胞內增殖，并產生雞胚和細胞病變，通過感染試驗能夠進行病毒分離。安卡拉病毒可經胚胎垂直傳播，也可隨飲水、糞便、空氣流通等水平傳播，傳播速度快，發(fā)病急，死亡率高。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展壯大，安卡拉逐漸在我國蔓延，給養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴重的經濟損失。目前，安卡拉病的診斷技術仍停留在PCR、熒光抗體檢測、瓊脂擴散實驗等方法，敏感性高，但耗時長，且市面上并無有效的治療藥物及疫苗等生物制劑，只能依靠自制滅活苗或卵黃抗體進行緊急治療，但制作條件非一般養(yǎng)殖戶所能達到。此方法既不能從根本上治愈此病，也不能廣泛應用于養(yǎng)殖業(yè)，且存在散毒、免疫應激等危害。因此，為了減輕安卡拉病給家禽生產帶來的經濟損失，建立實用、低成本、高效的ELISA檢測方法，研制膠體金試紙條等快速檢測方法，以及疫苗的開發(fā)和抗病毒藥物的研制成為今后相關研究的重要方向。

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