牡丹籽油軟膠囊回復突變試驗的研究

張爽　童琳　許勇　李舜　葉紅

摘要[目的]采用鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗（Ames）對牡丹籽油軟膠囊進行安全性毒理學試驗。[方法]試驗選用鼠傷寒沙門菌TA97、TA98、TA100和TA102菌株，將牡丹籽油軟膠囊配制成濃度為5.0、1.0、0.2、0.04 mg/皿4個劑量，和陽性對照組（疊氮鈉、2-氨基芴、敵克松）進行比較，觀察各菌株的回變菌落數(shù)。[結果]牡丹籽油對4個菌株誘發(fā)的回變菌落數(shù)均未超過對照組2倍，為陰性結果。[結論]牡丹籽油對鼠傷寒沙門氏菌無直接致突變作用。

關鍵詞鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗； 致突變性； 誘變； 牡丹籽油

中圖分類號TS225.1文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）33-0079-02

Study on Reversion Mutation Test of Peony Seed Oil Soft Capsule

ZHANG Shuang， TONG Lin， XU Yong，YE Hong* et al

（Anhui Academy of Medical Sciences， Hefei， Anhui 230061）

Abstract[Objective ]To study the safe toxicology of Peony Seed Oil Soft Capsule by Salmonella typhimurium /Mammalian Microsomal Enzyme Test （Ames）. [Method]To use Peony Seed Oil and adopt Ames test，Salmonella typhimurium TA97， TA98， TA100 and TA102 strains were selected.Sodium azide，2aminofluorene，dexon was chosen as a mutagen，respectively add 5.0，1.0，0.2，0.04 mg /dish extract，and statisticalling revertant colonies.[Result]The number of revertant colonies was no more than twice of that of spontaneous colonies for each dosage group and there was no doseresponse relationship existed.[Conclusion]Peony seed oil had no mutagenicity in this test.

Key wordsSalmonella typhimurium /Mammalian microsomal enzyme test； Mutagenicity； Mutation； Peony seed oil

牡丹籽油是牡丹籽中提取的植物油，是我國特有的木本堅果油。牡丹籽油具有很高的總營養(yǎng)價值，成分結構合理，含有豐富的多不飽和脂肪酸，亞麻酸含量是橄欖油的200多倍，又不易氧化沉積在人體血管壁、心臟冠狀動脈等部位，是非常理想的食用油[1]。筆者采用鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗（Ames）對牡丹籽油軟膠囊的致突變性進行了評價，并同時對其抗突變作用及機理加以研究，為牡丹籽油保健食品的開發(fā)應用提供了一定的科學參考[2]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品。牡丹籽油軟膠囊，褐色軟膠囊，規(guī)格：0.5 g/粒，60粒/瓶，批號20160310，常溫密閉干燥處保存。

1.1.2主要試劑。

誘變劑：二甲基亞砜，美國aladdin工業(yè)公司，批號L1503022；疊氮鈉，上海化學試劑有限公司，批號Z4183；2-氨基芴，美國sigma公司，批號STBF2332V；敵克松，德國Dr.Ehrenstorfer公司，批號40709。

大鼠肝液10% S9Mix，美國MOLTOX公司，批號3601。

1.2方法

1.2.1菌株制備。由安徽省醫(yī)學科學研究院購買并鑒定合格的鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株藥片（TA97、TA98、TA100、TA102，美國MOLTOX公司），取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5 mL，將菌株藥片直接接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，于37 ℃振蕩（100次/min），菌液濃度不少于1×109～2×109 CFU/mL。代謝活化系統(tǒng)采用美國MOLTOX公司的大鼠肝液10% S9 Mix作為體外活化系統(tǒng)（間接致癌物測定其活性符合試驗要求）。按照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003年版）第一部分毒理學評價檢驗、鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶（AMES）試驗方法。

1.2.2試驗步驟。

在頂層培養(yǎng)基平板摻入法：在頂層培養(yǎng)基（45 ℃保溫）中依次加入增菌好的菌液0.1 mL，混勻；加樣品溶液0.1 mL（需活化時加入10% S9混合液0.5 mL），再混勻，迅速倒入底層培養(yǎng)基上，轉動平皿均勻分布，平放固化，37 ℃培養(yǎng)48 h觀察結果。Ames試驗中，受試物根據(jù)毒性測定結果，設5.0、1.0、0.2、0.04 mg/皿 4個劑量組，同時設置對照組，包括陽性對照組（疊氮鈉、2-氨基芴、敵克松），溶劑對照組（二甲基亞砜、蒸餾水），未處理對照組（試驗時只在培養(yǎng)基上加菌液，不加其他任何試劑），所有對照組均包括加S9和不加S9 2種情況。每劑量、每種系統(tǒng)均做3個平皿。37 ℃培養(yǎng)48 h后，計數(shù)每皿回變菌落數(shù)。整套試驗在相同條件下重復1次。

1.2.3結果判定。以直接計數(shù)培養(yǎng)基上長出回變菌落數(shù)的多少而定，如在背景生長良好條件下，受試物組回變菌落數(shù)增加1倍以上（即回變菌落數(shù)等于或大于2乘以未處理對照數(shù)），并有劑量反應關系或至少某一測試點有可重復的并有統(tǒng)計學意義的陽性反應，即可認為該受試物誘變試驗陽性。

2結果與分析

Ames試驗檢測牡丹籽油軟膠囊致突變性結果，牡丹籽油各劑量組對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100和TA102誘發(fā)的回變菌落數(shù)見表1和表2。結果顯示，在加和不加S9條件下，牡丹籽油對4個菌株誘發(fā)的回變菌落數(shù)均未超過未處理對照組1倍以上，為陰性結果，表明牡丹籽油對鼠傷寒沙門氏菌無直接和間接致突變作用。

Ames試驗是用來檢測致突變化學物的一種靈敏、快速方法。其原理主要為人工誘變鼠傷寒沙門氏菌菌株，形成組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變菌株[3]。這種菌株不能合成組氨酸，因而在無組氨酸的培養(yǎng)基上不能生長。在誘變劑的作用下，突變型沙門氏菌會回復為野生型，自行合成組氨酸，形成菌落[4]。表1和表2結果說明，在加和不加S9的系統(tǒng)下，陽性

誘變劑的菌落回變數(shù)明顯增加，試驗重復性好，系統(tǒng)可信。

3討論

菌株制備對于試驗非常重要。菌株制備該試驗采用了過夜振動搖晃與靜置培養(yǎng)2種方法。過夜振動搖晃13～15 h后，菌株的濃度可以達到試驗需要濃度1×109～2×109 CFU/mL，而靜置培養(yǎng)15 h的菌株濃度達不到試驗要求，所以在試驗中需要采用振動搖晃的方式進行菌株制備。在平板摻入法試驗中，TA97菌株對于葡萄糖的濃度比較敏感。根據(jù)購買菌株的MOLTOX公司的指導意見，在標準培養(yǎng)基配方中，TA97的生長往往會受到葡萄糖水平的抑制（2%的葡萄糖），在0.4%葡萄糖的標準培養(yǎng)基上生長得更好。所以在配置底層培養(yǎng)基平皿時，分別制備了2.0%和0.4%2個葡萄糖濃度的平皿，但是試驗結果發(fā)現(xiàn)沒有出現(xiàn)顯著差異。

牡丹籽油作為新興的油類保健食品，對于其的質(zhì)量控制非常關鍵[5]。TA97、TA98、TA100可用于檢測移碼突變，TA102可用于檢測堿基對置換，由于TA系的菌株回復突變的特異性高，所以有些致突變物可能難以檢出。通過對Ames試驗的改進，或?qū)で笠环N更加簡便的方法用來檢測牡丹籽油保健食品的安全性是今后的研究目標[6]。

參考文獻

[1]

翟文婷，朱獻標，李艷麗，等.牡丹籽油成分分析及其抗氧化活性研究[J]. 煙臺大學學報（自然科學與工程版），2013，26（2）：147-150.

[2] 王心如.毒理學基礎[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2003.

[3] 錢星文，劉凡，彭菊，等.當歸雙參蛤蟆油片的遺傳毒性實驗研究[J].光明中醫(yī)，2015（3）：499-500.

[4] 石愛華，李衛(wèi)東，翟鵬貴，等.西洋參提取物的毒理學試驗研究[J].中華中醫(yī)藥學刊，2014（8）：2002-2004.

[5] 王偉偉.牡丹籽油中脂肪酸的構成及生理功能[J].中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2011（36）：8-9.

[6] 張偉清，曹進，丁宏，等.對保健食品理化質(zhì)量標準建立的思考[J].中國藥師，2016，19（7）：1352-1354.