流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光測(cè)定頭孢類藥物研究

王偉　趙凱

摘要：分子發(fā)光光譜分析法中的化學(xué)發(fā)光分析法作為一種有效的分析方法，主要依據(jù)是檢測(cè)體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與體系中待測(cè)物濃度在一定條件下將會(huì)呈現(xiàn)出線性定量關(guān)系的原理，并通過(guò)儀器對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，因此可確定待測(cè)物含量的一種分析方法。此分析方法具備設(shè)備簡(jiǎn)單，線形范圍寬，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，與流動(dòng)注射相結(jié)合將表現(xiàn)出精密程度高，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化并且具有分析速度快等特點(diǎn)。文章對(duì)近些年頭孢類藥物的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光檢測(cè)進(jìn)行了總結(jié)。

關(guān)鍵詞：化學(xué)發(fā)光法；流動(dòng)注射；頭孢類藥物

化學(xué)發(fā)光分析法（ChemiLuminescence，CL）是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)過(guò)程當(dāng)中產(chǎn)生的輻射光的強(qiáng)度來(lái)確定各種物質(zhì)含量的分析方法，指的是某些化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中發(fā)出可見(jiàn)光的現(xiàn)象。其發(fā)光的反應(yīng)機(jī)理是反應(yīng)體系中的某些物質(zhì)的分子吸收了反應(yīng)所釋放出的能量而由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，然后再由從激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)，同時(shí)將能量以光輻射的形式釋放產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光其過(guò)程可表示為A+B→C*+D，C*→C+hv或A+B→C*+D，C*+F→F*+c，F(xiàn)*→F+hv。將化學(xué)發(fā)光反應(yīng)應(yīng)用于分析化學(xué)當(dāng)中，據(jù)某一時(shí)刻的發(fā)光強(qiáng)度或者反應(yīng)的總發(fā)光量來(lái)確定整個(gè)體系當(dāng)中的相對(duì)應(yīng)組分含量的分析方法叫作化學(xué)發(fā)光分析法。該種方法雖然具有儀器簡(jiǎn)單、線性范圍寬、靈敏度高并且不存在空白的優(yōu)點(diǎn)，但化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象出現(xiàn)時(shí)間短并且隨時(shí)間變化發(fā)光強(qiáng)度會(huì)有較大變化，而且受到環(huán)境因素的影響較大，導(dǎo)致反應(yīng)進(jìn)程很難控制，選擇性和重現(xiàn)性都較差，很難實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等。流動(dòng)注射技術(shù)卻可以彌補(bǔ)此法的不足之處，所以將流動(dòng)注射技術(shù)與化學(xué)發(fā)光法有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，集二者之優(yōu)點(diǎn)，最終就可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，而且還能將化學(xué)發(fā)光信號(hào)的重現(xiàn)性顯著提高，因而，化學(xué)發(fā)光分析法成了一種靈敏、高效的痕量和超痕量分析技術(shù)。

目前，主要使用的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系有：（1）Ce（Ⅳ）—Rh6G：（2）高錳酸鉀；（3）磷鉬釩雜多酸—魯米諾；（4）Luminol—H₂O₂；（5）魯米諾—高錳酸鉀；（6）NBS—熒光素等。作為高效的痕量和微量分析方法，化學(xué)發(fā)光分析法有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的應(yīng)用前景都較為廣泛。本研究從對(duì)與生命相關(guān)物質(zhì)以及目前各種藥物和藥物在人體中代謝產(chǎn)物的化學(xué)發(fā)光分析進(jìn)行了簡(jiǎn)要綜述。

1頭孢類藥物

頭孢類藥物屬于頭孢菌素類抗生素，微生物或高等動(dòng)植物在生活過(guò)程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物即為抗生素。將微生物生物合成的抗生素為基礎(chǔ)，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，得到的具有新的抗菌活性的化合物即為半合成抗生素。頭孢類抗生素的共同結(jié)構(gòu)如圖1所示。

頭孢菌素類抗生素有兩個(gè)不同的側(cè)鏈集團(tuán)R₁與R₂，并且可以在這兩處引入不同的功能基團(tuán)，因此可以合成一系列頭孢菌素；其中抗菌活性決定基團(tuán)為R₁影響抗菌效率以及藥代動(dòng)力學(xué)的性質(zhì)的為R₂。近年來(lái)一直占抗生素類藥物首位的為頭孢菌素類抗生素。因此測(cè)定分析該種類藥物都有著極其重要的意義。在這些檢測(cè)方法中有高效液相色譜法、熒光法、吸附極譜法、化學(xué)發(fā)光法等?，F(xiàn)對(duì)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行綜述。

2測(cè)定頭孢類藥物常用的化學(xué)發(fā)光體系

2.1 Ce（IV）—Rh6G化學(xué)發(fā)光體系

試驗(yàn)研究表明，Ce（Ⅳ）氧化含巰基（—SH）的化合物會(huì)產(chǎn)生弱發(fā)光，Rh6G也能夠大大增強(qiáng)此弱發(fā)光，據(jù)此建立了測(cè)定頭孢類—內(nèi)酰胺類抗生素的FIA—CL分析方法。楊季冬等在選定的最佳條件下，經(jīng)測(cè)試對(duì)頭孢拉定，硫酸鈰濃度為0.010 mol/L時(shí)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為最大；而對(duì)頭孢哌酮，硫酸鈰濃度為0.005 mol/L時(shí)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為最大，幾個(gè)典型的頭孢類抗生素化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度均在1.0×10^-8～1.5×10^-5g/mL范圍內(nèi)且與其發(fā)光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系。

范順利等研究發(fā)現(xiàn)，在Na₅P₃O₁₀的增敏下，Ce（Ⅳ）與β—內(nèi)酰胺菌素作用可產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光性，而與某些含巰基的化合物作用則產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。Ce（Ⅳ）與頭孢氨芐直接作用沒(méi)有化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生；但將頭孢氨芐預(yù)先水解再與Ce（Ⅳ）作用，因其水解產(chǎn)物1含有巰基，則可產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一推測(cè)，并且發(fā)現(xiàn)羅丹明6G對(duì)該發(fā)光體系具有很強(qiáng)的增敏作用。研究還得到當(dāng)羅丹明6G的濃度為1.0×10^-4mol/L，H₂SO₄濃度和加熱時(shí)間分別為1.6 mol/L，15 min，Ce（Ⅳ）與H₂O₄混合載液的流速為10 mL/min，載液HSO₄的濃度為0.3 mol/L，Ce（Ⅳ）的濃度為0.02 mol/L時(shí)為最佳試驗(yàn)條件，在選定的最佳試驗(yàn)條件下，測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度k（相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度單位）與頭孢氨芐質(zhì)量濃度c（mg/L）在0.10～10.0 mg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其回歸方程Ia=0.33+1.59c（n=11，r=0.999 4）。對(duì)1.00 mg/L頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了11次平行測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%，根據(jù)IUPAC的規(guī)定計(jì)算出該方法的檢出限為0.06 mg/L。

周杰等研究發(fā)現(xiàn)有一定的巰基存在頭孢他啶的降解產(chǎn)物當(dāng)中，運(yùn)用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法考察了Ce（Ⅳ）與此降解產(chǎn)物作用而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的條件，研究表明羅丹明6G對(duì)該體系有著較強(qiáng)的增敏作用，據(jù)此建立了測(cè)定頭孢他啶的新方法。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)羅丹明6G濃度為5×10^-5，H₂SO₄濃度為1.6 mol/L、時(shí)間為10 min、硫酸鈰溶液濃度為0.02 mol/L、主泵速為30 r/min（硫酸鈰溶液）、副泵速為20 r/min（H2S04溶液）時(shí)為最佳試驗(yàn)條件。對(duì)6.0mg/L頭孢他啶標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行10次平行測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%。根據(jù)3S/K，計(jì)算出該方法的檢出限為0.070 mg/L，試驗(yàn)結(jié)果較滿意。

2.2 Mn（Ⅲ）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系

在強(qiáng)酸性介質(zhì)中，基于初生態(tài)Mn（Ⅲ）直接氧化頭孢拉定產(chǎn)生強(qiáng)化學(xué)發(fā)光，將在線恒電流電解產(chǎn)生Mn（Ⅲ）與流動(dòng)注射技術(shù)相結(jié)合，創(chuàng)建了流動(dòng)注射電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定頭孢拉定的新方法。陳小利等在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，發(fā)現(xiàn)MnSO₄濃度為0.2 mol/L，H₂SO₄的濃度約等于3.0 mol/L、電解電流為12.0 mA、流速為2.0 mL/min時(shí)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最大，在上述最佳的選定實(shí)驗(yàn)條件下，頭孢拉定的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與其質(zhì)量濃度在1 0×10^-7～5.0×10^-5g/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.3高錳酸鉀化學(xué)發(fā)光體系

在強(qiáng)酸性介質(zhì)中，基于KMnO₄氧化頭孢類藥物能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，采用流動(dòng)注射技術(shù)，建立了頭孢類抗生素藥物的測(cè)定新方法。實(shí)驗(yàn)表明在有甲醛存在的情況下，頭孢菌素類抗生素可直接被酸性KMnO₄氧化并產(chǎn)生強(qiáng)烈的化學(xué)發(fā)光，頭孢類抗生素的濃度與其發(fā)光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系。并在HCl濃度為1.5 mol/L，HCHO體積分?jǐn)?shù)6%，KMnO₄濃度為3.2×10^-4mol/L，進(jìn)樣泵的泵速為20 r/min，載流泵的泵速為22 r/min，進(jìn)樣體積為100 pL，光電倍增管—800V的試驗(yàn)條件下，最終試驗(yàn)表明，其發(fā)光強(qiáng)度與頭孢氨芐的質(zhì)量濃度在0.8～25 g/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，頭孢拉定的線性范圍為0.8～2 g/mL。

2.4磷鉬釩雜多酸—魯米諾化學(xué)發(fā)光體系

瞿鵬等基于魯米諾在NaOH介質(zhì)中，磷鉬釩雜多酸可將其氧化產(chǎn)生較強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光，頭孢曲松鈉能夠強(qiáng)烈抑制其化學(xué)發(fā)光，據(jù)此建立了磷鉬釩雜多酸一魯米諾一頭孢曲松鈉化學(xué)發(fā)光抑制法測(cè)定頭孢曲松鈉的新體系，并結(jié)合流動(dòng)注射分析技術(shù)測(cè)定藥品中的頭孢曲松鈉.在磷酸二氫鈉質(zhì)量濃度為8.0×10^-6g/mL、釩酸鈉質(zhì)量濃度為2.0×10^-6g/mL，H₂SO₄的濃度為0.01 mol/L，NaOH的濃度為0.1 mol/L，3.0 mL/min作為載流的流速時(shí)，相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與頭孢曲松鈉的質(zhì)量濃度在4.0×10^-7～4.0×10^-5g/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系；此方法的檢出限為8×10^-8g/mL對(duì)8.0×10^-6g/mL的頭孢曲松鈉連續(xù)進(jìn)行11次測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%。此方法已被成功地應(yīng)用于頭孢曲松鈉藥品的測(cè)定。

2.5 Luminol—H₂O₂化學(xué)發(fā)光體系

武現(xiàn)麗等利用在堿性介質(zhì)中，頭孢哌酮鈉對(duì)Luminol—H₂O₂化學(xué)發(fā)光體系有著較大的增強(qiáng)作用，建立了頭孢哌酮鈉流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光測(cè)定法。武現(xiàn)麗等選擇0.01 mol/LNaOH溶液為反應(yīng)介質(zhì)、Luminol的濃度為2×10^-4～mol/L，H₂O₂的濃度為0.8mol/L為最佳試驗(yàn)條件。在選定的最佳試驗(yàn)條件下，頭孢哌酮鈉質(zhì)量濃度在5.0×10^-7×4.0×10^-5g×mL范圍內(nèi)，與發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)值成良好的線性關(guān)系。

2.6魯米諾—高錳酸鉀發(fā)光體系

陳麒等研究表明孢氨芐抗生素在對(duì)魯米諾一高碘酸鉀化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中有很強(qiáng)的增敏作用，因此通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)條件，并構(gòu)建了頭孢氨芐的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析法。他們?cè)诙啻卧囼?yàn)中得到當(dāng)氫氧化鈉的濃度為0.1 mol/L、魯米諾濃度為1.0×10^-4mol/L，KIO₄濃度為1.0×10^-5mol/L為最佳試驗(yàn)條件，在此條件下得到檢出限為9×10^-10g/mL，線性范圍為1×10^-9g/mL～2×10^-7g/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%。此法用于頭孢氨芐膠囊中藥物含量的測(cè)定，結(jié)果較滿意。

王玨等研究發(fā)現(xiàn)，頭孢他啶對(duì)魯米諾一高錳酸鉀的體系有著明顯增敏作用，將納米金加入體系后，其增敏作用會(huì)顯著增強(qiáng)。通過(guò)運(yùn)用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法，在魯米諾一高錳酸鉀的發(fā)光體系中加入納米金，其體系的發(fā)光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，因此構(gòu)建了測(cè)定頭孢他啶的新方法。研究表明當(dāng)納米金粒徑為16 nm，NaOH的濃度為0.18 mol/L、納米金濃度為3.5×10^-5mol/L、高錳酸鉀濃度為6.0×10^-4mol/L、魯米諾的濃度為8.0×10^-4mol/L為試驗(yàn)最佳條件。在最佳的試驗(yàn)選定條件下，將同一個(gè)系列的不同濃度的頭孢他啶溶液進(jìn)行分析測(cè)定。最終得出在加入納米金后，測(cè)得的頭孢他啶靈敏度更高、檢出限更低、線性范圍變寬。

2.7魯米諾—鐵氰化鉀發(fā)光體系

當(dāng)前，臨床上醫(yī)學(xué)應(yīng)用最廣泛的長(zhǎng)效、第三代廣譜頭孢菌素類抗生素

是頭孢曲松鈉，所以測(cè)定對(duì)其藥物制劑的測(cè)定分析對(duì)于臨床用藥安全合理性都有著重要的意義。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，基于在堿性介質(zhì)中頭孢曲松鈉對(duì)魯米諾—鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光體系都有著較強(qiáng)的增強(qiáng)作用，據(jù)此建立了流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光測(cè)定頭孢曲松鈉的新方法。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)研究得知，當(dāng)魯米諾濃度為8×10^-4mol/L，K₃Fe（CN）₆溶液濃度為4.0×10^-4mol/L，NaOH濃度為0.20 mol/L時(shí)為最佳試驗(yàn)條件，在選定的最佳條件下，得到該方法的測(cè)定范圍為0.1～400 mg/L，檢出限為0.06 mg/L.對(duì)0.2 mg/LCRO溶液進(jìn)行10次平行測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%。

2.8 NBS—熒光素化學(xué)發(fā)光體系

張淑瓊研究在氫表明在氧化鈉介質(zhì)中，鹽酸頭孢吡肟可以被N一溴代琥珀酰亞胺（NBS）氧化并產(chǎn)生微弱的化學(xué)發(fā)光，在與熒光素共存的狀態(tài)下可產(chǎn)生較強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光，因此結(jié)合流動(dòng)注射技術(shù)，可建立測(cè)定鹽酸頭孢吡肟的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光方法。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)熒光素濃度為3 mmol/L、氫氧化鈉濃度為0.05 mol/L、NBS濃度為0.025 mol/L時(shí)為最佳試驗(yàn)條件，在最佳的試驗(yàn)選定條件下，發(fā)光強(qiáng)度與鹽酸頭孢吡肟質(zhì)量濃度在0.05 mg/L～10 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。其線性方程ΔI=147.34 c+5.741 3（c：mg/L，R₂=0.999 9）。對(duì)5.000 mg/L鹽酸頭孢吡肟連續(xù)平行測(cè)定11次，相對(duì)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Quasi Standard Deviation，RSD）為43%。

何樹(shù)華等研究表明頭孢吡肟和頭孢克肟在堿性的介質(zhì)中被NBS（N一溴代琥珀酰亞胺）氧化后，其產(chǎn)生的能量可激發(fā)共存的熒光素，從而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，據(jù)此建立了一種直接測(cè)定頭孢吡肟與頭孢克肟的化學(xué)發(fā)光方法。研究表明，當(dāng)熒光素濃度超過(guò)4.0 mmol/L，NaOH濃度為0.05 mol/L，NBS的最佳濃度均為0.03 mol/L為最佳試驗(yàn)條件，在最佳試驗(yàn)條件下，對(duì)鹽酸頭孢吡肟和頭孢克肟進(jìn)行測(cè)定，對(duì)5 mg/L的頭孢吡肟平行測(cè)定11次，其RSD為2.5%。根據(jù)IUPAC建議，計(jì)算得檢出限為5.7 g/L；對(duì)0.5 mg/L的頭孢克肟平行測(cè)定11次，其RSD為2.9%，計(jì)算得檢出限為0.048 mg/L。

3展望

化學(xué)發(fā)光分析法因?yàn)槠鋬x器設(shè)備簡(jiǎn)單、靈敏度高，并且可以與其他技術(shù)的聯(lián)合使用，所以應(yīng)用范圍會(huì)不斷擴(kuò)大，特別是在環(huán)境監(jiān)測(cè)分析與免疫分析上會(huì)有更加廣泛的應(yīng)用。當(dāng)前開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)且具有高發(fā)光率的新發(fā)光試劑仍是重點(diǎn)研究方向。這種分析方法因其具有靈敏度高、線性范圍寬、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)而普遍被人們所接受并重視。伴隨著各種新的化學(xué)發(fā)光體系的不斷涌現(xiàn)，一定會(huì)完善和豐富原有的化學(xué)發(fā)光體系，使得化學(xué)發(fā)光分析法的應(yīng)用更加廣泛，尤其是與CE，HPLC等方法聯(lián)用對(duì)各種藥物進(jìn)行檢測(cè)分析，更凸顯其潛在的優(yōu)勢(shì)，作為分析化學(xué)較為活躍的新發(fā)展領(lǐng)域。

4結(jié)語(yǔ)

作為一種有效的分析測(cè)試手段，化學(xué)發(fā)光分析法具有廣泛的應(yīng)用前景，從藥物的測(cè)試分析來(lái)看，伴隨著人們健康水平不斷地提高，人們對(duì)于用藥的安全合理性、有效性提出了更高的要求，特別是藥物在人體內(nèi)不斷地變化，從而直接影響）2t門對(duì)這種藥物的評(píng)價(jià)，所以化學(xué)發(fā)光分析將會(huì)在藥物測(cè)試分析中有著更廣闊的應(yīng)用，然而還可以作如下改進(jìn)：（1）若使化學(xué)發(fā)光分析法能更廣泛地應(yīng)用于藥物的測(cè)試分析，則需要通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)和反復(fù)考查論證才能夠被廣泛地接受，而且通過(guò)大量的普及與推廣，才能不斷地完善和發(fā)展化學(xué)發(fā)光分析法。（2）化學(xué)發(fā)光分析方法儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，易于操作和推廣，憑借它獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在未來(lái)的幾年間在基層藥事業(yè)單位普及化學(xué)發(fā)光分析方法，對(duì)合理安全用藥會(huì)起到很大幫助，也會(huì)產(chǎn)生不同的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。