含有取向納米纖維束的神經(jīng)移植物構(gòu)建與神經(jīng)修復(fù)應(yīng)用研究

尹桂波　劉婕

摘要：為提高納米纖維神經(jīng)移植物的接觸引導(dǎo)，設(shè)計了一種含有取向納米纖維束的“芯鞘”型神經(jīng)移植物，它利用靜電紡高取向納米纖維膜，兩次卷繞形成“芯”和“鞘”，最后通過靜電紡絲噴覆而成。利用掃描電鏡觀察并表征了纖維及其移植物形態(tài)，測試了力學(xué)性能，將此移植物用于大鼠10 mm坐骨神經(jīng)缺損，術(shù)后兩月通過體外刺激和組織學(xué)觀察了修復(fù)效果。結(jié)果表明：通過調(diào)整靜電紡收集轉(zhuǎn)輥轉(zhuǎn)速可獲得高取向聚乳酸納米纖維，納米纖維膜工程應(yīng)力和伸長率達(dá)到（49.32±14.83） MPa和17.71%±0.06%，利用該膜構(gòu)建的神經(jīng)移植物縫合強力達(dá)到（1.18±0.40） N/針，能支持與保護(hù)神經(jīng)再生，移植兩月后，大鼠能夠感知熱與外力刺激，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，有神經(jīng)纖維和血旺細(xì)胞長入神經(jīng)移植物，證明了該構(gòu)建技術(shù)的可行性，并有可能為神經(jīng)修復(fù)提供一種新的移植材料。

關(guān)鍵詞：聚乳酸；納米纖維；靜電紡絲；神經(jīng)修復(fù)；生物性能

中圖分類號：TB383

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1009-265X（2017）06-0001-06

Construction of a Novel Nerve Regeneration Graft with NanofibersBundles and Its Application in Neural Tissue Engineering

YIN Guibo1，2， VICTOR Leung2， FRANK.K.Ko2， WOLFRAM Tetzlaff3， LIU Jie3

（1.School of Textile and Dying Engineering， Jiangsu College of Engineering and Technology， Nantong226007， China； 2.Advanced Fibrous Materials Laboratory， Department of material engineering，University of British Columbia， Vancouver， V6T 1Z4， Canada； 3.Department of Zoologyand Surgery， University of British Columbia， Vancouver， V5Z 1M9， Canada）

Abstract：To promote contact guidance， we constructed a novel nerve regeneration graft with ‘core shell structure. The aligned nanofibers membrane was collected using electrospinning technology and then rolled twice to form nanofibers bundle ‘core and ‘shell. The morphologies of nanofibers were observed using SEM and their alignment was characterized. The tensile and suture strength were also tested by a micromechanical tester. The results showed that desirable alignment could be obtained by adjusting rotation speed. Along the fiber axial direction， strength of aligned PLA nanofibers membrane reached （49.32±14.83） MPa， the elongation was17.71%±0.06%， which could protect and support nervous system tissue regeneration. The suture strength was more than adequate for suturing during implantation （1.18±0.40） N/needle. Two months after transplantation， rats could sense

heat and external stimulation， histological observation found that nerve fibers and Schwann cells infiltrated into the constructs from both proximal and distal nerve stumps. These results proved the feasibility of the construction technology. The new kind of graft may be a promising substitute for nerve regeneration.

Key words：PLA； nanofibers； electrospinning； nerve regeneration； biological properties

神經(jīng)斷裂后，所有到達(dá)神經(jīng)末端的信號將消失，如沒有外科手術(shù)的重新連接，橫斷神經(jīng)將很難再生[12]。如神經(jīng)被直接切斷，可通過手術(shù)縫合，使“端與端”重新連接，然而長距離的神經(jīng)缺損如果僅依靠手術(shù)縫合，易在斷端間產(chǎn)生張力，難以達(dá)到理想治療效果[3]。自體神經(jīng)移植一直被認(rèn)為是神經(jīng)修復(fù)的主要方法，然而長距離的神經(jīng)缺損修復(fù)時，自體神經(jīng)修復(fù)成功率大大下降，且自體神經(jīng)需要另外手術(shù)，對供體區(qū)帶來感知并發(fā)癥，手術(shù)風(fēng)險加大[45]。因此人工神經(jīng)受到人們關(guān)注，它不僅能實現(xiàn)長距離神經(jīng)修復(fù)，關(guān)鍵是神經(jīng)修復(fù)后可自行降解。與傳統(tǒng)微米級材料相比，納米材料展現(xiàn)了獲得理想神經(jīng)細(xì)胞活性的能力，降低了某些對神經(jīng)修復(fù)不利的細(xì)胞活性，如反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞活性[67]。另外，近來研究發(fā)現(xiàn)取向靜電紡纖維能夠提供導(dǎo)向信號，誘導(dǎo)軸突和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)高度極化表型。

人工神經(jīng)移植物大多設(shè)計成中空結(jié)構(gòu)，以便于兩神經(jīng)斷端嵌入縫合[8]，并保護(hù)和支持再生組織，另外它還有助于神經(jīng)再生組織的重排和神經(jīng)生長因子的釋放。然而，利用靜電紡絲技術(shù)通過轉(zhuǎn)輥直接收集形成的神經(jīng)導(dǎo)管，纖維徑向平行排列，無法引導(dǎo)神經(jīng)沿導(dǎo)管軸向生長，此外中空結(jié)構(gòu)也不利于束狀纖維的接觸引導(dǎo)?；谏鲜霰锥?，為提高接觸引導(dǎo)，又便于受損周圍神經(jīng)的縫合，本文通過靜電紡絲和卷繞技術(shù)，構(gòu)建了一種內(nèi)含取向納米纖維束的“芯鞘”式移植物，為神經(jīng)移植提供一種新型材料。

1實驗方法

1.1神經(jīng)移植物的構(gòu)建

1.1.1取向納米纖維的制備

聚乳酸（Mw=1×105；SigmaAldrich）溶于氯仿/丙酮（2∶1，V/V；SigmaAldrich）中，形成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的紡絲液。利用NANON01A型靜電紡絲機（MECC， Japan）進(jìn)行靜電紡絲，電壓25 kV，流速1 mL/h，利用直徑為20 cm的轉(zhuǎn)輥收集納米纖維，轉(zhuǎn)輥轉(zhuǎn)速分別為1 000，1 500，2 000 r/min。

1.1.2納米纖維膜的形態(tài)觀察與取向表征

利用掃描電鏡觀察纖維形態(tài)，并利用Photoshop軟件測試?yán)w維直徑，利用ImageJ軟件和Oval Profile插件表征纖維取向，即通過傅里葉變換（FFT）將掃描電鏡照片轉(zhuǎn)換為像素圖，然后利用Oval Profile插件，以像素圖中心為圓心，以1°為間隔，沿半徑方向計算像素強度和，纖維取向越高，像素和差異越大，形成的峰就越窄越高。

1.1.3含有納米纖維束的神經(jīng)移植物構(gòu)建

圖1為含有取向納米纖維束的芯鞘型神經(jīng)移植物構(gòu)建圖。如圖1所示，把高速轉(zhuǎn)輥收集的高取向聚乳酸（PLA）納米纖維膜垂直纖維方向剪成10 mm的長條（可根據(jù)斷裂神經(jīng)長度調(diào)整），卷繞形成納米纖維束“芯”。然后，再剪15 mm左右長條，卷繞在芯的表面，兩端形成2～3 mm的鞘，最后再用靜電紡絲噴覆一層納米纖維膜，形成雙層“鞘”。

1.2力學(xué)性能測試

1.2.1斷裂強力測試

采用MTSTytron 250微型強力機，沿平行與垂直纖維排列方向，測試?yán)w維膜力學(xué)性能，纖維膜長度70 mm，寬度5 mm，夾持長度30 mm，拉伸速度0.05 cm/s，每個試樣測試5次。先測試膜的面密度，然后依次計算比應(yīng)力和工程應(yīng)力，具體公式如下：

比應(yīng)力gtex=載荷（g）面密度gm2×寬度（mm）（1）

工程應(yīng)力（MPa）=比應(yīng)力gtex×9.81×ρpolymer（2）

式中：tex—纖維線密度單位，指1 000 m長的纖維所具有的重量；ρpolymer—聚合物密度。

1.2.2縫合強力測試

在距離縫合端2 mm處，利用MTSTytron 250強力機測試縫合強力，拉伸速度0.05 cm/s，每個試樣測試3次，含有取向納米纖維束的芯鞘型神經(jīng)移植物縫合強力測試示意見圖2。

1.3體內(nèi)移植與組織學(xué)觀察

1.3.1體內(nèi)移植

SD大鼠稱質(zhì)量后用10%水合氯醛（300 mL/kg）腹腔注射麻醉，取左后肢股后外側(cè)切口長約4 cm，于股后肌間隙找到坐骨神經(jīng)，在梨狀肌下方約5 mm處切除8 mm長的坐骨神經(jīng)，使其斷端回縮造成10 mm長神經(jīng)缺損（圖3（a））。將神經(jīng)斷端分別套入神經(jīng)移植物“鞘”內(nèi)1 mm，顯微鏡下7-0無創(chuàng)縫合針線將神經(jīng)外膜與神經(jīng)移植物“鞘”層縫合兩三針固定（圖3（b））。

1.3.2組織學(xué)觀察（免疫組織化學(xué)染色）

術(shù)后8周取出神經(jīng)移植物，分別對神經(jīng)移植物近、遠(yuǎn)端進(jìn)行橫向、縱向切片，采用羊抗鼠IgG1 Alexa 594和羊抗兔 IgG Alexa 488對NF160和S100蛋白進(jìn)行標(biāo)記，觀察軸突（NF160）和血旺細(xì)胞（S100）生長情況。

2結(jié)果與討論

2.1PLA納米纖維形態(tài)與取向觀察

現(xiàn)有研究表明，在取向納米纖維上的神經(jīng)元突起長度明顯比在無序納米纖維上的長，取向納米纖維能夠引導(dǎo)軸突生長[9]。因此，首先研究了靜電紡絲轉(zhuǎn)輥轉(zhuǎn)速這一影響纖維取向的最重要因素。圖4顯示了在不同轉(zhuǎn)速下獲得的掃描電鏡照片及其傅里葉變換照片，以1°為間隔，沿半徑方向的像素強度和統(tǒng)計顯示在圖5中。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)速為1 000 r/min時獲得的纖維掃描電鏡照片經(jīng)傅里葉轉(zhuǎn)換后，0～180°內(nèi)（181～360°對稱）像素強度幾乎相同，表明纖維呈無序狀排列。而當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到1 500 r/min時，從掃描電鏡可直接觀察到取向，圖5中可觀察到沿纖維取向，像素和明顯提高，出現(xiàn)峰狀像素強度圖，說明在該轉(zhuǎn)速下可獲得一致的取向性。在高壓靜電作用下，噴射流的螺旋形快速伸展與分化被認(rèn)為是納米纖維無序狀原因，當(dāng)收集轉(zhuǎn)輥表面線轉(zhuǎn)速等于或大于靜電紡絲速度時，能夠拉直噴射流故能獲得理想的纖維取向。然而當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到2 000 r/min時，從圖4、圖5中又可發(fā)現(xiàn)纖維的取向性下降，這可能是高速轉(zhuǎn)輥表面的氣流所致。

2.2神經(jīng)移植物形態(tài)

傳統(tǒng)意義上，神經(jīng)移植物大多設(shè)計成管狀，以便于神經(jīng)斷端縫合和長入。然而，如果直接利用細(xì)轉(zhuǎn)輥收集納米纖維形成管狀移植物，纖維呈徑向平行排列，與導(dǎo)管軸向平行，這將不利于神經(jīng)的接觸引導(dǎo)。為克服這一不足，設(shè)計了先紡絲再卷繞的構(gòu)建

路線，圖6（a）、（b）顯示了該神經(jīng)移植物的外觀形態(tài)，它的長度和直徑可根據(jù)受損神經(jīng)的尺寸予以調(diào)整，在本實驗中移植物纖維束“芯”長度為10 mm，直徑為3 mm，整個移植物的直徑為3.2 mm，長度15 mm左右。圖6（c）顯示了該神經(jīng)移植物橫截面掃描電鏡照片，由圖6（d）、（e）能進(jìn)一步觀察到該移植物由數(shù)以萬計的平行納米組成，纖維直徑（480±75 nm），這為受損神經(jīng)提供了更多接觸引導(dǎo)可能。此外，通過卷繞形成的纖維束還會產(chǎn)生較多的層間空隙，這又將便于再生神經(jīng)長入及營養(yǎng)與代謝物的轉(zhuǎn)移。

2.3力學(xué)性能

2.3.1纖維膜的拉伸性能

神經(jīng)移植物的機械性能對其移植后的完整與穩(wěn)定性具有重要影響，移植物必須提供足夠的生物力學(xué)性能，才能支持組織再生和降解。因此，首先測試了平行與垂直纖維取向的纖維膜力學(xué)性能，此外，鞘的外層是無序排列纖維膜，因此也測試了該纖維膜的力學(xué)性能。

圖7顯示了不同取向纖維膜的力學(xué)性能，表1為其統(tǒng)計結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，垂直纖維膜的比應(yīng)力為（0.26±0.04） g/tex，與之相比，沿纖維取向拉伸時，纖維膜比應(yīng)力達(dá)到4.19 g/tex，是垂直纖維取向拉伸的16倍，表明纖維平行排列極大提高了膜的強力。此外，盡管平行方向比垂直方向的斷裂伸長率低，但仍達(dá)到17.71%±0.06%，表明具有良好的柔韌性，這將有利于保護(hù)和支持沿纖維取向的神經(jīng)重排與再生。非取向纖維膜與取向纖維膜相比，其強力介于垂直與平行方向之間。如直接用取向膜包纏形成移植物的鞘難以滿足力學(xué)要求時，可以通過噴覆非取向纖維膜以提高強力。

2.3.2縫合強力

為了測試該移植物的臨床應(yīng)用，測試了縫合強力，如圖8、表2所示，盡管卷繞了3層平行纖維膜，然而其縫合強力僅為（0.45±0.09） N/針，這將難以滿足縫合要求。為提高縫合強力，在卷繞層表面噴覆了一層無規(guī)纖維（纖維層的厚度為32 μm），無序排列纖維層的強力為（0.22±0.01） N/針。盡管這兩層之和似乎仍不能滿足縫合要求，然而有趣的是，通過兩層的相互作用，其縫合強力達(dá)到1.18±0.40 N/針，將滿足神經(jīng)移植的縫合手術(shù)要求（手術(shù)縫合要求超過1.0 N/針）。

2.4體內(nèi)移植觀察

對大鼠左后腳進(jìn)行外力和熱刺激，發(fā)現(xiàn)大鼠左腿運動明顯，具有明顯的感知。免疫組織化學(xué)分析，在近、遠(yuǎn)端橫向切片均發(fā)現(xiàn)有再生神經(jīng)纖維（紅色）和雪旺細(xì)胞（綠色）長入（圖9），表明再生神經(jīng)和細(xì)胞能夠長入卷繞形成的纖維膜空隙，通過縱向切片發(fā)現(xiàn)有沿著纖維取向的再生神經(jīng)，并穿過10 mm間隙，這表明納米纖維確有引導(dǎo)神經(jīng)再生的可能。

3結(jié)論

在合適的靜電紡絲工藝條件下，利用高速轉(zhuǎn)輥能夠獲得理想取向的PLA納米纖維膜，力學(xué)性能測試發(fā)現(xiàn)該膜在平行纖維方向具有良好的柔韌性。通過兩次卷繞和一次靜電紡絲噴覆后形成的含有納米纖維束的“芯鞘”式神經(jīng)移植物，具有滿足臨床手術(shù)的縫合強力，移植后發(fā)現(xiàn)在受損神經(jīng)近、遠(yuǎn)端均有再生神經(jīng)和血旺細(xì)胞長入，再生的神經(jīng)能夠穿過受損間距，與纖維取向一致，表明該移植物構(gòu)建和體內(nèi)移植神經(jīng)修復(fù)的可行性。下一步將研究多通道納米纖維束，形成更大的神經(jīng)再生空隙，負(fù)載神經(jīng)因子，選用其它具有良好生物相容性和降解性的高聚物，以期利用該技術(shù)開發(fā)出具有類似自體神經(jīng)修復(fù)功能的人工神經(jīng)移植物。

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（責(zé)任編輯：張會?。?/p>