馬鈴薯懸浮細(xì)胞對(duì)溫度脅迫的生理響應(yīng)機(jī)制

余斌 黃銳 南運(yùn)有 孔娜娜 黨仁美 拜占玲 劉娟

摘要：選擇馬鈴薯品種大西洋和甘農(nóng)薯5號(hào)的懸浮細(xì)胞為研究對(duì)象，通過分析其在5 ℃、20 ℃及40 ℃環(huán)境下的細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)量、質(zhì)膜離子滲漏率、細(xì)胞活力值、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、光合系統(tǒng)ⅡFv/Fm來闡明馬鈴薯在溫度脅迫下的生理適應(yīng)機(jī)制。結(jié)果表明，不同馬鈴薯品種對(duì)溫度脅迫的適應(yīng)性不同，環(huán)境溫度為5 ℃時(shí)馬鈴薯懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)最好。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；懸浮細(xì)胞；溫度脅迫

中圖分類號(hào)：S532 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-1463（2017）07-0015-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2017.07.006

Abstract：The suspension cell of Atlantic and Gannong 5 cultivars are selected as the research object. Through the analysis in the 5 ℃ and 20 ℃ and 40 ℃ under the environment of relative cell growth， plasma membrane ion leakage rate， cell viability， osmolyte concentration， photosystem II Fv/Fm， To elucidate the physiological adaptation mechanism of potato under temperature stress. The result showed different potato cultivars had significantly different adjustment to temperature stress. The suspension cell of potato grew best when the temperature reached 5 ℃.

Key words：Potato；Suspension cell；Temperature stress

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)受到各種不利的生物和非生物因子的影響，如高溫、低溫[1 - 2 ]、 干 旱[3 ]、高鹽[4 ]、病蟲侵害等。溫度作為一種重要的非生物因素，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響。每種植物的生長(zhǎng)發(fā)育都有特定的溫度需求。馬鈴薯是世界第四大栽培作物[5 ]，對(duì)溫度較為敏感，是一種喜冷涼怕熱的作物，其發(fā)育最適溫度是13～18 ℃。當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃左右時(shí)植株生長(zhǎng)就會(huì)受到影響，呼吸作用旺盛，光合作用降低，同時(shí)蒸騰作用加強(qiáng)；當(dāng)溫度低于-2～-1 ℃時(shí)，就會(huì)受凍，低于-4 ℃植株就會(huì)死亡。近年來世界氣候異常現(xiàn)象頻繁出現(xiàn)，極端氣候事件對(duì)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)和生態(tài)環(huán)境造成極大危害[6 ]。我國(guó)農(nóng)業(yè)設(shè)施環(huán)境簡(jiǎn)陋，控溫能力不強(qiáng)，再加上近年來國(guó)際、國(guó)內(nèi)碳排放量問題嚴(yán)重，加劇氣溫變化。溫度脅迫在今后很長(zhǎng)一個(gè)時(shí)期內(nèi)仍然會(huì)成為威脅我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)重要因素。據(jù)保守估計(jì)，我國(guó)馬鈴薯因高溫干旱及低溫霜凍災(zāi)害年損失率高達(dá)25% 以上[7 ]。因此，研究并增強(qiáng)馬鈴薯自身對(duì)溫度脅迫的抵抗能力對(duì)穩(wěn)定我國(guó)的糧食生產(chǎn)安全具有重要作用。

面對(duì)上述嚴(yán)峻的形勢(shì)，近年來在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，有關(guān)植物對(duì)逆境響應(yīng)機(jī)制的研究在生命科學(xué)領(lǐng)域的位置越來越突出[8 ]，其中溫度脅迫對(duì)作物生長(zhǎng)的研究也備受關(guān)注，而利用細(xì)胞學(xué)方法可以在不同生理?xiàng)l件和環(huán)境因素下，對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)速度、活力、功能及相互作用進(jìn)行系統(tǒng)研究，從而為溫度脅迫下植物的細(xì)胞功能調(diào)控機(jī)制、植物響應(yīng)脅迫的機(jī)理研究提供新的突破口。

馬鈴薯是怕霜凍、忌炎熱的溫度敏感型作物，研究馬鈴薯懸浮細(xì)胞在極溫逆境下的生理適應(yīng)機(jī)制，對(duì)科學(xué)地解釋馬鈴薯對(duì)極端環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制有非常重要的意義，可為生產(chǎn)實(shí)踐中降低高、低溫脅迫對(duì)馬鈴薯的傷害而提高產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大西洋（Atlantic）、甘農(nóng)薯5號(hào)2個(gè)馬鈴薯品種的脫毒試管苗。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備馬鈴薯懸浮細(xì)胞 將大西洋、甘農(nóng)薯5號(hào)2個(gè)馬鈴薯品種的脫毒試管苗葉片切口后，接在脫分化培養(yǎng)基（MS+2，4-D 2.5 mg/L+KT 0.8 mg/L+LH 0.7 g/L + 3%蔗糖，pH 5.8）上，28 d后將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)至愈傷繼代培養(yǎng)基（MS+ 2，4-D 2.0 mg/L+ NAA 1.0 mg/L +YE 200 mg/L + 天門冬素100 mg/L + 3%蔗糖，pH 5.8）培養(yǎng)，每隔21 d繼代一次，共繼代3次，培養(yǎng)在20 ℃黑暗培養(yǎng)箱中進(jìn)行。以繼代培養(yǎng)后的愈傷組織作為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的起始材料，用鑷子把愈傷組織夾碎后置于含20 mL液體培養(yǎng)基的l00 mL三角瓶?jī)?nèi)。組成液體培養(yǎng)基（MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+ CH 250 mg/L+3%蔗糖，pH 5.8）。三角瓶置于旋轉(zhuǎn)式搖床中。在120 r/min，20 ℃，黑暗下培養(yǎng)。每5 d繼代1次。

1.2.2 脅迫處理 懸浮細(xì)胞經(jīng)過35 d的繼代懸浮培養(yǎng)后，分別放置在20 ℃、5 ℃和40 ℃培養(yǎng)箱（光周期為光照16 h、暗培養(yǎng)8 h，培養(yǎng)瓶表面光強(qiáng)50 mmoL/m2·s ）中，懸浮培養(yǎng)15 d后進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)測(cè)定。

1.2.3 相對(duì)生長(zhǎng)量測(cè)定 采用稱量法。懸浮細(xì)胞經(jīng)過35 d的繼代懸浮培養(yǎng)后，接種到新培養(yǎng)基（稱重W1）上，稱重培養(yǎng)基與懸浮細(xì)胞總重（W1+2），進(jìn)行脅迫處理（方法同上）15 d后，再次稱重處理后的培養(yǎng)基與懸浮細(xì)胞的總重（W′1+2），將處理后的懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基，對(duì)處理后的培養(yǎng)基也進(jìn)行稱重（W′）。相對(duì)生長(zhǎng)量的計(jì)算公式為：（W′1+2- W′）-（W1+2 - W1）。

1.2.4 相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定 相對(duì)電導(dǎo)率反映了離子滲漏情況，應(yīng)用Rapacz [9 ]方法測(cè)定電導(dǎo)率。取處理后的懸浮細(xì)胞0.25 g，加5 mL去離子水，測(cè)定電導(dǎo)率（Ct）。為測(cè)定100%電解質(zhì)泄漏率，最后一次測(cè)定后將測(cè)試管加蓋煮沸20 min，冷卻后測(cè)定殺死樣電導(dǎo)率（Ck）。相對(duì)電導(dǎo)率（RCt）按Tsarouhas[10 ] 的公式計(jì)算：RCt =（Ct / Ck）×100。

1.2.5 細(xì)胞TTC還原能力測(cè)定 根據(jù)Ishikawa[11 ]的TTC還原法測(cè)定。取處理后的懸浮細(xì)胞0.5 g置1小瓶，加3 mL的0.08%TTC溶液（用50 mmol/L，pH 7.5的磷酸鈉緩沖液配制），加蓋置黑暗靜置24 h后，吸去TTC溶液，收集樣品，用蒸餾水清洗3次。吸去水溶液，加3 mL 95%的乙醇上蓋，置60 ℃恒溫箱10 min。冷卻后搖勻，于酶標(biāo)儀上測(cè)OD485，以處理前的樣品作為對(duì)照，以光密度值的大小表示細(xì)胞活力。

1.2.6 游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 采用酸性茚三酮法[12 ]。取處理后的懸浮細(xì)胞材料0.5 g用液氮研磨至粉末狀，加入3%磺基水楊酸研磨提取，離心（20 000 r，5 min），上清液加入冰醋酸和茚三酮試劑，沸水浴中加熱10 min。提取液中加入4 mL甲苯，混勻，靜置后取甲苯層，用紫外可見分光光度儀測(cè)定OD520。

1.2.7 光合系統(tǒng)ⅡFv/Fm的測(cè)定 將處理后的懸浮細(xì)胞置于暗處適應(yīng)15 min以上，待細(xì)胞完全暗適應(yīng)后用便攜式葉綠素?zé)晒夥治鰞xPAM2100進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度脅迫處理下馬鈴薯懸浮細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)量的變化

為測(cè)定5 ℃低溫脅迫及40 ℃高溫脅迫對(duì)馬鈴薯懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，將經(jīng)過繼代培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞，接種0.05 g進(jìn)行脅迫處理15 d后，通過稱量法測(cè)定處理后的相對(duì)生長(zhǎng)量。結(jié)果表明：5 ℃低溫環(huán)境下，2個(gè)馬鈴薯品種的懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)量顯著高于20 ℃常溫與40 ℃高溫。20 ℃常溫與40 ℃高溫環(huán)境下的馬鈴薯懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)量無顯著差異。3個(gè)溫度條件下，2個(gè)馬鈴薯品種之間懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)量無顯著差異。表明5 ℃的低溫更加適合馬鈴薯懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)（圖1）。

2.2 溫度脅迫處理對(duì)馬鈴薯質(zhì)膜離子滲漏率的影響

植物在遭受低溫或高溫脅迫時(shí)，質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)被破損，導(dǎo)致細(xì)胞原生質(zhì)內(nèi)含物外滲、離子滲漏，并引發(fā)很多生理功能喪失。通過電導(dǎo)率法來測(cè)定所得的質(zhì)膜離子滲透率已廣泛用于植物抗凍、抗熱性評(píng)價(jià)的生理指標(biāo)。如圖2所示，2個(gè)品種的馬鈴薯懸浮細(xì)胞在20 ℃及40 ℃高溫環(huán)境下的質(zhì)膜離子滲透率都高于5 ℃，且40 ℃環(huán)境下馬鈴薯懸浮細(xì)胞的質(zhì)膜離子滲漏率顯著高于5 ℃、20 ℃，說明馬鈴薯細(xì)胞膜在高溫環(huán)境下傷害較為嚴(yán)重。大西洋（Atlantic）在40 ℃和20 ℃環(huán)境下質(zhì)膜離子滲漏率均低于甘農(nóng)薯5號(hào)，說明其在高溫脅迫下具有更好的適應(yīng)性。

2.3 溫度脅迫處理對(duì)馬鈴薯懸浮細(xì)胞活力的影響

細(xì)胞活力即在細(xì)胞群體中活細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比。利用TTC還原法測(cè)定的細(xì)胞活力值，可直接表明細(xì)胞活力。如圖3所示，5 ℃下2個(gè)馬鈴薯懸浮細(xì)胞活力值均為最高；其次為20 ℃；在40 ℃高溫下2個(gè)馬鈴薯懸浮細(xì)胞活力值均處于較低水平，由此可見，在5 ℃低溫環(huán)境下馬鈴薯懸浮細(xì)胞活力最強(qiáng)，在40 ℃高溫時(shí)細(xì)胞膜的完整性受到破壞，細(xì)胞活力受到影響。大西洋（Atlantic）在5 ℃、20 ℃和40 ℃環(huán)境下懸浮細(xì)胞活力均高于甘農(nóng)薯5號(hào)。

2.4 溫度脅迫處理下馬鈴薯懸浮細(xì)胞游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

在正常條件下，植物游離脯氨酸含量很低，但遇干旱、低溫等逆境時(shí)，游離脯氨酸便會(huì)大量積累，主要是在逆境中對(duì)植物起到保護(hù)作用，因此脯氨酸可作為植物抗逆性的一項(xiàng)生化指標(biāo)。通過檢測(cè)馬鈴薯懸浮細(xì)胞游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化發(fā)現(xiàn)（圖4），在5 ℃低溫處理下馬鈴薯懸浮細(xì)胞中的游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于20 ℃和40 ℃環(huán)境中的游離脯氨酸，40 ℃高溫處理與20 ℃的測(cè)定值基本相等。在20 ℃和40 ℃環(huán)境中，大西洋（Atlantic）和甘農(nóng)薯5號(hào)的游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著差別，在5℃環(huán)境下，大西洋（Atlantic）懸浮細(xì)胞中的游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于甘農(nóng)薯5號(hào)，說明大西洋（Atlantic）較甘農(nóng)薯5號(hào)在5 ℃環(huán)境下具有更強(qiáng)的低溫保護(hù)性。

2.5 溫度脅迫處理下馬鈴薯懸浮細(xì)胞光合系統(tǒng)ⅡFv/Fm值的變化

原初光能轉(zhuǎn)化率效（Fv/Fm）反映了光合系統(tǒng)Ⅱ的光能轉(zhuǎn)化效率，所以光合系統(tǒng)ⅡFv/Fm值的變化可用來表示細(xì)胞在逆境脅迫下的適應(yīng)機(jī)制。從圖5可以看出，大西洋（Atlantic）和甘農(nóng)薯5號(hào)在5℃低溫處理下的光合效能較20 ℃增高，但變化不顯著，而40℃高溫脅迫下光合效能顯著下降。說明低溫對(duì)光合系統(tǒng)Ⅱ影響較低，細(xì)胞能維持穩(wěn)定的光合效率，對(duì)低溫有較強(qiáng)的適應(yīng)性；而高溫脅迫破壞了光合系統(tǒng)Ⅱ，阻礙了光能轉(zhuǎn)化的進(jìn)行。在不同溫度下大西洋（Atlantic）較甘農(nóng)薯5號(hào)光合效率均高，說明大西洋（Atlantic）吸收光能的能力強(qiáng)。

3 結(jié)果與討論

本研究通過對(duì)馬鈴薯普通栽培品種大西洋和甘農(nóng)薯5號(hào)的懸浮細(xì)胞在5 ℃、20 ℃及40 ℃條件下進(jìn)行處理，分析其細(xì)胞的相對(duì)生長(zhǎng)量、質(zhì)膜離子滲漏率、細(xì)胞活力值。發(fā)現(xiàn)不同馬鈴薯品種對(duì)溫度脅迫的適應(yīng)性不同，大西洋（Atlantic）懸浮細(xì)胞的相對(duì)生長(zhǎng)量、細(xì)胞活力值均高于甘農(nóng)薯5號(hào)，而質(zhì)膜離子滲透率低于甘農(nóng)薯5號(hào)。在不同溫度下，5 ℃條件下2個(gè)品種馬鈴薯的懸浮細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)量、細(xì)胞活力值均高于20 ℃及40 ℃，質(zhì)膜離子滲透率低于20 ℃及40 ℃。5 ℃條件更適合馬鈴薯懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)，40 ℃使得細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化并出現(xiàn)損傷現(xiàn)象，懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)受到影響。目前，對(duì)植物在溫度脅迫下的響應(yīng)機(jī)制的研究探討多集中在形態(tài)學(xué)、生理生化以及分子生物學(xué)等方面。自發(fā)現(xiàn)植物的解剖結(jié)構(gòu)與其耐鹽性密切相關(guān)，植物細(xì)胞具有與之相適應(yīng)的超微結(jié)構(gòu)以來，很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)細(xì)胞學(xué)研究植物抗逆方法大多以對(duì)細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的觀察為主，期間陸續(xù)出現(xiàn)不同逆境脅迫對(duì)小麥[13 ]、玉米[14 ]、大豆[15 ]、番茄[16 ]、煙 草[17 ]等多種植物葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)影響的研究，表明所有植物細(xì)胞在逆境情況下均會(huì)影響細(xì)胞的相對(duì)生長(zhǎng)量、破壞膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)致大量的原生質(zhì)內(nèi)含物和離子外滲、細(xì)胞活力值降低。

在植物細(xì)胞對(duì)溫度脅迫的生理響應(yīng)機(jī)制方面，王海燕等[18 ]發(fā)現(xiàn)低溫脅迫可使發(fā)菜懸浮細(xì)胞的光合作用受到傷害。本研究中，馬鈴薯懸浮細(xì)胞在5 ℃時(shí)光合作用比20 ℃及40 ℃條件下高，在5 ℃大細(xì)胞的適應(yīng)能力更強(qiáng)，經(jīng)過一段時(shí)間的低溫適應(yīng)，細(xì)胞能維持穩(wěn)定的光合效率。馬鈴薯品種大西洋（Atlantic）比甘農(nóng)薯5號(hào)適應(yīng)性更好。徐勝 等[19 ]發(fā)現(xiàn)，植物在高溫脅迫下，由于體內(nèi)活性氧代謝失調(diào)和自由基的積累，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)大量積累，植物的抗逆性增強(qiáng)。本研究中，在溫度脅迫時(shí)，不同品種馬鈴薯懸浮細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)都增高，大西洋（Atlantic）懸浮細(xì)胞在5 ℃時(shí)比甘農(nóng)薯5號(hào)顯著增高，馬鈴薯懸浮細(xì)胞的調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累使其細(xì)胞能夠調(diào)控自身的物質(zhì)，以避免溫度脅迫對(duì)其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和身體機(jī)能帶來嚴(yán)重的傷害。大西洋（Atlantic）懸浮細(xì)胞在5 ℃游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，其對(duì)逆境的調(diào)控能力強(qiáng)，大大降低了脅迫所引起的傷害。

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（本文責(zé)編：陳 珩）