多粘類芽孢桿菌DN—1固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

胡飛 蘇衛(wèi)華 胡本進 周子燕 徐麗娜 陳浩梁 蘇賢巖

摘要[目的]探討多粘類芽孢桿菌DN-1固體發(fā)酵條件。[方法]以活菌數(shù)和芽孢率為指標，采用單因素和多因素試驗對DN-1菌株的最適培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件進行優(yōu)化。[結(jié)果]菌株DN-1最適培養(yǎng)基配比為：15%稻殼，40%玉米粉，20%馬鈴薯，10%茶渣餅，15%水，0.1%磷酸氫二鉀和0.2%硫酸錳。最適發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間72 h，發(fā)酵溫度37 ℃，初始pH 6.5～7.0，接種量10%。優(yōu)化后菌株DN-1活菌數(shù)、芽孢率分別達26.3億/g、92%。[結(jié)論]試驗結(jié)果為DN-1菌株的進一步研究及應(yīng)用提供了參考。

關(guān)鍵詞多粘類芽孢桿菌DN-1；活菌數(shù)；芽孢率；發(fā)酵；優(yōu)化

中圖分類號S476文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）09-0151-04

Optimizing Solid Fermentation Condition for Paenibacillus polymyxa DN1

HU Fei， SU Weihua， HU Benjin* et al

（Institute of Plant Protection and Agroproducts Safety， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）

Abstract[Objective] The aim was to discuss solid fermentation condition for Paenibacillus polymyxa DN1. [Method] We optimized the best solid medium and fermentation conditions of Paenibacillus polymyxa DN1 by the single factor and muti factor experiments. [Result] The optimum medium for Paenibacillus polymyxa DN1 was 15% rice husk， 40% corn flour， 20% potato， 10% oilteacake， 15%water， 01% K2HPO4 and 0.2% MnSO4. The optimal fermentation conditions were fermentation time for 72 h， temperature at 37 ℃， pH at 6.5-7.0 and 10% inoculation quantity. The yield and ratio of spore formation were 2.63 billion spores /g and 92%， respectively. [Conclusion] The results provide reference for further study and application of Paenibacillus polymyxa DN1.

Key wordsPaenibacillus polymyxa DN1；Yield；Ratio of spore formation；Fermentation；Optimize

多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）由于其具有植物防病和植物促生作用、對人畜安全和無污染等優(yōu)點而受到重視，美國環(huán)保署（EPA）將其列為可在商業(yè)上應(yīng)用的微生物之一[1]。目前利用多粘類芽孢桿菌防治植物病害的報道較多。例如，國內(nèi)利用多粘類芽孢桿菌開發(fā)出的生物農(nóng)藥康地雷得對黃瓜枯萎病等有較好防效[2-3]；郭芳芳等[4]發(fā)現(xiàn)1株多粘類芽孢桿菌對水稻稻瘟病菌等具有顯著拮抗效果。為提高多粘類芽孢桿菌的產(chǎn)量和芽孢率，許多研究者對芽孢桿菌發(fā)酵條件進行優(yōu)化[5-10]。王哲等[11]采用單因素多濃度和響應(yīng)面試驗設(shè)計法，對菌株 KLBMP 033 液態(tài)培養(yǎng)工藝進行了優(yōu)化。周青等[12] 研究表明，經(jīng)條件優(yōu)化后培養(yǎng)的解淀粉芽孢桿菌 BS2004對番茄青枯病的防治效果達 80%。目前多粘類芽孢桿菌多采用液體深層發(fā)酵技術(shù)，再經(jīng)噴霧干燥進行生產(chǎn)，對設(shè)備要求高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，而固體發(fā)酵采用的原料一般是廉價的農(nóng)副產(chǎn)品（如稻殼、麩皮等），采用的設(shè)備也較液體發(fā)酵簡單，生產(chǎn)成本大大低于液體發(fā)酵，近年來各生產(chǎn)廠家都在積極探索芽孢桿菌的固體發(fā)酵技術(shù)。因此，研究多粘類芽孢桿菌的固態(tài)發(fā)酵條件可為開發(fā)高效、低毒生物農(nóng)藥提供有效途徑。

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所篩選的多粘類芽孢桿菌DN-1具有廣譜抗植物病原真菌作用，對離體水稻紋枯?。≧hizoctonia solani Kühn）、油茶炭疽?。–olletotrichum gloeosporioides Penz）等作用效果顯著。目前，有關(guān)多粘類芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵條件和發(fā)酵工藝的研究較少，鑒于此，該研究所進行了多粘類芽孢桿菌DN-1不同組分培養(yǎng)基固體發(fā)酵產(chǎn)菌量試驗，以期簡化生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)量和芽孢率，降低生產(chǎn)成本，為進一步應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株。

多粘類芽孢桿菌DN-1，于青島海域海泥中分離（Genebank登錄號：KM891591），由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所保存。

1.1.2培養(yǎng)基。

液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯20.0%，葡萄糖20%，氯化鈉 0.5%，磷酸氫二鉀0.1%。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮、稻殼、玉米粉、馬鈴薯、茶渣餅（油茶副產(chǎn)品）、磷酸氫二鉀、硫酸錳。

1.2方法

1.2.1多粘類芽孢桿菌DN-1產(chǎn)菌量測定。

采用混勻平皿活菌計數(shù)法，按10倍稀釋法制成不同濃度稀釋液，從各濃度稀釋液中分別吸取0.1 mL 置于無菌培養(yǎng)皿中，每個稀釋濃度做2個平皿。將事先融化并冷卻至50 ℃左右的固體培養(yǎng)基向每培養(yǎng)皿中倒入12.0 mL，搖勻，凝固后放入37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，進行菌落記數(shù)。

1.2.2多粘類芽孢桿菌DN-1芽孢率測定。

采用芽孢革蘭氏染色，顯微鏡下觀察。

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化。

1.2.3.1

碳源的篩選。分別以40%稻殼、蔗糖、木屑、麩皮和玉米粉作為碳源，40%酵母粉作為氮源。將各組分加入20%水中浸泡4 h，裝袋高壓滅菌45 min，待溫度降到40 ℃左右后接入液體種子菌液，接種量為10%，攪拌混勻，發(fā)酵培養(yǎng)。37 ℃發(fā)酵72 h后，停止發(fā)酵，期間定時取樣檢查，每處理4 次重復(fù)。

1.2.3.2

氮源的篩選。分別以 40%酵母粉、黃豆粉、豆粕、馬鈴薯、茶渣餅，40%蔗糖作為碳源。其他條件同“1.2.3.1”，每處理4次重復(fù)。

1.2.3.3

無機鹽的篩選。40%酵母粉、40%蔗糖培養(yǎng)基中分別添加 0.2%的 氯化鈉、磷酸二氫鉀、硫酸錳、氯化鋅和氯化鈣，其他條件同“1.2.3.1”，每處理4次重復(fù)。

1.2.3.4

多種培養(yǎng)基組合試驗。以單因子試驗篩選出的最佳碳源、氮源、無機鹽為基礎(chǔ)，采用多種組合（表1）進行培養(yǎng)基優(yōu)化，確定培養(yǎng)基各組分的最佳配比。

1.2.4發(fā)酵條件的優(yōu)化。

以“1.2.3”優(yōu)化后獲得的發(fā)酵培養(yǎng)基，對多粘類芽孢桿菌DN-1發(fā)酵時間、溫度、初始 pH、接種量等發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

發(fā)酵時間分別調(diào)為24、48、72、96、120 h；溫度分別調(diào)為30、32、35、37、40 ℃；初始 pH分別設(shè)為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；接種量分別設(shè)為5%、7%、10%、12%、15%；測定產(chǎn)菌量和芽孢率，每處理4 次重復(fù)。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

5種碳源對DN-1菌株菌量和芽孢率具有顯著影響（圖1），以玉米粉的菌量和芽孢率最高，分別達 15.9億/g、79%；稻殼和玉米粉的菌量、芽孢率均顯著高于其他碳源。綜合考慮生產(chǎn)成本，選擇玉米粉和稻殼作為后續(xù)發(fā)酵碳源。

5種氮源對DN-1菌株產(chǎn)菌量和芽孢率影響不同（圖2），其中酵母粉、茶渣餅、馬鈴薯顯著高于其他氮源，以茶渣餅的菌量和芽孢率最高，分別達 17.4億/g、84%；土豆的芽孢率高于酵母粉，但菌量兩者差異不顯著。為了降低生產(chǎn)成本，選擇馬鈴薯和茶渣餅作為發(fā)酵的綜合氮源。

5種無機鹽對DN-1菌株產(chǎn)菌量和芽孢率影響也不同（圖3），硫酸錳和磷酸二氫鉀的菌量、芽孢率顯著高于其他無機鹽，其中磷酸二氫鉀菌量達15.1億/g；硫酸錳芽孢率達84%。因此，選擇硫酸錳和磷酸二氫鉀作為發(fā)酵用無機鹽。

2.2多種組合培養(yǎng)基的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇稻殼、玉米粉、硫酸錳、茶渣餅、馬鈴薯、硫酸錳、磷酸二氫鉀進行多種培養(yǎng)基組合試驗，分別以菌量和芽孢率為指標，確定發(fā)酵培養(yǎng)基成分的最佳配比。由表2可知，處理1培養(yǎng)基組合為最佳水平，菌量和和芽孢率均顯著高于其他組合，分別達26.3億/g、92%。因此，確定DN-1菌株最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分為15%稻殼、40%玉米粉、20%馬鈴薯、10%茶渣餅、15%水、0.1%磷酸氫二鉀、0.2%硫酸錳。

2.3發(fā)酵條件的優(yōu)化

時間顯著影響DN-1菌株的菌量和芽孢率（圖4）。隨著發(fā)酵時間的增加，菌量和芽孢率逐漸提高，72 h時菌量達到高峰值，分別為24.9億/g、91%，后續(xù)至120 h菌量呈穩(wěn)定趨勢，芽孢率開始下降。因此，確定72 h為DN-1菌株最佳發(fā)酵時間。

溫度對DN-1菌株的菌量和芽孢率具有顯著影響（圖5）。隨著發(fā)酵溫度的上升，菌量和芽孢率逐漸提高，37 ℃時菌量達到高峰值（25.7億/g），35 ℃時芽孢率最高達89%，但與37 ℃（芽孢率90%）相比差異不顯著。因此，確定37 ℃為DN-1菌株最佳發(fā)酵溫度。

初始pH 6.0～8.0 時DN-1菌株均可大量生長，在 pH 6.5～7.0時菌量和芽孢率較高，最高值分別達26.5億/g、94%（圖6）。pH 8.0時菌量和芽孢率都開始下降，說明弱酸條件有利于菌體生長和芽孢率的提高。因此，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的初始 pH為6.5～7.0。

接種量對DN-1菌株的菌量和芽孢率也具有一定影響（圖7）。隨著接種量的增加，菌量逐漸增加，同時芽孢率也逐漸提高，當(dāng)接種量為10%時，菌量和芽孢率最高值分別達26.3億/g、92%；隨后接種量繼續(xù)增加，菌量和芽孢率略微下降。因此，確定最適接種量為10%。

3結(jié)論與討論

試驗以菌量和芽孢率為指標，對多粘類芽孢桿菌DN-1的固態(tài)發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，最終確定最適培養(yǎng)基配比為15%稻殼、40%玉米粉、20%馬鈴薯、10%茶渣餅、15%水、0.1%磷酸氫二鉀、0.2%硫酸錳，最適發(fā)酵條件為發(fā)酵時間72 h，發(fā)酵溫度37 ℃，初始pH 6.5～7.0，接種量10%。

試驗發(fā)現(xiàn)，DN-1菌株對玉米粉和稻殼利用顯著高于其他碳源，稻殼的空隙可能為菌體發(fā)酵提供必要的通氣量，馬鈴薯和茶渣餅的組合氮源、錳離子更有利于提高菌量和芽孢率，目前多粘類芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入錳離子的報道較少。DN-1菌株在72 h時菌量和芽孢率達到高峰，而后續(xù)芽孢率開始下降，說明芽孢隨著發(fā)酵時間的延長開始逐步轉(zhuǎn)化為菌體。溫度在 37 ℃以上時菌量和芽孢率開始下降，說明該菌株發(fā)酵溫度不應(yīng)高于40 ℃。最適初始pH為6.5～

7.0，可能弱酸條件有利于菌體生長和芽孢率的提高。多粘

類芽孢桿菌DN-1其他同類菌株發(fā)酵條件不同，它們之間

的差距可能由菌株本身的特性決定的，所以針對不同的菌株

應(yīng)選擇最適的培養(yǎng)條件。

研究多粘類芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵工藝等具有十分重要的意義，可為與井岡霉素A復(fù)配加工成可濕性粉劑提供技術(shù)支持。發(fā)酵過程是一個動態(tài)變化的過程，該研究對發(fā)酵條件的篩選只涉及室內(nèi)中試條件，所得數(shù)據(jù)只能作為實際生產(chǎn)參考，規(guī)?；a(chǎn)還必須進行工業(yè)化生產(chǎn)工藝的研究。

參考文獻

[1] WANG Z W，LIU X L.Medium optimization for antifungal active substances production from a newly isolated Paenibacillus sp.using response surface methodology[J].Bioresource technology，2008，99（17）：8245-8251.

[2] 趙新海，鐘麗娟，徐沖，等.康地蕾得對黃瓜枯萎病的室內(nèi)毒力測定及田間防效試驗[J].農(nóng)藥，2008，47（9）：696-698.

[3] 魏鴻剛，李淑蘭.防治作物青枯病和枯萎病的微生物農(nóng)藥——0.1億cfu/g多粘類芽孢桿菌細粒劑[J].世界農(nóng)藥，2008，30（1）：52-53.

[4] 郭芳芳，謝鎮(zhèn)，盧鵬，等.一株多粘類芽孢桿菌的鑒定及其生防促生效果初步測定[J].中國生物防治學(xué)報，2014，30（4）：489-496.

[5] 章四平，劉圣明，王建新，等.枯草芽孢桿菌生防菌株 NJ-18 的發(fā)酵條件優(yōu)化[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，33（2）：58-62.

[6] 方傳記，陸兆新，孫力軍，等.淀粉液化芽孢桿菌抗菌脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（2）：533-539.

[7] 李文鵬，蔡磊，畢廷菊，等.胨凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）的分離、篩選及其發(fā)酵培養(yǎng)基研究[J].土壤通報，2001，32（2）：70-72.

[8] 紀明山，王毅婧.地衣芽孢桿菌生防菌株 SDYT-79 發(fā)酵條件優(yōu)化[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，42（2）：164-169.

[9] 張文芝，王云鵬，劉紅霞，等.蠟質(zhì)芽孢桿菌 AR156 發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].微生物學(xué)通報，2010，37（6）：803-810.

[10] 宮宇飛，喬紅萍，魏國榮，等.內(nèi)生枯草芽孢桿菌 E1R-J 發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，17（1）：61-64.

[11] 王哲，曹成亮，左飛，等.楊樹變色真菌生防細菌 KLBMP 033發(fā)酵條件優(yōu)化[J].林業(yè)實用技術(shù)，2011（11）：3-7.

[12] 周青，王笑，蘇婷，等.青枯病和根腫病生防細菌 BS2004的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].中國生物防治學(xué)報，2012，28（4）：537-544.