東方百合脫毒技術(shù)規(guī)程

邵小斌 孫明偉 趙統(tǒng)利 朱朋波 湯雪燕 王江英

摘要介紹了通過鱗片誘導(dǎo)胚性愈傷并培養(yǎng)成組培球，剝?nèi)“俸辖M培球莖尖并誘導(dǎo)胚性愈傷及培養(yǎng)成球等方式的培養(yǎng)，最終脫除百合主要病毒，以獲取百合無毒種源的過程，為生產(chǎn)無病毒的百合商業(yè)種球提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞百合；脫毒；技術(shù)規(guī)程

中圖分類號(hào)S682.2+65文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）09-0132-02

Technique Criterion for Virus Elimination of Oriental Lily

SHAO Xiaobin，SUN Mingwei，ZHAO Tongli et al

（Lianyungang City Academy of Agricultural Sciences，Lianyungang，Jiangsu 222006）

AbstractThis article introduced the process of embryonic callus induction， training into tissue culture bulbs， stripping lily corm，culturing into tissue culture bulbs and so on， to remove lily main virus and get the lily nontoxic provenance. This study provides a basis for producing the commercial lily bulbs.

Key wordsLily；Virus elimination；Technique criterion

東方百合是利用天香百合（Lilium auratum）的花型和藥百合（L.speciosum）的深紅、深粉、粉色等艷麗的花色及其芳香宜人的遺傳特性，培育出的東方百合雜種（L.tenuifolium oriental hybrid）群[1]。東方百合顏色豐富，花型大，深受人們喜愛，主要通過鱗片扦插等無性繁殖，但長期的無性繁殖過程中體內(nèi)逐漸積累大量病毒，致使植株發(fā)生病毒病[2]。病毒病是影響百合切花和種球產(chǎn)量與質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一[3]，黃瓜花葉病毒（CMV）、百合無癥病毒（LSV）、百合斑駁病毒（LMoV）等是感染東方百合主要病毒[4-5]，通常會(huì)導(dǎo)致花卉品種退化，品質(zhì)趨差，經(jīng)濟(jì)價(jià)值降低[6]。針對(duì)目前生產(chǎn)現(xiàn)狀，為了促進(jìn)東方百合種球國產(chǎn)化，在大量試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，建立了東方百合脫毒技術(shù)規(guī)程。

1范圍

該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了東方百合脫毒技術(shù)。

該標(biāo)準(zhǔn)適用于江蘇省地區(qū)具備生物技術(shù)條件下的東方百合脫毒技術(shù)。

2規(guī)范性引用文件

下列文中的條款通過該標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的版本適用于該文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于該標(biāo)準(zhǔn)。

NY/T 402 化學(xué)試劑 脫毒甘薯種薯（苗）病毒檢測技術(shù)規(guī)程；

NY/T 1491 花卉植物病毒檢測規(guī)程；

NY/T 1840 植物病毒免疫電鏡檢測方法 ；

NY/T 2306—2013 花卉種苗組培快繁技術(shù)規(guī)程。

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于該標(biāo)準(zhǔn)。

3.1東方百合

由天香百合、鹿子百合、日本百合、紅花百合等種與湖北百合的雜種中選育出來的栽培雜種系。

3.2外植體

從活植物體上切取下來以進(jìn)行培養(yǎng)的器官、組織或細(xì)胞、原生質(zhì)體。

3.3胚性愈傷

具有產(chǎn)生胚狀體能力的愈傷。

3.4莖尖

莖的頂端分生組織及其周緣部分。

3.5脫毒

利用剝莖尖、胚性愈傷等脫毒技術(shù)，脫去主要危害百合的病毒病及類病毒病。

3.6病毒病

由病毒侵入百合植株引起的，呈現(xiàn)葉脈退綠、花葉、黃斑、葉或花畸形等癥狀，造成植株生活力減弱、長勢低下等現(xiàn)象的病害。

3.7培養(yǎng)基

供植物外植體存活和生長所必需的介質(zhì)，通常由水、無機(jī)鹽、有機(jī)物質(zhì)、凝固劑、糖以及植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等組成。

3.8生根培養(yǎng)

把無根的幼苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)成生根苗的過程。

4生產(chǎn)設(shè)備（施）及化學(xué)試劑

4.1組培場地建設(shè)

組培實(shí)驗(yàn)室須選擇安靜、清潔、無污染的地方。

4.2洗滌設(shè)備

工廠化生產(chǎn)可選用自動(dòng)洗瓶機(jī)，另外配置干燥箱、晾瓶架等。

4.3百合脫除病毒設(shè)備

超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、解剖刀、鑷子、解剖針、解剖鏡等。

4.4滅菌設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋、器械消毒器、紫外燈、烘干箱、微濾孔器等。

4.5滅菌劑

選用乙醇、氯化汞、次氯酸鈉、高錳酸鉀、甲醛、84消毒液等。

4.6培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑

MS培養(yǎng)基、6-BA、IBA、NAA、Picloram、蔗糖、瓊脂等。

4.7病毒檢測設(shè)備

PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、低溫高速離心機(jī)、冰箱、制冰機(jī)等。

4.8培養(yǎng)基配制

按NY/T 2306—2013花卉種苗組培快繁技術(shù)規(guī)程要求，進(jìn)行培養(yǎng)基配制。

5組培室消毒滅菌

每天用84消毒液稀釋至1 000倍或75%乙醇噴灑洗滌組培室地面，保持室內(nèi)清潔。接種室接種前用紫外燈照射20～30 min，并每30 d用高錳酸鉀及甲醛混合熏蒸。培養(yǎng)室每60 d用高錳酸鉀及甲醛混合熏蒸滅菌，工作期間用75%乙醇每3 d噴霧消毒。超凈工作臺(tái)接種前用紫外燈照射20～30 min，并用75%乙醇擦拭臺(tái)面及內(nèi)壁，并定期清洗超凈工作臺(tái)過濾膜以保證清潔。培養(yǎng)基用高溫高壓蒸汽滅菌，通常在壓力102 kPa、溫度121 ℃條件下保持，污染的瓶苗用消毒鍋高溫高壓滅菌，然后再清洗培養(yǎng)容器。

6脫毒技術(shù)

6.1鱗片誘導(dǎo)成球

6.1.1鱗片選取。

選取完整無病蟲害且周徑≥14 cm的百合鱗莖，去除外層帶病斑的鱗片，由外向內(nèi)完整地剝?nèi)≈袑喻[片，流水沖洗凈表面泥垢后，用0.2%～0.5%的洗衣粉水沖洗10 min，在流水條件下沖洗30 min。

6.1.2

鱗片消毒。

用75%乙醇滅菌30 s，再用0.1%的升汞溶液浸泡8～10 min，期間不斷進(jìn)行搖動(dòng)，使鱗片充分與溶液混合，最后用無菌水沖洗5～6次。沿鱗片切除周圍1 mm的外圍部分，然后選取外層下部與鱗莖盤相連的部分為最佳外植體，橫切約為0.5 cm厚的小塊。

6.1.3愈傷誘導(dǎo)。

6.1.3.1愈傷培養(yǎng)基配方。

MS+6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L+蔗糖30.0 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH 5.8～6.0。

6.1.3.2鱗片接種。

將準(zhǔn)備好的百合鱗片，底部帶傷口面平放于誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上。

6.1.3.3培養(yǎng)條件。

將接種好的組培瓶放置于培養(yǎng)室中，置于23～27 ℃，暗培養(yǎng)45 d，鱗片頂部傷口處即形成淡黃色的愈傷。在培養(yǎng)期間，每隔20 d更換1次培養(yǎng)基。

6.1.4愈傷誘導(dǎo)成球。

6.1.4.1成球培養(yǎng)基配方。

MS+6-BA 0.5 mg/L+蔗糖150 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH 5.8～6.0。

6.1.4.2小鱗莖長成。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到成球培養(yǎng)基上，25～35 d后，分化出許多大小不等的鱗莖，將分化的小鱗莖接種到MS+IBA 1.0 mg/L+蔗糖60.0 g/L+瓊脂6.5 g/L培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)45 d，待鱗莖直徑長到大于0.5 cm，取出備用。

6.2低溫處理打破休眠

將長成的組培鱗莖，整瓶轉(zhuǎn)至4 ℃暗培養(yǎng)的冷藏室內(nèi)，暗培養(yǎng)60～80 d解除休眠。

6.3熱處理

將解除休眠的百合鱗莖，整瓶置于人工氣候箱中，每天升高1 ℃，至變溫光暗培養(yǎng)（白天 38 ℃、10 h，夜間 30 ℃、14 h）持續(xù)15～25 d。

6.4剝?nèi)∏o尖

把熱處理過的百合組培鱗莖，在超凈工作臺(tái)內(nèi)取出無菌的組培鱗莖，在10～80倍的解剖鏡下，用解剖刀剝除外部鱗片，露出生長點(diǎn)，用解剖針挑取0.5～0.8 mm大小的莖尖生長點(diǎn)接種到誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基（MS+Picloram 25 mg/L+蔗糖30.0 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH 5.8～6.0）上，在25 ℃條件下，暗培養(yǎng)60～80 d，每20 d更換1次培養(yǎng)基。

6.5愈傷誘導(dǎo)成球

再次將莖尖誘導(dǎo)的胚性愈傷，放置于成球培養(yǎng)基上培養(yǎng)。25～35 d后，分化出許多大小不等的鱗莖，將分化的小鱗莖接種到MS+IBA 1.0 mg/L+蔗糖60.0 g/L+瓊脂6.5 g/L培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)45 d，待鱗莖直徑長到大于0.5 cm，取出備用。

7病毒檢測

將通過莖尖最終誘導(dǎo)成球的百合組培鱗莖，采用多重RT-PCR法進(jìn)行百合主要病毒，如黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、百合無癥病毒（Lily symptomless virus，LSV）和百合斑駁病毒（Lily mosettle virus，LMoV）的檢測，檢測結(jié)果為陰性，說明組培鱗莖不帶病毒可作為百合無病毒種源繼續(xù)擴(kuò)繁，如果為陽性，說明脫毒不夠徹底，不能作為百合無病毒種源。

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