紫外分光光度法測定甘草渣中總黃酮含量

張臘臘 胡浩斌 王宗博 武蕓

摘要

[目的]建立甘草渣中總黃酮含量的測定方法。[方法]以蘆丁作為對照品，10% KOH為顯色劑，采用紫外分光光度法，在409 nm波長處對樣品中的總黃酮含量進行測定。[結果]總黃酮在一定范圍內呈良好的線性關系，R2為0.994 5；平均加樣回收率為88%，RSD為13%，甘草渣中總黃酮的含量為2.24%。[結論]該方法穩(wěn)定、簡便，適用于甘草渣中總黃酮含量的測定。

關鍵詞紫外分光光度法；甘草渣；總黃酮含量

中圖分類號S567.23+9文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）09-0123-02

Determination of Total Flavonoids in Licorice Residue by UV Spectrophotometry

ZHANG Lala1， HU Haobin1，WANG Zongbo2 et al

（1.College of Chemistry and Chemical Engineering， Longdong Univercity，Qingyang，Gansu 745000；2.Qingyang Zhongkai Agricultural Products Co.， Ltd.，Qingyang，Gansu 745000）

Abstract[Objective] The research aimed to establish the determination method of total flavonoids content in licorice residue. [Method]Using rutin as the reference substance and 10% KOH as the color reagent，the content of total flavonoids in the samples was measured at 409 nm by UV spectrophotometry.[Result]The total flavonoids showed a good linearity in a certain range， R2 was 0.994 5.The average recoveries were 88%， RSD was 1.3%， and the content of total flavonoids in licorice residue was 2.24%.[Conclusion] The method is stable and simple， and is suitable for the determination of total flavonoids in licorice residue.

Key wordsUV spectrophotometry；Licorice residue；Total flavonoids content

甘草是豆科蝶形花亞科甘草屬多年生草本植物[1]，具有補脾益氣、清熱解毒等功效[2]。甘草黃酮類化合物主要存在于甘草的根、葉及其生產(chǎn)甘草酸的廢棄物甘草渣中[3]。工業(yè)化生產(chǎn)中僅對甘草中的甘草甜素作為主要有效成分進行提取[4-6]，提取后所剩余的甘草渣作為工業(yè)廢料棄去，這造成了很大的浪費。出于對資源的有效利用，筆者采用紫外分光光度法測定生產(chǎn)甘草酸的廢棄物甘草渣中總黃酮含量，并考察了顯色劑用量、顯色時間對測定甘草渣中總黃酮含量的影響，旨在建立一種快速、簡便的甘草渣中總黃酮含量的測定方法。

1材料與方法

1.1儀器

SPECORD-50型紫外分光光度儀（德國耶拿公司）；FZ102型微型植物試樣粉粹機（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；RE-5203型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；BS110S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；SHZ-D型循環(huán)水式真空泵（河南省鞏義市英峪儀器廠）；DZF-6020型真空干燥箱（上海一恒科科技有限公司）。

1.2試材

甘草渣，慶陽市中凱農(nóng)產(chǎn)品有限責任公司提供；蘆丁標準品，購自中國藥品生物制品研究所；氫氧化鉀，分析純，購自西安化學試劑廠；乙醇，分析純，購自西安化學試劑廠；無水乙醇，分析純，購自西安化學試劑廠；去離子水。

1.3方法

1.3.1

對照品溶液的配制。精密稱取105 ℃干燥恒重的蘆丁對照品0.01 g，加80%乙醇溶液定容至100 mL，作為濃度為0.1 mg/mL的標準溶液。

1.3.2

樣品溶液的配制。稱取粉碎后過篩（60目）的甘草渣5.0 g，置250 mL容量瓶中，加80%乙醇150 mL，超聲提取（功率200 W，頻率40 kHz）30 min，過濾，濾渣再加入80%乙醇100 mL，超聲處理20 min，過濾，合并2次濾液，冷卻至室溫后用80%乙醇稀釋至一定量，搖勻過濾，棄去初濾液，續(xù)濾液即為樣品溶液。

1.3.3

顯色溶液的配制。準確吸收蘆丁對照品溶液和樣品溶液各1.0 mL，置于10 mL的容量瓶，分別加入0.5 mL 10% KOH溶液作為顯色劑，室溫放置5 min，用80%乙醇稀釋至一定量，搖勻，即得對照品或樣品的顯色溶液。

1.3.4

最大吸收波長的選擇。準確吸收蘆丁對照品溶液和樣品溶液1.0 mL，置于10 mL容量瓶，分別加入0.5 mL 10% KOH溶液作為顯色劑，室溫放置5 min，用80%乙醇稀釋至一定量，搖勻，于300～600 nm波長處掃描，確定最大吸收波長。

1.3.5方法學考察。

1.3.5.1

線性關系考察。精確吸取0.1 mg/mL的蘆丁對照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于10 mL的試管中，分別加入80%乙醇5.0 mL，再加0.5 mL 10% KOH 溶液，充分搖勻顯色5 min后，用80%乙醇定容至10 mL，搖勻，以不加樣品的溶液為參比液，在最大吸收峰處測定其吸光度值。以吸光度（A）為縱坐標、蘆丁對照品溶液的質量濃度（mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.5.2精密度試驗。取同一對照品溶液1.0 mL，按照“1.3.3”方法顯色穩(wěn)定5 min后連續(xù)測定吸光度5次，計算RSD。

1.3.5.3

穩(wěn)定性試驗。精密量取樣品溶液1.0 mL，置10 mL容量瓶中，按“1.3.3”方法顯色后，分別在80 min內每10 min在最大波長處測定吸光度。

1.3.5.4

重復性試驗。取同一批甘草渣粉末6份，精密稱定，按“1.3.2”方法制備樣品溶液，按照“1.3.5.1”方法測定吸光度。

1.3.5.5

加樣回收試驗。分別準確量取已知總黃酮含量為0.023 mg/mL的1 mL提取液6份，分別加入一定量的蘆丁標準品，按“1.3.5.1”方法測定吸光度，計算加樣回收率。

1.3.6

樣品總黃酮含量的測定。精密吸取樣品溶液3份，每份均為0.5 mL，按“1.3.4”方法于最大波長處測定吸光度，將試樣的吸光度平均值帶入標準曲線方程，計算樣品中總黃酮含量。

2結果與分析

2.1顯色劑用量的確定

準確移取1.0 mL樣液于10 mL容量瓶，分別加不同用量（0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL）的顯色劑（10% KOH溶液），室溫放置5 min，用80%乙醇定容，搖勻；用加樣品不加顯色液的溶液作空白對照，在最大波長處測定其吸光度（3個平行）。以吸光度（A）為縱坐標、KOH用量（mg/mL）為橫坐標繪制曲線（圖1）。

圖1顯色劑用量與吸光度的關系

Fig.1The relationship between the dosages of chromogenic agent and absorbance

由圖1可知，隨著顯色劑用量的增加，吸光度逐漸增大，這是因為顯色劑與樣品溶液發(fā)生反應所致；當顯色劑用量>0.5 mL后，吸光度又開始減小，而后，隨著顯色劑用量的增

加，樣品溶液所需的顯色劑量達到飽和，吸光度變化幅度不

太明顯，再隨著顯色劑量的增加，吸光度發(fā)生突躍。由于顯色劑的用量是在最大波長處測量，且鑒于方便和節(jié)約時間考慮，故選擇0.5 mL為最佳顯色劑用量。

2.2顯色時間的確定

準確移取1.0 mL樣液于10 mL容量瓶，精密加入0.5 mL的顯色劑（10%氫氧化鉀溶液），室溫放置不同時間（0、2、5、10、20、30、60 min ）后，用80%乙醇定容，搖勻；用80%乙醇作空白對照，在最大波長處測定其吸光度（3個平行）。以吸光度（A）為縱坐標、時間（min）為橫坐標繪制曲線（圖2）。

由圖2可知，隨著顯色時間的增加，吸光度逐漸增大，這是因為隨著時間的增加，樣品溶液與顯色劑間的反應進行的比較充分；當顯色時間>5 min后，樣品溶液與顯色劑間的反應進行完全，吸光度基本沒有變化，再隨著顯色時間的增加，吸光度增加，而后隨著顯色時間的增加，吸光度變化不太明顯。由于顯色時間是在最大波長處測量，且鑒于方便和節(jié)約時間考慮，故選擇5 min為最佳顯色時間。

2.3最大吸收波長的選擇

由圖3可知，對照品顯色溶液與樣品顯色溶液最大吸收波長很接近，故選擇409 nm為試驗的測定波長。

2.4方法學考察

2.4.1

標準曲線的繪制。按照“1.3.5.1”方法操作，以吸光度（A）為縱坐標、蘆丁對照品溶液的質量濃度（mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線（圖4），得線性回歸方程：y=32.336x-0.012 9（R2=0.994 5），表明該試驗方法相對來說比較合理，所得曲線較為理想。

2.4.2

精密度試驗。同一份樣品連續(xù)5次進樣，吸光度的RSD為1.7%，表明儀器精密度良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗。按照“1.3.5.3”操作，結果發(fā)現(xiàn)吸光度隨時間的變化而變化，到一定時間后趨于穩(wěn)定。計算RSD為1.3%，表明供試品溶液在80 min內穩(wěn)定性良好。

2.4.4重復性試驗。按照“1.3.5.4”操作，計算得出6份樣品總黃酮含量的RSD為1.6%，表明該方法重復性良好。

2.4.5

加樣回收率試驗。由表1可知，甘草渣中總黃酮的平均加樣回收率為88%，RSD為1.3%，說明該方法的加樣回收率較高。

2.5樣品含量測定按“1.3.6”的方法，計算樣品中總黃酮的含量為2.24%。

3小結

以80%乙醇為提取溶劑，10%KOH為顯色劑，采用紫外分光光度法測定甘草渣中總黃酮含量；并且考察了顯色時間

和顯色劑用量。結果表明，總黃酮含量最高時的最佳顯色時

間為5 min，顯色劑用量為0.5 mL，試劑乙醇濃度為80%，最大吸收峰在409 nm波長處；此時甘草渣中總黃酮的含量為224%。

參考文獻

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[2] 鄭虎占，董澤宏，佘靖.中藥現(xiàn)代研究與應用[M].北京：學苑出版社，1997： 1256-1279.

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