山綠茶中9種化學(xué)成分的分離與表征

馬劍霜 湛志華 薛茗月 陳全斌

【摘 要】利用硅膠柱層析和TLC方法，對山綠茶的石油醚和乙酸乙酯提取物進行分離，并利用重結(jié)晶進行了進一步的純化，然后通過熔點測定、核磁測定等方法對分離出的9個化合物進行了鑒定。9個化合物分別是山奈酚、β-香樹脂酮、2-咖啡酰氧甲基-1-丁烯-3.4-二醇、（+）-環(huán)合橄欖樹脂素、蘆丁、熊果酸、槲皮素、大豆苷元、β-乳香酸。

【關(guān)鍵詞】山綠茶；提取；結(jié)構(gòu)

【中圖分類號】R284.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1674-0688（2017）08-0065-04

山綠茶是海南冬青（Ilex Hainanensis Merr）葉的炮制品，海南冬青屬于冬青屬植物，主要分布在我國的華東和西南地區(qū)，是一種分布廣泛的常青植物。山綠茶具有降血壓、降血糖、降血脂等療效，作為一種降血壓的中藥，在廣西部分地區(qū)得到廣泛的使用，其相關(guān)制劑是廣西一些制藥廠的龍頭產(chǎn)品，有良好的經(jīng)濟效益和發(fā)展前景。國內(nèi)外已有不少研究人員對山綠茶的化學(xué)成分和醇提物的動物實驗、臨床實驗進行了研究，結(jié)果表明，山綠茶中含有多種活性成分和具有降壓的效果。為了全面地了解山綠茶，本文對山綠茶的化學(xué)成分進行化學(xué)成分的分離、理化性質(zhì)檢測和結(jié)構(gòu)鑒定。

1 原材料、試劑及儀器

1.1 原材料、試劑

山綠茶（桂林中族中藥股份有限公司）；石油醚（AR，60～90 ℃）；二氯甲烷（AR）；氯仿（AR）；丙酮（AR）；乙酸乙酯（AR）；乙醇（AR）；甲醇（AR）；柱層析硅膠（100～200目，300～400目，青島海洋化工有限公司）；薄層色譜硅膠（GF254，青島海洋化工有限公司）；CM纖維素鈉鹽800～1200目（CP，國藥集團化藥試劑有限公司）。

1.2 儀器

上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)的RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)的WS210S型電子天平；鄭州長城科工貿(mào)有限公司生產(chǎn)的SHB-IIIS循環(huán)水式真空泵和DLSB-5/20低溫冷卻循環(huán)泵；鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司生產(chǎn)的SKSY-4電子恒溫水浴鍋；山海市實驗儀器總廠生產(chǎn)的ZK-82BB型電熱真空干燥箱；上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司生產(chǎn)的K8200LH超聲波清洗儀；瑞士Bruker公司生產(chǎn)的BrukerAV500MHz/DRX500超導(dǎo)核磁共振儀；大連依利特分析儀器有限公司生產(chǎn)的UV200Ⅱ紫外可變波長檢測器；上海精密科學(xué)儀器有限公司賽多利斯生產(chǎn)的WRS-1B數(shù)字熔點儀。

2 提取及分離

2.1 山綠茶不同溶劑提取分離

將7.5 kg的山綠茶風(fēng)干粉碎，用75%的乙醇熱回流提取3次，過濾并回收溶劑，得到525 g的褐色浸膏。將浸膏中加入適量的蒸餾水，充分攪拌后得到提取物的懸浮液，將其加入分液漏斗中，然后用石油醚（3×2 000 mL）、氯仿（3×2 000 mL）、乙酸乙酯（3×2 000 mL）依次萃取并回收溶劑，得到石油醚部分（47.2 g）、氯仿部分（101.8 g）、乙酸乙酯部分（268.6 g）、水部分（102.5 g）。

針對石油醚部分和乙酸乙酯部分，采用硅膠柱層析分離結(jié)合TLC方法，利用石油醚-乙酸乙酯、石油醚-氯仿、乙酸乙酯-甲醇等溶劑體系進行梯度洗脫，石油醚、丙酮、甲醇等溶劑反復(fù)重結(jié)晶后，成功分離純化得到9個單體化合物。

3 化合物的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)鑒定

（1）化合物1。淡黃色粉末，mp：279.5～281.2 ℃，易溶于丙酮。TLC檢測：氯仿∶甲醇=9∶1展開，Rf=0.39，紫外燈下和碘缸中均顯色，鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽性，噴1% AlCl3-EtOH溶液并加熱后顯黃色。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：6.25（1H，d，J=1.9），6.50（1H，d，J=1.9），8.11（2H，d，J=8.3），6.99（2H，d，J=8.3），6.99（2H，d，J=8.3），8.11（2H，d，J=8.3）。13C-NMR（100 MHz，DMSO）δ：147.7（C-2），136.6（C-3），176.8（C-4），161.6（C-5），99.2（C-6），164.9（C-7），94.4（C-8），157.1（C-9），103.9（C-10），122.6（C-1'），130.4（C-2'），116.4（C-3'），160.1（C-4），116.4（C-5'），130.4（C-6'）。1H-NMR（400 MHz，DMSO）譜圖中δH（ppm）：6.25（1H，d，J=1.9 Hz）和6.50（1H，d，J=1.9 Hz）為A環(huán)上H-6和H-8的化學(xué)位移，由此可得A環(huán)為5、7-二取代。8.11（2H，d，J=8.3 Hz）為B環(huán)上H-2'和H-6'的化學(xué)位移，6.99（2H，d，J=8.3 Hz）為B環(huán)上H-3'和H-5'的化學(xué)位移，由此可得B環(huán)為4'取代。13C-NMR（100 MHz，DMSO）譜圖中δC（ppm）：176.34為羰基碳的化學(xué)位移，98.69和93.86分別為C-6和C-8的化學(xué)位移，130.43的重疊峰為C-2'和C-6'的化學(xué)位移，116.37的重疊峰為C-3'和C-5'的化學(xué)位移。與文獻[1]中的1H-NMR和13C-NMR對比，最終確定該化合物為山奈酚。

（2）化合物2。白色針狀晶體，mp：159.4～160.7 ℃，易溶于氯仿和甲醇。紫外燈下不顯色，碘缸中顯色，噴10% H2SO4-EtOH溶液并加熱后顯紅色。13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：40.1（C-1），32.4（C-2），215.3（C-3），50.6（C-4），51.7（C-5），19.4（C-6），32.1（C-7），40.0（C-8），47.0（C-9），37.7（C-10），21.6（C-11），122.2（C-12），141.2（C-13），14（C-14），29.4（C-15），25.9（C-16），32.3（C-17），37.7（C-18），46.3（C-19），32.1（C-20），33.6（C-21），36.9（C-22），25.9（C-23），19.9（C-24），12.5（C-25），12.7（C-26），23.5（C-27），26.5（C-28），32.3（C-29），22.5（C-30）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）譜圖中0.69～1.25共有24個H，為7個-CH3的化學(xué)位移。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）譜圖中顯示出30個C的化學(xué)位移。與文獻[2-3]中的13C-NMR對比，最終確定該化合物為β-香樹脂酮。

（3）化合物3。淡黃色膠狀，易溶于甲醇。紫外燈下和碘缸中均顯色，F(xiàn)eCl3反應(yīng)呈陽性。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：5.29（2H，d，J=20.2），4.26（1H，dd，J=4.1，8.1），3.65（2H，dd，J=7.9，4.0），4.74（2H，d，J=16.0），7.06（1H，d，J=2.0），6.79（1H，d，J=8.1），6.96（1H，dd，J=8.1，2.0），7.58（1H，d，J=16.0），6.30（1H，d，J=16.0）。13C-NMR（MeOD，100 MHz）δ：114.6（C-1），145.9（C-2），74.6（C-3），66.5（C-4），65.3（C-5），127.7（C-1'），114.9（C-2'），146.8（C-3'），149.7（C-4'），116.5（C-5'），123.0（C-6'），147.2（C-7'），115.2（C-8'），168.8（C-9'）。1H-NMR（400 MHz，MeOD）譜圖中δH（ppm）：7.06（1H，d，J=1.3 Hz）、6.79（1H，d，J=8.2 Hz）和6.96（1H，dd，J=8.1，2.0 Hz）為苯環(huán)上2'、5'和6'氫的化學(xué)位移，7.58（d，J=15.9 Hz）和 6.30（d，J=15.9 Hz）為碳碳雙鍵上反式氫的化學(xué)位移，再結(jié)合碳譜可得，該化合物中存在一個咖啡?；?。氫譜中5.29（2H，d，J=20.2 Hz）、4.26（1H，dd，J=4.1，8.1 Hz）、3.65（2H，dd，J=7.9，4.0 Hz）、4.74（2H，d，J=16.0 Hz）為氧化半萜氫的化學(xué)位移，再結(jié)合碳譜可得，該化合物中存在一個氧化半萜。與文獻[4]中的1H-NMR和13C-NMR對比，最終確定該化合物為2-咖啡酰氧甲基-1-丁烯-3.4-二醇。

（4）化合物4。白色粒狀晶體，mp：173.8～174.9 ℃，易溶于甲醇。紫外燈下和碘缸中均顯色，F(xiàn)eCl3反應(yīng)呈陽性。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：6.71（1H，d，J=4.0），6.78（1H，d，J=7.9），6.68（1H，dd，J=1.5，7.9），4.03（1H，d，J=12.1），2.03（1H，dd，J=2.6，11.6），3.58（2H，d，J=3.9），6.65（1H，s），6.20（1H，s），3.23（1H，d，J=16.5），3.85，3.56（1H，m）。13C-NMR（MeOD，100 MHz）δ：133.5（C-1），113.9（C-2），149.1（C-3），146.0（C-4），116.0（C-5），123.5（C-6），44.8（C-7），47.5（C-8），60.8（C-9），138.4（C-1'），112.9（C-2'），147.5（C-3'），145.2（C-4'），117.3（C-5'），126.4（C-6'），39.9（C-7'），74.9（C-8'），69.4（C-9'）。1H-NMR（400 MHz，MeOD）譜可知，有5個苯環(huán)上氫的化學(xué)位移，3組亞甲基氫的化學(xué)位移，2個次甲基氫的化學(xué)位移，2組甲氧基氫的化學(xué)位移。13C-NMR（100 MHz，MeOD）譜圖中顯示出20個C的化學(xué)位移。與文獻[5]中的1H-NMR和13C-NMR對比，最終確定該化合物為（+）-環(huán)合橄欖樹脂素。

（5）化合物5。淡黃色針狀，mp：179.7～181.0 ℃，易溶于乙醇。TLC檢測：乙酸乙酯∶乙醇=3∶2展開，Rf=0.33，紫外燈下和碘缸中均顯色，鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽性，噴1% AlCl3-EtOH溶液并加熱后顯黃色。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：6.32（1H，d，J=2.1），6.67（1H，d，J=2.1），7.66（1H，d，J=1.9），6.99（2H，d，J=8.3），6.67（2H，d，J=8.5），7.53（1H，dd，J=9.1，1.9），5.32（1H，d，J=7.6 Hz），4.38（1H，d，J=1.0 Hz），0.93（3H，d，J=7.6 Hz）。13C-NMR（100 MHz，DMSO）δ：156.4（C-2），133.6（C-3），177.4（C-4），160.8（C-5），98.3（C-6），164.6（C-7），92.8（C-8），156.5（C-9），101.2（C-9），122.3（C-1'），112.6（C-2'），145.9（C-3'），150.8（C-4'），115.7（C-5'），122.4（C-6'），39.9（C-7'），74.9（C-8'），69.4（C-9'）。Glu-，105.0（C-1''），74.1（C-2''），76.3（C-3''），70.3（C-4''），75.9（C-5''），68.2（C-6''），Rha-，100.9（C-1'''），70.4（C-2'''），70.5（C-3''），71.6（C-4'''），70.1（C-5'''），17.6（C-6'''）。1H-NMR（400 MHz，DMSO）譜中δH（ppm）：6.32（1H，d，J=2.1 Hz）和6.67（1H，d，J=2.1 Hz）為A環(huán)上H-6和H-8的化學(xué)位移，由此可得A環(huán)為5、7-二取代，12.38（1H，s）和10.66（1H，s）分別為5、7-二取代羥基氫的化學(xué)位移。7.66（1H，d，J=1.9 Hz）、6.67（1H，d，J=8.5 Hz）和7.53（1H，dd，J=9.1，1.9 Hz）為B環(huán)上H-2'、H-5'和H-6'的化學(xué)位移，由此可得B環(huán)為3、4-二取代，9.25（1H，s）和9.21（1H，s）分別為3、4-二取代羥基氫的化學(xué)位移。9.48（1H，s）為C環(huán)上3取代羥基氫的化學(xué)位移。4.38（1H，d，J=1.0 Hz）和5.32（1H，d，J=7.6 Hz）分別為α鼠李糖和β構(gòu)型葡萄糖端基氫的化學(xué)位移。13C-NMR（100 MHz，DMSO）譜圖中，有15個碳的化學(xué)位移歸屬于黃酮苷元，剩下的12個碳的化學(xué)位移歸屬于鼠李糖和葡萄糖。與文獻[6]中的1H-NMR和13C-NMR對比，最終確定該化合物為蘆丁。

（6）化合物6。白色針狀晶體，mp：281.2～283.0 ℃，易溶于丙酮、乙酸乙酯。TLC檢測：氯仿∶乙酸乙酯=4∶1展開，Rf=0.42，紫外燈下不顯色，碘缸中顯色，噴10% H2SO4-EtOH溶液并加熱后顯紅色，Libermman-Burchard反應(yīng)呈陽性。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：3.17（1H，dd，10.8，4.9），5.13（1H，t，3.5），0.82（3H，d，4.6），0.91（3H，d，2.9）。13C-NMR（100 MHz，DMSO）δ：39.1（C-1），26.9（C-2），76.8（C-3），39.3（C-4），54.8（C-5），18.0（C-6），32.7（C-7），40.1（C-8），46.8（C-9），38.2（C-10），23.8（C-11），124.5（C-12），138.2（C-13），41.6（C-14），28.2（C-15），22.8（C-16），46.6（C-17），52.4（C-18），39.9（C-19），39.7（C-20），30.1（C-21），38.3（C-22），（30.2C-23），15.2（C-24），16.1（C-25），17.0（C-26），23.3（C-27），178.3（C-28），16.9（C-29），21.1（C-30）。1H-NMR（400 MHz，DMSO）譜圖中δH（ppm）：11.97（1H，brs，COOH）為羧酸上氫的化學(xué)位移，5.13（1H，t，J=3.5 Hz，H-12）為碳碳雙鍵上氫的化學(xué)位移，3.17（1H，dd，J=10.8，4.9 Hz，H-3）為次甲基上氫的化學(xué)位移，1.04、0.89、0.87、0.80、0.75、0.68單峰和0.91、0.82雙峰為甲基上氫的化學(xué)位移。13C-NMR（100 MHz，DMSO）譜圖中δC（ppm）：178.28為羧酸上碳的化學(xué)位移，138.17、124.55為碳碳雙鍵上碳的化學(xué)位移，76.80為與羥基相連碳上的化學(xué)位移，此外，譜圖中碳原子的個數(shù)為30。與文獻[7]中的1H-NMR和13C-NMR對比，最終確定該化合物為熊果酸。

（7）化合物7。黃色粉末，mp：309.1～311.3 ℃，易溶于丙酮。TLC檢測：氯仿∶甲醇=9∶1展開，Rf=0.27，紫外燈下和碘缸中均顯色，鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽性，噴1% AlCl3-EtOH溶液并加熱后顯黃色。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：6.06（1H，d，J=1.7），6.28（1H，d，J=2.0），7.56（1H，d，J=1.7），6.77（1H，d，J=8.6），7.43（1H，dd，J=8.6，1.7）。13C-NMR（100 MHz，DMSO）δ：148.1（C-2），136.2（C-3），176.3（C-4），161.2（C-5），98.6（C-6），164.3（C-7），93.8（C-8），156.6（C-9），103.5（C-10），122.4（C-1'），115.5（C-2'），145.5（C-3'），147.2（C-4'），116.1（C-5'），120.4（C-6'）。1H-NMR（400 MHz，DMSO）譜圖中δH（ppm）：6.06（1H，d，J=1.7 Hz）和6.28（1H，d，J=2.0 Hz）為A環(huán)上H-6和H-8的化學(xué)位移，由此可得A環(huán)為5、7-二取代，12.38（1H，s）和10.66（1H，s）分別為5、7-二取代羥基氫的化學(xué)位移。7.56（1H，d，J=1.7 Hz）、6.77（1H，d，J=8.6 Hz）和7.43（1H，dd，J=8.6，1.7 Hz）為B環(huán)上H-2'、H-5'和H-6'的化學(xué)位移，由此可得B環(huán)為3、4-二取代，9.25（1H，s）和9.21（1H，s）分別為3、4-二取代羥基氫的化學(xué)位移。9.48（1H，s）為C環(huán)上3取代羥基氫的化學(xué)位移。13C-NMR（100 MHz，DMSO）譜圖中δC（ppm）：176.34為羰基碳的化學(xué)位移，98.69和93.86分別為C-6和C-8的化學(xué)位移，這是5、7-二羥基黃酮的特征峰。此外，譜圖中碳原子的個數(shù)為15。與文獻[8]中的1H-NMR和13C-NMR對比，最終確定該化合物為槲皮素。

（8）化合物8。淺黃色針狀晶體，mp：313.4～314.7 ℃，易溶于甲醇。TLC檢測：氯仿∶甲醇=96∶4展開，Rf=0.50，紫外燈下和碘缸中均顯色，F(xiàn)eCl3反應(yīng)呈陽性。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：7.95（1H，d，J=8.5 Hz），6.93（1H，dd，J=8.5，2.1 Hz），6.82（1H，d，J=2.1 Hz），7.39（2H，d，J=8.2 Hz），6.83（2H，d，J=8.2 Hz），6.83（2H，d，J=8.2 Hz），7.39（2H，d，J=8.2 Hz）。13C-NMR（100 MHz，DMSO）δ：152.8（C-2），123.6（C-3），174.8（C-4），127.4（C-5），115.1（C-6），162.6（C-7），102.2（C-8），157.3（C-9），116.7（C-10），122.7（C-1'），130.2（C-2'），115.1（C-3'），157.5（C-4'），115.1（C-5'），130.2（C-6'）。1H-NMR（400 MHz，DMSO）譜圖中δH（ppm）：8.21（1H，s）為羰基β位H-2的化學(xué)位移，7.95（1H，d，J=8.5 Hz）和6.93（1H，dd，J=8.5，2.1 Hz）和6.82（1H，d，J=2.1 Hz）為A環(huán)上H-5、H-6和H-8的化學(xué)位移，由此可得A環(huán)為7取代，7.39（2H，d，J=8.2 Hz）為B環(huán)上H-2'、和H-6'的化學(xué)位移，6.83（2H，d，J=8.2 Hz）為B環(huán)上H-3'和H-5'的化學(xué)位移，由此可得B環(huán)為4'取代。13C-NMR（100 MHz，DMSO）譜圖中δC（ppm）：174.88為羰基碳的化學(xué)位移，127.4、98.69和93.86分別為C-5、C-6和C-8的化學(xué)位移，130.25的重疊峰為C-2'和C-6'的化學(xué)位移，115.13的重疊峰為C-3'和C-5'的化學(xué)位移。與文獻[9]中的1H-NMR和13C-NMR對比，最終確定該化合物為大豆苷元。

（9）化合物9。白色針狀晶體，mp：229.5～230.8 ℃，易溶于氯仿和丙酮。紫外燈下不顯色，碘缸中顯色，噴10% H2SO4-EtOH溶液并加熱后顯紅色。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：32.3（C-1），26.4（C-2），72.2（C-3），46.2（C-4），50.5（C-5），19.8（C-6），（32.3C-7），40.2（C-8），46.2（C-9），36.6（C-10），23.5（C-11），122.2（C-12），141.2（C-13），42.7（C-14），26.7（C-15），28.7（C-16），34.3（C-17），57.2（C-18），37.7（C-19），36.9（C-20），32.1（C-21），42.7（C-22），24.7（C-23），181.2（C-24），12.3（C-25），19.2（C-26），21.5（C-27），29.5（C-28），19.4（C-29），20.2（C-30）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）譜圖中δH（ppm）：5.36（1H，s）為碳碳雙鍵上H的化學(xué)位移，0.68～1.00共有21個H，為7個-CH3的化學(xué)位移。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）譜圖中顯示出30個C的化學(xué)位移。與文獻[10-11]中的1H-NMR和13C-NMR對比，最終確定該化合物為β-乳香酸。

參 考 文 獻

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