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    槲皮素在HepG2細(xì)胞中抑制膽固醇蓄積所致的炎性反應(yīng)

    2017-05-27 15:22王煉詞
    中國科技縱橫 2016年24期
    關(guān)鍵詞:炎癥反應(yīng)槲皮素

    王煉詞

    【摘 要】目的:研究槲皮素(Quercetin)對HepG2細(xì)胞膽固醇蓄積所致炎性反應(yīng)的抑制作用及機(jī)制。方法:雙熒光素酶報告基因活性試劑盒檢測槲皮素對人NPC1L1啟動子活性的影響,熒光定量PCR檢測NPC1L1 結(jié)果:槲皮素可劑量依賴性抑制NPC1L1啟動子的活性和NPC1L1 mRNA的表達(dá);結(jié)論:槲皮素可通過抑制NPC1L1啟動子的活性下調(diào)其表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)對膽固醇蓄積所致炎性反應(yīng)的抑制作用。

    【關(guān)鍵詞】槲皮素 NPC1L1表達(dá) 膽固醇攝取 炎癥反應(yīng)

    人NPC1L1蛋白在肝臟表達(dá)豐富,位于肝細(xì)胞基底膜,負(fù)責(zé)重吸收膽汁中的游離膽固醇入肝[1]。研究還發(fā)現(xiàn),NPC1L1是新型降脂藥物依澤替米貝(ezetimibe)的分子靶點(diǎn), ezetimibe通過阻斷NPC1L1進(jìn)而減少小腸及肝臟對膽固醇的吸收[2]。體外和體內(nèi)研究均報道,ezetimibe可顯著改善膽固醇負(fù)荷導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)以及肝臟損傷。因此,NPC1L1成為NASH治療的一個新的候選靶點(diǎn)。

    槲皮素(quercetin)是一種常見的植物雌激素,也是異黃酮類化合物的主要成份之一?,F(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有廣泛的藥理作用,具有抗氧化、降血脂和抗腫瘤等效應(yīng)[3]。研究顯示槲皮素可調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)的代謝,但對NASH的防治作用還不清楚?;谏鲜鰣蟮?,我們開展本實(shí)驗(yàn)探討槲皮素對NPC1L1啟動子活性的影響,從而對其介導(dǎo)的膽固醇負(fù)荷和炎性反應(yīng)的影響及可能的機(jī)制。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    人肝癌細(xì)胞株HepG2來自武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心(武漢,中國),人NPC1L1啟動子雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒(pGL4.17-hNPC1L1)及內(nèi)參質(zhì)粒由婁曉亞博士惠贈(中南大學(xué)林藥理研究所,長沙,中國),DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶購于Gibco 公司(美國),DMSO、槲皮素和水溶性膽固醇購于Sigma 公司(美國),ezetimibe購自TRC公司(加拿大),細(xì)胞增殖活力檢測試劑盒和雙熒光素酶報告基因活力檢測試劑盒購自Promega公司(美國),Lipofectamine2000、Trizol、TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒購于Invitrogen公司(美國),逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒購于Takara公司(日本),細(xì)胞內(nèi)總膽固醇檢測試劑盒購自普利萊公司(中國,北京)。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37度含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。HepG2細(xì)胞用0.25%的胰酶消化后鋪板(96孔),達(dá)到60-70%融合時用不同濃度槲皮素(2.5、5、10、20、40μM)進(jìn)行處理。

    1.3 雙熒光素報告基因活性檢測

    HepG2細(xì)胞消化后鋪板(24孔),達(dá)到60-70%融合時,用lipofectamine2000按照說明書轉(zhuǎn)染pGL4.17-hNPC1L1和內(nèi)參質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染24小時后用不同濃度槲皮素(5、10、20、40μM)處理24小時,按照說明,使用Promega雙熒光素酶報告基因活力檢測試劑盒檢測其活性并分析。

    1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

    采用SPSS18.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean+SD)表示。組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 槲皮素對NPC1L1啟動子活性的影響

    我們利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測槲皮素對NPC1L1啟動子活性的影響,HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGL.17-hNPC1L1質(zhì)粒及內(nèi)參質(zhì)粒24小時后,不同濃度槲皮素處理(5、10、20、40μM)處理24小時,再用試劑盒檢測其活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),如圖1所示,與DMSO組相比,槲皮素可濃度依賴性抑制NPC1L1啟動子的活性,10μM槲皮素即可顯著下調(diào)NPC1L1啟動子的活性。

    2.2 槲皮素下調(diào)HepG2細(xì)胞中NPC1L1的mRNA表達(dá)水平

    不同濃度(5、10、20μM)槲皮素處理HepG2細(xì)胞24小時后提取RNA進(jìn)行定量,觀察槲皮素對NPC1L1 表達(dá)水平影響。從圖2知,與DMSO組相比,槲皮素處理可劑量依賴性顯著下調(diào)NPC1L1 mRNA水平。

    3 討論

    近年來,隨著生活水平的改善,我國NASH的發(fā)病率逐年增高,但缺乏有效的預(yù)防和治療方法。有研究發(fā)現(xiàn),NASH的發(fā)病與肝臟膽固醇負(fù)荷密切相關(guān)[4]。研究標(biāo)明,肝臟膽固醇的過度蓄積可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,通過引發(fā)線粒體損傷以及肝kuffer細(xì)胞和星狀細(xì)胞的活化,最終導(dǎo)致胰島素抵抗和炎癥反應(yīng),造成肝臟的損傷[5]。在本實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)槲皮素可下調(diào)肝細(xì)胞NPC1L1啟動子活性,進(jìn)而下調(diào)HepG2細(xì)胞NPC1L1的表達(dá);抑制NPC1L1介導(dǎo)的膽固醇蓄積及炎癥反應(yīng)。

    人體膽固醇水平的動態(tài)平衡受到膽固醇的自身合成、小腸對膽固醇的吸收以及膽汁膽固醇的分泌三條途徑的嚴(yán)格控制。人NPC1L1蛋白是小腸和肝臟(重)吸收膽固醇的關(guān)鍵蛋白,因此NPC1L1表達(dá)的高低對于維持全身及肝臟膽固醇動態(tài)平衡有著重要的意義[6]。多種脂質(zhì)代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子參與了NPC1L1的表達(dá)調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn),SREBP2和PPARα可與NPC1L1啟動子區(qū)域特異性序列結(jié)合,說明兩者可通過直接結(jié)合NPC1L1啟動子上調(diào)其表達(dá)[7]。已有報道,槲皮素可通過抑制多種轉(zhuǎn)錄因子如SREBP-1c及PPARα的表達(dá)減少脂質(zhì)的生成[8]。在本實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)槲皮素可抑制NPC1L1啟動子活性進(jìn)而下調(diào)肝細(xì)胞中NPC1L1的表達(dá),其機(jī)制可能是通過PPARα途徑進(jìn)行調(diào)控。

    參考文獻(xiàn):

    [1] Charlton MR, Burns JM, Pedersen RA, sing RA.et al. Frequency and outcomes of liver transplantation for nonalcoholic steatohepatitis in the United States [J]. Gastroenterology, 2011;141:1249-53.

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