腭突間充質(zhì)細(xì)胞中TGFβ1信號(hào)通路介導(dǎo)維甲酸致腭裂的實(shí)驗(yàn)研究

湯偉鉗　胡曉

【摘要】 目的 探討轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGFβ1）信號(hào)通路在維甲酸（RA）致腭裂過程中的作用。方法 選取8～10周齡野生型小鼠， 構(gòu)建RA誘導(dǎo)腭裂的小鼠模型， 分別取E13.5（E13.5組）、E15.5（E15.5組）和E17.5（E17.5組）的腭突， 熒光定量PCR（q-PCR）檢測(cè)TGFβ1基因的表達(dá)， 信號(hào)通路檢測(cè)法（Western blot）檢測(cè)下游p-Smad2（S467）的表達(dá)；RA處理原代培養(yǎng)的腭突間充質(zhì)細(xì)胞（MEPM）， q-PCR檢測(cè)TGFβ1基因的表達(dá)， Western blot檢測(cè)下游p-Smad2（S467）的表達(dá)。RA和TGFβ1共同處理MEPM， CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果 RA誘導(dǎo)的腭裂小鼠中， E13.5組和E15.5組腭突中TGFβ1的表達(dá)顯著下降（P<0.01）， 到E17.5時(shí)， 與對(duì)照組的表達(dá)水平相當(dāng)（P>0.05）。p-Smad2（S467）的表達(dá)也呈現(xiàn)同樣的趨勢(shì)。RA顯著抑制了MEPM中TGFβ1和p-Smad2（S467）的表達(dá)， 且呈濃度依賴性。RA和TGFβ1共處理組的細(xì)胞增殖活性較RA單純處理組顯著上升， 體外添加TGFβ1重組蛋白能有效逆轉(zhuǎn)RA對(duì)MEPM增殖的抑制作用。結(jié)論 MEPM中TGFβ1信號(hào)通路在RA致腭裂過程中發(fā)揮著重要作用。

【關(guān)鍵詞】 維甲酸；腭裂；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；腭突間充質(zhì)細(xì)胞

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.32.090

【Abstract】 Objective To investigate effect by signal channel of transforming growth factor β1 （TGFβ1） in embryonic palate mesenchymal cells in retinoic acid （RA）-induced cleft palate. Methods RA-induced cleft palate rat model was established on 8～10-week-old wild mice. Palatine process of E13.5（E13.5 group）， E15.5（E15.5 group） and E17.5（E17.5 group） were taken， along with quantitative PCR（q-PCR） for TGFβ1 gene expression detection and Western blot for downstream p-Smad2 （S467） expression detection. RA was used to process embryonic palate mesenchymal cells （MEPM） in primary culture， along with q-PCR for TGFβ1 gene expression detection and Western blot for downstream p-Smad2 （S467） expression detection. Combination of RA and TGFβ1 was used to process MEPM cells， along with CCK-8 for cellular proliferative activity detection. Results Among rats with RA-induced cleft palate， E13.5 group and E15.5 group had obviously reduced TGFβ1 expression （P<0.01）， which was at similar level as the control group in E17.5 （P>0.05）. Their p-Smad2 （S467） expression showed the same pattern. Expression of TGFβ1 and p-Smad2 （S467） expressions in MEPM cells were obviously inhibited by RA， along with concentration dependent manner. Cellular proliferative activity in combined process by RA and TGFβ1 was higher than single RA. External addition of TGFβ1 recombinant protein effectively reversed inhibiting effect by RA on MEPM cells proliferation. Conclusion Signal channel of TGFβ1 in MEPM shows significant effect in retinoic acid-induced cleft palate.

【Key words】 Retinoic acid； Cleft palate； Transforming growth factor β1； Embryonic palate mesenchymal cells

RA是哺乳動(dòng)物胚胎各個(gè)器官正常發(fā)育必不可少的物質(zhì)。過量RA可導(dǎo)致腭裂已早有報(bào)道， 但具體的分子機(jī)制尚不明確。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGFβ）超家族是一類具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子， 在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。有研究顯示RA誘導(dǎo)腭裂的過程中腭突上皮細(xì)胞的TGFβ1信號(hào)通路出現(xiàn)異常[1]， 但MEPM的TGFβ1信號(hào)通路在RA致腭裂中的作用尚不清楚。本研究探討了RA對(duì)小鼠體內(nèi)腭突和體外培養(yǎng)的MEPM中TGFβ1信號(hào)通路的影響， 分析了TGFβ1信號(hào)通路介導(dǎo)RA致腭裂的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8～10周齡的野生型C57BL/6J小鼠購(gòu)自于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)SCXK（粵）2013-0002]。SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)， 12 h光照， 12 h黑暗， 食物和水自由獲取。交配當(dāng)天晚上以雌雄2∶1的比例合籠， 次日早晨檢測(cè)雌鼠陰道栓， 陽(yáng)性者記為E0.5。

1. 2 RA誘導(dǎo)腭裂模型的構(gòu)建 分別取E13.5（E13.5組）、E15.5

（E15.5組）和E17.5（E17.5組）的腭突， q-PCR檢測(cè)TGFβ1基因的表達(dá)， Western blot檢測(cè)下游p-Smad2（S467）的表達(dá)；RA購(gòu)于上海sigma公司， 模型的構(gòu)建參照先前的報(bào)道進(jìn)行[2]。

1. 3 q-PCR檢測(cè) 分別取各組的胚鼠， 于解剖鏡下剪取腭突組織， 加入Trigene試劑提取總RNA， 用RE-TROscript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA， 用q-PCR（SYBR green）檢測(cè)的方法， 以β-actin為內(nèi)參， 分析TGFβ1的基因表達(dá)水平。以上試劑均購(gòu)自北京康潤(rùn)生物公司。

1. 4 Western blot檢測(cè) 分別取各組的腭突組織， 于液氮中研磨成粉末， 加入RIPA裂解液[海門碧云天， 含50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）， 150 mmol/L NaCl， 1% NP-40， 0.1% SDS和1 mmol/L PMSF]， 裂解充分后， 離心， 取上清， 用Western blot法檢測(cè)下列TGFβ/Smad2信號(hào)通路蛋白的表達(dá)：p-Smad2（S647）、Smad2（武漢愛博泰克）， β-actin（天津三箭）。

1. 5 MEPM原代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)參照前面報(bào)道的方法進(jìn)行。簡(jiǎn)要過程如下：取E13.5正常胚鼠的上腭， 用顯微剪剪下雙側(cè)腭突組織， Hanks緩沖液漂洗后， 剪成約1 mm3大小的組織塊， 用組織塊貼瓶法進(jìn)行培養(yǎng)。待間充質(zhì)細(xì)胞爬出組織塊并長(zhǎng)至約80%覆蓋度時(shí)， 進(jìn)行第一次傳代（P1）， 取P3～P5代細(xì)胞進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞經(jīng)處理后， q-PCR和Western blot檢測(cè)如前所述進(jìn)行。細(xì)胞活力檢測(cè)（CCK-8法， 南京東仁化學(xué)）實(shí)驗(yàn)中， MEPM經(jīng)RA（2 μm）和TGFβ1（2 ng/ml， 北京義翹神州）處理24 h后， 操作按照說明書進(jìn)行。

1. 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；用qPCR分析基因相對(duì)表達(dá)量時(shí)， 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為相對(duì)于對(duì)照組的倍數(shù)；用CCK-8分析原代細(xì)胞增殖時(shí)， 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)百分?jǐn)?shù)， 兩組間差異比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)， 三組的組間差異比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 RA對(duì)小鼠體內(nèi)腭突TGFβ1信號(hào)通路的影響 q-PCR結(jié)果顯示， E15.5組的小鼠腭突中TGFβ1的表達(dá)較E13.5組顯著升高， 到E17.5時(shí)又顯著下降。而在RA組， E13.5組和E15.5組中TGFβ1的表達(dá)均較對(duì)照組顯著下降（P<0.01）， 而到E17.5時(shí)， E15.5組和RA組TGFβ1的表達(dá)水平相當(dāng)， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。表明RA抑制了腭發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期（E13.5和E15.5）TGFβ1的表達(dá)。為了驗(yàn)證這一結(jié)果， 本次采用Western blot的方法進(jìn)一步分析了TGFβ1信號(hào)通路下游的重要因子Smad2的活性。結(jié)果顯示， 在E13.5和E15.5， RA組p-Smad2（S467）的表達(dá)均較對(duì)照組顯著下降， 到E17.5時(shí)則與對(duì)照組基本相當(dāng)， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。以上結(jié)果表明RA抑制了腭發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期（E13.5和E15.5）TGFβ1信號(hào)通路的活性。

2. 2 RA對(duì)體外培養(yǎng)的MEPM中TGFβ1信號(hào)通路的影響 q-PCR結(jié)果顯示， RA顯著抑制了MEPM中TGFβ1的表達(dá)， 且呈濃度依賴性。同樣Western blot結(jié)果顯示， RA顯著抑制了MEPM中p-Smad2（S467）的表達(dá)， 且呈濃度依賴性。見圖2。結(jié)果表明RA抑制了MEPM中TGFβ1信號(hào)通路的活性。

2. 3 體外添加TGFβ1逆轉(zhuǎn)RA對(duì)MEPM增殖的抑制作用

CCK-8法結(jié)果顯示， RA顯著降低了MEPM的增殖活力（RA：2 μm， TGFβ1：2 ng/ml， 處理24 h）。為了探討TGFβ1在RA抑制MEPM增殖中所扮演的角色， 在RA處理的MEPM中添加了TGFβ1重組蛋白。結(jié)果顯示， RA和TGFβ1共處理組的細(xì)胞增殖活性較RA單純處理組顯著上升， 表明體外添加TGFβ1重組蛋白能有效逆轉(zhuǎn)RA對(duì)MEPM細(xì)胞增殖的抑制作用。見圖3。

3 討論

小鼠腭的形成過程與人類非常相似， 是開展腭裂病因?qū)W研究的常用模型。正常小鼠腭的發(fā)育開始于E11.5， 在E12.5時(shí)腭突垂直向下生長(zhǎng)， 一直持續(xù)至E13.5；在E14.5左右腭突上抬呈水平生長(zhǎng)， 到E15.5時(shí)雙側(cè)腭突開始接觸、粘附， 隨后上皮細(xì)胞大量凋亡， 雙側(cè)腭突的間充質(zhì)細(xì)胞相融合， 形成連續(xù)的上腭；到E17.5時(shí)腭完全融合形成一道屏障將口腔和鼻腔分開， 形成獨(dú)立的口洞和鼻洞[3， 4]?？梢?， 腭的發(fā)育是由一系列復(fù)雜的過程組成， 并受多種信號(hào)通路的調(diào)控。在前期的研究中， 成功構(gòu)建了RA誘導(dǎo)腭裂的小鼠模型， 并探討了Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與其中的分子機(jī)制[5， 6]。TGFβ信號(hào)通路也與腭的發(fā)育過程緊密關(guān)聯(lián)。研究表明， 在腭的發(fā)育過程中， TGFβ1及其下游信號(hào)分子Smad2的表達(dá)具有時(shí)空特性， 在上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)不同， 在不同腭發(fā)育時(shí)期的表達(dá)也不同。新近有研究顯示， RA誘導(dǎo)腭裂的過程中腭突上皮細(xì)胞的TGFβ1信號(hào)通路出現(xiàn)異常[7-10]。但MEPM的TGFβ1信號(hào)通路在RA致腭裂中的作用尚不清楚。為此， 作者首先檢測(cè)了RA誘導(dǎo)腭裂小鼠模型中MEPM TGFβ1的表達(dá)。在對(duì)照組， 從E13.5～E15.5， 間充質(zhì)細(xì)胞的TGFβ1表達(dá)持續(xù)升高， 到E17.5時(shí)迅速降低， 這與腭發(fā)育過程中間充質(zhì)細(xì)胞先擴(kuò)增后分化的軌跡相吻合。同時(shí)， 從E13.5～E15.5RA組間充質(zhì)細(xì)胞中TGFβ1的表達(dá)較對(duì)照組顯著降低， 表明TGFβ1參與調(diào)控間充質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化。為了進(jìn)一步分析間充質(zhì)細(xì)胞中TGFβ1通路在RA致腭裂中的作用， 作者構(gòu)建了間充質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)模型， 發(fā)現(xiàn)RA能顯著抑制MEPM中TGFβ1通路的活性， 同時(shí)呈濃度依賴性， 與體內(nèi)結(jié)果一致， RA也顯著降低了MEPM的增殖活性。體外添加TGFβ1有效逆轉(zhuǎn)RA的抑制作用。這些結(jié)果一致表明， MEPM中TGFβ1信號(hào)通路在RA致腭裂過程中也發(fā)揮了重要的作用。對(duì)這一問題進(jìn)行更加深入的研究， 將有助于進(jìn)一步豐富對(duì)腭裂病因?qū)W的認(rèn)識(shí)。

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[收稿日期：2016-10-03]