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    PPARs激動(dòng)劑體外篩選模型的建立及其在澤瀉活性成分篩選中的應(yīng)用

    2017-02-16 14:05:35李小艷王小花黃小強(qiáng)吳婷婷許文
    中國中藥雜志 2016年21期
    關(guān)鍵詞:三萜澤瀉孔板

    李小艷+王小花+黃小強(qiáng)+吳婷婷+許文+吳水生

    [摘要]利用酵母GAL4 BD-UAS反式激活分析(transactivation assay)系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中建立以過氧化物酶體增殖物受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PPARs-LBD,包括PPARα,PPARβ和PPARγ)為靶點(diǎn)的體外篩選模型,并應(yīng)用該模型對澤瀉化學(xué)成分進(jìn)行篩選,研究澤瀉14種化學(xué)成分對PPARs的激活作用。首先構(gòu)建GAL4 BD-PPARsLBD融合表達(dá)質(zhì)粒pBind-PPARs-LBD,采用Lipofectamine將表達(dá)質(zhì)粒pBind-PPARs-LBD與含有UAS:luciferase報(bào)告質(zhì)粒pGL4.35共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。以PPARs的激動(dòng)劑(PPARα:非諾貝特;PPARβ:L165041;PPARγ:羅格列酮)為陽性對照,通過測定螢火蟲熒光素酶活性來驗(yàn)證系統(tǒng)是否構(gòu)建成功,并用該系統(tǒng)來考察澤瀉中14種化學(xué)成分對PPARs靶點(diǎn)激活的影響。PPARs的陽性激動(dòng)劑結(jié)果顯示系統(tǒng)構(gòu)建成功,用該系統(tǒng)分析澤瀉化學(xué)成分結(jié)果顯示澤瀉單體化合物5,6,7,8,13,14對PPARα有激活作用,化合物5,7對PPARβ有激活作用,而化合物6,7,8,12對PPARγ有激活作用,其中化合物12對PPARγ有顯著激活能力。該研究在哺乳動(dòng)物293T細(xì)胞中成功構(gòu)建以PPARα/β/γ配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榘悬c(diǎn)的體外篩選細(xì)胞模型,并成功應(yīng)用于澤瀉PPARα/β/γ的天然激動(dòng)劑的篩選。

    [關(guān)鍵詞]過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs); 激動(dòng)劑; 澤瀉; 三萜成分

    [Abstract]Peroxisome proliferators activated receptors (PPARs) are closely related to human chronic disease, such as diabetes mellitus and the other metabolic diseases. In this study, a cell-based PPARs (PPARα/β/γ) model was developed for the screening of PPARs agonists from Alismatis Rhizoma (AR). Firstly, 293T cells were transfected with the reconstructed plasmid pBind-PPAR (α,β, orγ)-LBD and reporter gene pGL4.35, and the known PPARs agonists were used as the positive control (fenofibrate for PPARα, L165041 for PPARβ, and rosiglitazone for PPARγ). The ability of activation for PPARs was evaluated by analyzing the expression value of luciferase. Afterward, the 14 pure triterpenoids isolate from AR were analyzed on the developed PPARα, PPARβ and

    PPARγ screening assay method. The results showed that the compounds 5, 6, 7, 8, 13 and 14 from AR have the ability of activation for PPARα. The compounds 5 and 7 from AR have the ability of activation for PPARβ. The compounds 6, 7, 8 and 12 from RA have the ability of activation for PPARγ.In this study, the compound 12 from AR were found to display significant activation on PPARγ for the first time. AR triterpenoids extracts had the ability of activation for PPARα, PPARβ and PPARγ. The results suggested that triterpenoids extracts from AR were PPARα, PPARβ and PPARγ agonists. The results will help to provide reference for clinical application of AR, and establish a model for PPARs on 293T cell, which can be used to screen and evaluate PPARs natural agonists.

    [Key words]peroxisome proliferator-activated receptors; agonist; Alismatis Rhizoma; active triterpenoids ingredients

    doi:10.4268/cjcmm20162121

    過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是核激素受體超家族中的配體激活轉(zhuǎn)錄因子,參與許多與慢性疾病密切相關(guān)的臨床生理和病理過程,成為代謝疾病(2型糖尿病、高血脂、心血管疾病等)治療的重要靶點(diǎn)[1]。其作用機(jī)制是PPAR與類維甲酸受體(RXR)形成異源二聚體,再與靶基因啟動(dòng)子上的PPRE序列結(jié)合,之后通過配體的激活誘導(dǎo)輔阻遏物蛋白的分離和輔激活物的募集,形成PPAR活化復(fù)合物,導(dǎo)致糖脂代謝、脂質(zhì)平衡、脂肪細(xì)胞分化的基因表達(dá)發(fā)生改變[2]。PPARs具有多種生物學(xué)效應(yīng),調(diào)控著大量涉及調(diào)節(jié)糖脂中間代謝、內(nèi)穩(wěn)態(tài)、脂肪細(xì)胞分化、胰島素敏感、免疫應(yīng)答、細(xì)胞增長和變異的基因表達(dá),是調(diào)整糖脂代謝綜合征有效的治療方法,如降脂藥貝特類藥物及降糖藥TZDs類藥物[3],但是這些合成藥物如TZDs常常會導(dǎo)致病患體增重、水腫,并增加罹患心肌梗塞的風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)還會產(chǎn)生肝毒性;而貝特類降脂藥會增加患膽結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn),引起肌肉衰竭等[4],從中藥中尋找活性更佳,副作用更小的PPARs激動(dòng)劑已成為當(dāng)今制藥研究的熱點(diǎn)和PPARs藥物研發(fā)的主要研究趨勢[5]

    澤瀉Alisma orientale(Sam.) Juzep作為一味傳統(tǒng)中藥,表現(xiàn)出多方面的藥理學(xué)活性,包括利尿、神經(jīng)保護(hù)、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血糖、抗炎、抗腫瘤和抗氧化活性[6],成為許多傳統(tǒng)中醫(yī)藥配方不可或缺的部分。已有文獻(xiàn)表明澤瀉提取物是PPARs的多重激動(dòng)劑[7],但是具體的活性成分尚未闡明,因此,本研究建立PPARs激動(dòng)劑體外篩選模型并應(yīng)用澤瀉PPARs相關(guān)活性成分的篩選,為澤瀉降脂降糖作用機(jī)制提供參考,也為具有潛在PPARs活性的天然藥物活性成分篩選提供一種高通量模型。

    1 材料

    BCD-248冰箱(中國Haier公司);SW-CJ-1FD型超凈工作臺(蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司);Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司);HERACELL 150i型CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);DK-8D電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);CPA225D 1/10萬分析天平(德國Sartorius公司);臺式pH計(jì)(美國METTLER TOLEDO公司);TDL-50B臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);低溫高速臺式離心機(jī),移液槍(德國Eppendorf公司);RNA逆轉(zhuǎn)錄儀,ABi 7900 Quantitative real-time PCR儀(美國ABi公司);小型垂直電泳槽,小型轉(zhuǎn)印槽,基礎(chǔ)電泳儀電源及凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);Leica DMIL LED倒置顯微鏡(德國徠卡儀器公司);FLUO STAR Omega多功能熒光酶標(biāo)儀(德國BMG LABTECH公司);GloMax 20/20單管光度計(jì)(美國Promega公司);6孔培養(yǎng)板,24孔板,96孔板,培養(yǎng)瓶(美國Corning Costar公司)。

    人胚胎腎細(xì)胞株293T,人宮頸癌細(xì)胞株HeLa和人肝癌細(xì)胞株HuH7(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫,由本實(shí)驗(yàn)室保存);pBind,pGL4.35質(zhì)粒(廈門欣基生物科技有限公司);大腸桿菌DH5α菌株(由本實(shí)驗(yàn)室保存)。

    DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清,雙抗(PS)青鏈霉素混合液,胰蛋白酶,PBS緩沖液,磷酸鹽緩沖液(美國Hyclone公司);TRizol試劑,DEPC-H2O,Lipofectamine LTX and Plus Reagent 15338-100(美國Invotrogen公司);DNA聚合酶,限制性內(nèi)切酶,DNA連接酶(大連寶生物工程有限公司);cDNA合成試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Kit,熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ,RT-PCR試劑盒Accu Power 2× Greenstarq PCR Master Mix,DNA純化試劑盒QIA quick PCR purification Kit(日本Takara公司);質(zhì)粒提取試劑盒,瓊脂糖,雙熒光素酶檢測試劑盒Dual-Luciferase Reporter Assay System E1910(美國Promega公司);AMP(美國Amresco公司);DMSO, MTT(美國Sigma公司);SDS-PAGE凝膠配制試劑盒,超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒,Western及IP細(xì)胞裂解液,彩色預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),TBSSDS-PAGE電泳液,Western轉(zhuǎn)膜液,Western封閉液,Western一抗稀釋液,Western二抗稀釋液(碧云天);鼠抗β-actin,兔抗多克隆PPARα(H-98)抗體sc-9000,兔抗多克隆PPARβ(H-74)抗體sc-7197,兔抗多克隆PPARγ(H-100)抗體sc-7196(Santa Cruz Biotechnology公司);其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

    澤瀉化合物1~14,分別為澤瀉醇A(1)、24-乙酰澤瀉醇A(2)、澤瀉醇B(3)、23-乙酰澤瀉醇B(4)、澤瀉醇C(5)、23-乙酰澤瀉醇C(6)、澤瀉醇F(7)、24-乙酰澤瀉醇F(8)、澤瀉醇G(9)、澤瀉醇L(10)、11-去氧澤瀉醇B(11)、13,17-環(huán)氧-24-乙酰澤瀉醇A(12)、16-羰基澤瀉醇A(13)、16-羰基-24-乙酰澤瀉醇A(14)及澤瀉三萜提取物(15)(均由本實(shí)驗(yàn)室分離制備[8-11],其中三萜提取物按照前期研究工藝對澤瀉總?cè)撇课贿M(jìn)行富集純化后所得的部位[12]),化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1;羅格列酮、非諾貝特及L165041(美國Sigma公司)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 pBind-PPARs-LBD表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

    本實(shí)驗(yàn)選擇使用pBind(含有酵母GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域且?guī)в蠪lag標(biāo)簽)質(zhì)粒作為載體[12],結(jié)構(gòu)見圖2。采用Trizol法提取293T,HeLa和HuH7細(xì)胞總混合RNA,利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PPARs PCR引物,見表1,通過RT-PCR從293T,HeLa和HuH7細(xì)胞RNA克隆PPARα-LBD cDNA,PPARβ-LBD cDNA和PPARγ-LBD cDNA序列,PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳,膠回收目的條帶,將載體pBind和目的基因PPARs-LBD PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切,回收、純化酶切產(chǎn)物,再將PPARs-LBD連接至pBind Gal-DBD形成新的功能質(zhì)粒pBind-PPARs-LBD,并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)大腸桿菌中,挑取單克隆,菌落PCR驗(yàn)證后用LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)菌落,按照Promega質(zhì)粒提取試劑盒操作抽提重組質(zhì)粒陽性克隆,參考PPARs-LBD和pBind的序列,采用KpnI和XhoI對構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,pBind-PPARs-LBD鑒定結(jié)果見圖3,顯示的電泳條帶位置與核酸相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker比較,發(fā)現(xiàn)在1 000 bp左右有與目的相對分子質(zhì)量大?。?63 bp)位置相當(dāng)?shù)臈l帶,酶切產(chǎn)物的另一條特異帶在5 000~7 000 bp,應(yīng)為載體的一部分,重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切電泳驗(yàn)證后送廈門欣基生物科技有限公司進(jìn)行測序鑒定,測序結(jié)果通過NCBI Blast比對,詢問序列和目標(biāo)序列完全匹配,同源性100%,表明表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,可用于下一步的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和報(bào)告基因的檢測。

    2.2 pGL4.35報(bào)告質(zhì)粒

    pGL4.35質(zhì)粒結(jié)構(gòu)見圖2,質(zhì)粒購買自美國普洛麥格(Promega)公司。

    2.3 PPARs表達(dá)質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染及其表達(dá)驗(yàn)證

    2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 293T細(xì)胞在37 ℃,5% CO2,飽和濕度的培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),每3~4 d以0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

    2.3.2 PPARs質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞及其載體表達(dá)檢測 ①接種細(xì)胞,轉(zhuǎn)染前5~8 h將293T細(xì)胞以每孔細(xì)胞密度1×104個(gè)/mL接種至6孔板中,每孔2 mL,培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)70%~90%取出;②將4 μg的pBind-PPARs-LBD質(zhì)粒和2 μg的pGL4.35報(bào)告質(zhì)粒加至150 μL的無血清DMEM培養(yǎng)基中,并向其中加入6 μL的PLUSTM Reagent混勻。PLUSTM Reagent與DNA的比例為1∶1(L∶g);③將15 μL的Lipofectamine LTXReagent加至另外150 μL的無血清DMEM培養(yǎng)基中,輕輕混勻,Lipofectamine LTXReagent與DNA的比例為2.5∶1(L∶g);④將②DNA懸液和③Lipofectamine LTXReagent懸液混合,總體積300 μL,輕輕混勻,室溫靜置5 min;⑤將④DNA和Lipofectamine LTXReagent混合液加至6孔板中,前后左右晃動(dòng)孔板混勻,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),由于是帶血清轉(zhuǎn)染,中途無需對細(xì)胞進(jìn)行換液;⑥轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后,0.25%胰酶消化細(xì)胞,然后鋪24孔板,6孔板一個(gè)孔的細(xì)胞鋪一個(gè)24孔板,每孔500 μL培養(yǎng)基,此時(shí)同時(shí)加入藥物,前后左右晃動(dòng)孔板混勻,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

    通過Realtime PCR和Western blot法檢測細(xì)胞PPARs-LBD的表達(dá)。Realtime PCR檢測PPARs-LBD mRNA的表達(dá)結(jié)果見圖4,與空白對照相比,重組質(zhì)粒pBind-PPARs-LBD轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞PPARs-LBD具有明顯的表達(dá)。Western blot結(jié)果見圖5,表明獲得目的條帶,含有重組質(zhì)粒pBind-PPARs-LBD和報(bào)告基因pGL4.35的293T細(xì)胞PPARs-LBD蛋白有明顯的表達(dá),說明構(gòu)建的PPARs表達(dá)質(zhì)??梢栽诩?xì)胞中正常表達(dá),可以用于進(jìn)一步的表達(dá)篩選檢測。

    2.4 澤瀉PPARs活性成分篩選

    2.4.1 藥物配制 澤瀉單體化合物1~14、澤瀉三萜提取物(15)和陽性藥物(非諾貝特、L165041和羅格列酮)分別以DMSO為溶劑配制成一定濃度的母液,保存于-20 ℃的冰箱中,使用前用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成需要的濃度[澤瀉化合物1~14質(zhì)量濃度均為10 mg·L-1,澤瀉三萜提取物(15)質(zhì)量濃度為50 mg·L-1,陽性藥物質(zhì)量濃度均為0.5 mg·L-1],保證96孔板中每孔DMSO的含量小于0.1%。

    2.4.2 MTT法評價(jià)給藥濃度安全性 以每孔細(xì)胞密度1×104個(gè)/mL接種293T細(xì)胞到96孔板,待細(xì)胞融合率達(dá)70%~90%時(shí),分別加入用培養(yǎng)基配制的澤瀉單體化合物(1~14)、澤瀉三萜提取物(15)及陽性藥物(0.5 mg·L-1)干預(yù)24 h(加入的藥物均控制每孔DMSO含量<0.1%),避光條件下,每孔加入0.5 g·mL-1MTT的PBS溶液,使MTT終濃度達(dá)0.5 g·L-1,37 ℃孵育4 h,棄去培養(yǎng)液,每孔加入100 μL DMSO,低速振蕩10 min,在酶標(biāo)儀490 nm波長處測定其吸光度,計(jì)算細(xì)胞活力,結(jié)果表明受試藥物在實(shí)驗(yàn)相應(yīng)濃度下對細(xì)胞增殖無影響。

    2.4.3 加藥 轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后,0.25%胰酶消化細(xì)胞,然后鋪24孔板,6孔板一個(gè)孔的細(xì)胞鋪一個(gè)24孔板,每孔500 μL培養(yǎng)基,澤瀉化合物1~14加藥質(zhì)量濃度均為10 mg·L-1,澤瀉三萜提取物(15)加藥質(zhì)量濃度為50 mg·L-1,陽性藥物加藥質(zhì)量濃度均為0.5 mg·L-1,加藥后前后左右晃動(dòng)孔板混勻,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

    2.4.4 熒光素酶活性的檢測 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,拿出培養(yǎng)箱,棄去培養(yǎng)基,每孔細(xì)胞用1 mL 1× PBS緩沖液洗一遍,吸盡PBS緩沖液,每孔加入100 μL1×passive Lysis buffer,室溫?fù)u床晃動(dòng)裂解15 min,將裂解液轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中,12 000 r·min-1,4 ℃離心5 min,使用GloMax 20/20單管光度計(jì)測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的表達(dá):a.取10 μL裂解液置于Axygen的EP管中,向其中加入10 μL的LARII(Firefly),測定螢火蟲熒光;b.測定完成后,再向其中加入10 μL 1×Stop &Glo Reagent測定海腎熒光(Renilla)。記錄不同實(shí)驗(yàn)組firefly熒光素酶表達(dá)量對renilla熒光素酶表達(dá)量的比值,然后將各藥物處理組的值對陰性對照孔的值進(jìn)行歸一化處理,拿得到的新的比值進(jìn)行作圖統(tǒng)計(jì)。

    澤瀉受試藥物5,6,7,8,13,14,15能激活PPARα,受試藥物5,7,15能激活PPARβ,受試藥物6,7,8,12,15能激活PPARγ,其中化合物12對PPARγ激活能力最顯著,見圖6。

    3 討論

    PPAR篩選模型的構(gòu)建已有文獻(xiàn)[7,13-14]報(bào)道,多數(shù)文獻(xiàn)構(gòu)建了其中1種或者2種,主要篩選集中于PPARγ和PPARα[5],并且用于評價(jià)降脂降糖候選活性成分。近年來,隨著PPARβ研究的深入,發(fā)現(xiàn)其與糖脂紊亂和心血管疾病也存在密切聯(lián)系,也是降脂降糖功效靶點(diǎn)之一[15],因此,在前人研究的基礎(chǔ)上,通過將能被PPARα,PPARβ或PPARγ配體激活并誘導(dǎo)熒光素酶基因表達(dá)的重組質(zhì)粒(pBind-PPARα/β/γ-LBD),分別轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中,并分別以PPARs特異性或選擇性激動(dòng)劑(非諾貝特,L165041,羅格列酮)作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),構(gòu)建相應(yīng)的模型,研究澤瀉中15種活性成分對PPARα/β/γ是否具有激活作用。

    同時(shí),本研究PPARs激活作用的檢測采用雙熒光檢測法,pBIND質(zhì)粒是一種包含了酵母Gal4的DNA結(jié)合區(qū)(Gal4-DBD)和糖皮質(zhì)受體配體結(jié)合區(qū)(GR-LBD)的載體,當(dāng)其被配體激活時(shí),可誘導(dǎo)包含有Gal4上游激活序列的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本研究正是利用此機(jī)制,在GR-LBD區(qū)構(gòu)建一種帶有PPARα/β/γ-LBD的嵌合性質(zhì)粒,這種質(zhì)粒是由酵母的反作用子Gal4-DBD(DNA結(jié)合區(qū))和PPARα/β/γ-LBD(配體結(jié)合區(qū))組成,選擇的報(bào)告基因則是含有Gal4的特異性相應(yīng)原件的并帶有螢火蟲酶素基因(Firefly)的質(zhì)粒,pGL4.35為pBIND的配套報(bào)告基因。當(dāng)PPARα/β/γ-LBD被測試藥物激活后,就能誘導(dǎo)報(bào)告基因pGL4.35表達(dá)并產(chǎn)生熒光酶素,通過測定熒光酶素表達(dá)含量的高低,來確定測試藥物對PPARs的激活能力。其中renilla熒光素酶和PPARs-LBD在同一個(gè)載體上表達(dá),renilla熒光素酶的表達(dá)作為內(nèi)對照反映目標(biāo)基因PPARs-LBD的表達(dá),用來排除Firefly熒光素酶表達(dá)量高不是因?yàn)檗D(zhuǎn)染了更多的PPARs-LBD表達(dá)質(zhì)粒造成,因此將各藥物處理組的firefly與renilla比值(熒光素酶活性)對陰性對照孔的firefly與renilla比值進(jìn)行歸一化處理,將得到的新的比值進(jìn)行活性統(tǒng)計(jì)[14]

    在本研究中,首先根據(jù)重組質(zhì)粒pBind-PPARs-LBD及報(bào)告質(zhì)粒pGL4.35的鑒定結(jié)果對其進(jìn)行驗(yàn)證,鑒定結(jié)果為陽性,則采用該功能質(zhì)粒和報(bào)告基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。之后,通過Realtime PCR和Western Blot檢測細(xì)胞模型PPARs-LBD的表達(dá),結(jié)果表明重組質(zhì)粒pBind-PPARs-LBD轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞PPARs-LBD有明顯的表達(dá),確定細(xì)胞篩選模型構(gòu)建成功。另外,通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測14種澤瀉活性成分及3種陽性藥物在一定濃度下均沒有明顯抑制293T細(xì)胞的增殖。最后,通過檢測藥物處理后細(xì)胞篩選模型的熒光素酶活力來測定澤瀉中分離制備的化合物對PPARs的激活作用。

    澤瀉PPARs活性篩選初步結(jié)果表明,化合物5,6,7,8,13,14能激活PPARα,構(gòu)效分析可知激活PPARα的活性成分均具有的C16位的氧化取代,同時(shí)C11位羥基取代骨架結(jié)構(gòu);化合物5,7能激活PPARβ,兩者均為無乙酰基取代而具有C16位的氧化取代及同時(shí)C11位羥基取代的骨架結(jié)構(gòu);化合物6,7,8,12能激活PPARγ,其中化合物12對PPARγ激活能力最為顯著,可能與其獨(dú)特的13,17環(huán)氧取代有關(guān),并通過進(jìn)一步配制系列不同質(zhì)量濃度(1,2.5,5,7.5,10,15 mg·L-1)分別檢測其激活PPARγ活力,計(jì)算EC50為(6.94±0.84)mg·L-1 [陽性藥羅格列酮EC50為(0.32±0.08) mg·L-1]。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)澤瀉三萜提取物(15)具有同時(shí)激活PPARα,PPARβ和PPARγ的活性,Rau O等[7]研究表明澤瀉乙醇提取物具有同時(shí)激活PPARα,PPARβ和PPARγ的活性,與澤瀉總?cè)铺崛∥铮?5)篩選的結(jié)果一致,說明三萜類化合物可能是澤瀉PPARs活性的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。另外,本研究也發(fā)現(xiàn),當(dāng)澤瀉提取物給藥濃度較高時(shí)(≥75 mg·L-1)出現(xiàn)PPARs活性較為明顯的下降,未能呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系,可能與其產(chǎn)生的細(xì)胞抑制作用有關(guān)。

    4 結(jié)論

    本研究在配受體水平上,成功構(gòu)建含有PPARs-LBD的功能質(zhì)粒,將澤瀉中分離制備的14種化合物直接與PPARs受體作用,只有當(dāng)PPARs被激活時(shí),熒光蛋白酶才能有效的表達(dá)并被檢測,從而研究待測成分是否具有PPARs活性。采用該研究思路和方法,在細(xì)胞水平上成功建立一種以PPARα/β/γ為靶點(diǎn)的體外篩選細(xì)胞模型,以陽性藥物為對照,從澤瀉中的15種受試藥物篩選出PPARα,PPARβ或PPARγ的天然激動(dòng)劑。

    [致謝]中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所顏立沖博士對本課題研究中質(zhì)粒構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等工作提供了協(xié)助和指導(dǎo)。

    [參考文獻(xiàn)]

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    [責(zé)任編輯 陳玲]

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