• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    PPARs激動(dòng)劑體外篩選模型的建立及其在澤瀉活性成分篩選中的應(yīng)用

    2017-02-16 14:05:35李小艷王小花黃小強(qiáng)吳婷婷許文
    中國中藥雜志 2016年21期
    關(guān)鍵詞:三萜澤瀉孔板

    李小艷+王小花+黃小強(qiáng)+吳婷婷+許文+吳水生

    [摘要]利用酵母GAL4 BD-UAS反式激活分析(transactivation assay)系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中建立以過氧化物酶體增殖物受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PPARs-LBD,包括PPARα,PPARβ和PPARγ)為靶點(diǎn)的體外篩選模型,并應(yīng)用該模型對澤瀉化學(xué)成分進(jìn)行篩選,研究澤瀉14種化學(xué)成分對PPARs的激活作用。首先構(gòu)建GAL4 BD-PPARsLBD融合表達(dá)質(zhì)粒pBind-PPARs-LBD,采用Lipofectamine將表達(dá)質(zhì)粒pBind-PPARs-LBD與含有UAS:luciferase報(bào)告質(zhì)粒pGL4.35共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。以PPARs的激動(dòng)劑(PPARα:非諾貝特;PPARβ:L165041;PPARγ:羅格列酮)為陽性對照,通過測定螢火蟲熒光素酶活性來驗(yàn)證系統(tǒng)是否構(gòu)建成功,并用該系統(tǒng)來考察澤瀉中14種化學(xué)成分對PPARs靶點(diǎn)激活的影響。PPARs的陽性激動(dòng)劑結(jié)果顯示系統(tǒng)構(gòu)建成功,用該系統(tǒng)分析澤瀉化學(xué)成分結(jié)果顯示澤瀉單體化合物5,6,7,8,13,14對PPARα有激活作用,化合物5,7對PPARβ有激活作用,而化合物6,7,8,12對PPARγ有激活作用,其中化合物12對PPARγ有顯著激活能力。該研究在哺乳動(dòng)物293T細(xì)胞中成功構(gòu)建以PPARα/β/γ配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榘悬c(diǎn)的體外篩選細(xì)胞模型,并成功應(yīng)用于澤瀉PPARα/β/γ的天然激動(dòng)劑的篩選。

    [關(guān)鍵詞]過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs); 激動(dòng)劑; 澤瀉; 三萜成分

    [Abstract]Peroxisome proliferators activated receptors (PPARs) are closely related to human chronic disease, such as diabetes mellitus and the other metabolic diseases. In this study, a cell-based PPARs (PPARα/β/γ) model was developed for the screening of PPARs agonists from Alismatis Rhizoma (AR). Firstly, 293T cells were transfected with the reconstructed plasmid pBind-PPAR (α,β, orγ)-LBD and reporter gene pGL4.35, and the known PPARs agonists were used as the positive control (fenofibrate for PPARα, L165041 for PPARβ, and rosiglitazone for PPARγ). The ability of activation for PPARs was evaluated by analyzing the expression value of luciferase. Afterward, the 14 pure triterpenoids isolate from AR were analyzed on the developed PPARα, PPARβ and

    PPARγ screening assay method. The results showed that the compounds 5, 6, 7, 8, 13 and 14 from AR have the ability of activation for PPARα. The compounds 5 and 7 from AR have the ability of activation for PPARβ. The compounds 6, 7, 8 and 12 from RA have the ability of activation for PPARγ.In this study, the compound 12 from AR were found to display significant activation on PPARγ for the first time. AR triterpenoids extracts had the ability of activation for PPARα, PPARβ and PPARγ. The results suggested that triterpenoids extracts from AR were PPARα, PPARβ and PPARγ agonists. The results will help to provide reference for clinical application of AR, and establish a model for PPARs on 293T cell, which can be used to screen and evaluate PPARs natural agonists.

    [Key words]peroxisome proliferator-activated receptors; agonist; Alismatis Rhizoma; active triterpenoids ingredients

    doi:10.4268/cjcmm20162121

    過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是核激素受體超家族中的配體激活轉(zhuǎn)錄因子,參與許多與慢性疾病密切相關(guān)的臨床生理和病理過程,成為代謝疾病(2型糖尿病、高血脂、心血管疾病等)治療的重要靶點(diǎn)[1]。其作用機(jī)制是PPAR與類維甲酸受體(RXR)形成異源二聚體,再與靶基因啟動(dòng)子上的PPRE序列結(jié)合,之后通過配體的激活誘導(dǎo)輔阻遏物蛋白的分離和輔激活物的募集,形成PPAR活化復(fù)合物,導(dǎo)致糖脂代謝、脂質(zhì)平衡、脂肪細(xì)胞分化的基因表達(dá)發(fā)生改變[2]。PPARs具有多種生物學(xué)效應(yīng),調(diào)控著大量涉及調(diào)節(jié)糖脂中間代謝、內(nèi)穩(wěn)態(tài)、脂肪細(xì)胞分化、胰島素敏感、免疫應(yīng)答、細(xì)胞增長和變異的基因表達(dá),是調(diào)整糖脂代謝綜合征有效的治療方法,如降脂藥貝特類藥物及降糖藥TZDs類藥物[3],但是這些合成藥物如TZDs常常會導(dǎo)致病患體增重、水腫,并增加罹患心肌梗塞的風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)還會產(chǎn)生肝毒性;而貝特類降脂藥會增加患膽結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn),引起肌肉衰竭等[4],從中藥中尋找活性更佳,副作用更小的PPARs激動(dòng)劑已成為當(dāng)今制藥研究的熱點(diǎn)和PPARs藥物研發(fā)的主要研究趨勢[5]

    澤瀉Alisma orientale(Sam.) Juzep作為一味傳統(tǒng)中藥,表現(xiàn)出多方面的藥理學(xué)活性,包括利尿、神經(jīng)保護(hù)、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血糖、抗炎、抗腫瘤和抗氧化活性[6],成為許多傳統(tǒng)中醫(yī)藥配方不可或缺的部分。已有文獻(xiàn)表明澤瀉提取物是PPARs的多重激動(dòng)劑[7],但是具體的活性成分尚未闡明,因此,本研究建立PPARs激動(dòng)劑體外篩選模型并應(yīng)用澤瀉PPARs相關(guān)活性成分的篩選,為澤瀉降脂降糖作用機(jī)制提供參考,也為具有潛在PPARs活性的天然藥物活性成分篩選提供一種高通量模型。

    1 材料

    BCD-248冰箱(中國Haier公司);SW-CJ-1FD型超凈工作臺(蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司);Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司);HERACELL 150i型CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);DK-8D電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);CPA225D 1/10萬分析天平(德國Sartorius公司);臺式pH計(jì)(美國METTLER TOLEDO公司);TDL-50B臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);低溫高速臺式離心機(jī),移液槍(德國Eppendorf公司);RNA逆轉(zhuǎn)錄儀,ABi 7900 Quantitative real-time PCR儀(美國ABi公司);小型垂直電泳槽,小型轉(zhuǎn)印槽,基礎(chǔ)電泳儀電源及凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);Leica DMIL LED倒置顯微鏡(德國徠卡儀器公司);FLUO STAR Omega多功能熒光酶標(biāo)儀(德國BMG LABTECH公司);GloMax 20/20單管光度計(jì)(美國Promega公司);6孔培養(yǎng)板,24孔板,96孔板,培養(yǎng)瓶(美國Corning Costar公司)。

    人胚胎腎細(xì)胞株293T,人宮頸癌細(xì)胞株HeLa和人肝癌細(xì)胞株HuH7(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫,由本實(shí)驗(yàn)室保存);pBind,pGL4.35質(zhì)粒(廈門欣基生物科技有限公司);大腸桿菌DH5α菌株(由本實(shí)驗(yàn)室保存)。

    DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清,雙抗(PS)青鏈霉素混合液,胰蛋白酶,PBS緩沖液,磷酸鹽緩沖液(美國Hyclone公司);TRizol試劑,DEPC-H2O,Lipofectamine LTX and Plus Reagent 15338-100(美國Invotrogen公司);DNA聚合酶,限制性內(nèi)切酶,DNA連接酶(大連寶生物工程有限公司);cDNA合成試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Kit,熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ,RT-PCR試劑盒Accu Power 2× Greenstarq PCR Master Mix,DNA純化試劑盒QIA quick PCR purification Kit(日本Takara公司);質(zhì)粒提取試劑盒,瓊脂糖,雙熒光素酶檢測試劑盒Dual-Luciferase Reporter Assay System E1910(美國Promega公司);AMP(美國Amresco公司);DMSO, MTT(美國Sigma公司);SDS-PAGE凝膠配制試劑盒,超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒,Western及IP細(xì)胞裂解液,彩色預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),TBSSDS-PAGE電泳液,Western轉(zhuǎn)膜液,Western封閉液,Western一抗稀釋液,Western二抗稀釋液(碧云天);鼠抗β-actin,兔抗多克隆PPARα(H-98)抗體sc-9000,兔抗多克隆PPARβ(H-74)抗體sc-7197,兔抗多克隆PPARγ(H-100)抗體sc-7196(Santa Cruz Biotechnology公司);其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

    澤瀉化合物1~14,分別為澤瀉醇A(1)、24-乙酰澤瀉醇A(2)、澤瀉醇B(3)、23-乙酰澤瀉醇B(4)、澤瀉醇C(5)、23-乙酰澤瀉醇C(6)、澤瀉醇F(7)、24-乙酰澤瀉醇F(8)、澤瀉醇G(9)、澤瀉醇L(10)、11-去氧澤瀉醇B(11)、13,17-環(huán)氧-24-乙酰澤瀉醇A(12)、16-羰基澤瀉醇A(13)、16-羰基-24-乙酰澤瀉醇A(14)及澤瀉三萜提取物(15)(均由本實(shí)驗(yàn)室分離制備[8-11],其中三萜提取物按照前期研究工藝對澤瀉總?cè)撇课贿M(jìn)行富集純化后所得的部位[12]),化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1;羅格列酮、非諾貝特及L165041(美國Sigma公司)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 pBind-PPARs-LBD表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

    本實(shí)驗(yàn)選擇使用pBind(含有酵母GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域且?guī)в蠪lag標(biāo)簽)質(zhì)粒作為載體[12],結(jié)構(gòu)見圖2。采用Trizol法提取293T,HeLa和HuH7細(xì)胞總混合RNA,利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PPARs PCR引物,見表1,通過RT-PCR從293T,HeLa和HuH7細(xì)胞RNA克隆PPARα-LBD cDNA,PPARβ-LBD cDNA和PPARγ-LBD cDNA序列,PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳,膠回收目的條帶,將載體pBind和目的基因PPARs-LBD PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切,回收、純化酶切產(chǎn)物,再將PPARs-LBD連接至pBind Gal-DBD形成新的功能質(zhì)粒pBind-PPARs-LBD,并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)大腸桿菌中,挑取單克隆,菌落PCR驗(yàn)證后用LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)菌落,按照Promega質(zhì)粒提取試劑盒操作抽提重組質(zhì)粒陽性克隆,參考PPARs-LBD和pBind的序列,采用KpnI和XhoI對構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,pBind-PPARs-LBD鑒定結(jié)果見圖3,顯示的電泳條帶位置與核酸相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker比較,發(fā)現(xiàn)在1 000 bp左右有與目的相對分子質(zhì)量大?。?63 bp)位置相當(dāng)?shù)臈l帶,酶切產(chǎn)物的另一條特異帶在5 000~7 000 bp,應(yīng)為載體的一部分,重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切電泳驗(yàn)證后送廈門欣基生物科技有限公司進(jìn)行測序鑒定,測序結(jié)果通過NCBI Blast比對,詢問序列和目標(biāo)序列完全匹配,同源性100%,表明表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,可用于下一步的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和報(bào)告基因的檢測。

    2.2 pGL4.35報(bào)告質(zhì)粒

    pGL4.35質(zhì)粒結(jié)構(gòu)見圖2,質(zhì)粒購買自美國普洛麥格(Promega)公司。

    2.3 PPARs表達(dá)質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染及其表達(dá)驗(yàn)證

    2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 293T細(xì)胞在37 ℃,5% CO2,飽和濕度的培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),每3~4 d以0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

    2.3.2 PPARs質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞及其載體表達(dá)檢測 ①接種細(xì)胞,轉(zhuǎn)染前5~8 h將293T細(xì)胞以每孔細(xì)胞密度1×104個(gè)/mL接種至6孔板中,每孔2 mL,培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)70%~90%取出;②將4 μg的pBind-PPARs-LBD質(zhì)粒和2 μg的pGL4.35報(bào)告質(zhì)粒加至150 μL的無血清DMEM培養(yǎng)基中,并向其中加入6 μL的PLUSTM Reagent混勻。PLUSTM Reagent與DNA的比例為1∶1(L∶g);③將15 μL的Lipofectamine LTXReagent加至另外150 μL的無血清DMEM培養(yǎng)基中,輕輕混勻,Lipofectamine LTXReagent與DNA的比例為2.5∶1(L∶g);④將②DNA懸液和③Lipofectamine LTXReagent懸液混合,總體積300 μL,輕輕混勻,室溫靜置5 min;⑤將④DNA和Lipofectamine LTXReagent混合液加至6孔板中,前后左右晃動(dòng)孔板混勻,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),由于是帶血清轉(zhuǎn)染,中途無需對細(xì)胞進(jìn)行換液;⑥轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后,0.25%胰酶消化細(xì)胞,然后鋪24孔板,6孔板一個(gè)孔的細(xì)胞鋪一個(gè)24孔板,每孔500 μL培養(yǎng)基,此時(shí)同時(shí)加入藥物,前后左右晃動(dòng)孔板混勻,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

    通過Realtime PCR和Western blot法檢測細(xì)胞PPARs-LBD的表達(dá)。Realtime PCR檢測PPARs-LBD mRNA的表達(dá)結(jié)果見圖4,與空白對照相比,重組質(zhì)粒pBind-PPARs-LBD轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞PPARs-LBD具有明顯的表達(dá)。Western blot結(jié)果見圖5,表明獲得目的條帶,含有重組質(zhì)粒pBind-PPARs-LBD和報(bào)告基因pGL4.35的293T細(xì)胞PPARs-LBD蛋白有明顯的表達(dá),說明構(gòu)建的PPARs表達(dá)質(zhì)??梢栽诩?xì)胞中正常表達(dá),可以用于進(jìn)一步的表達(dá)篩選檢測。

    2.4 澤瀉PPARs活性成分篩選

    2.4.1 藥物配制 澤瀉單體化合物1~14、澤瀉三萜提取物(15)和陽性藥物(非諾貝特、L165041和羅格列酮)分別以DMSO為溶劑配制成一定濃度的母液,保存于-20 ℃的冰箱中,使用前用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成需要的濃度[澤瀉化合物1~14質(zhì)量濃度均為10 mg·L-1,澤瀉三萜提取物(15)質(zhì)量濃度為50 mg·L-1,陽性藥物質(zhì)量濃度均為0.5 mg·L-1],保證96孔板中每孔DMSO的含量小于0.1%。

    2.4.2 MTT法評價(jià)給藥濃度安全性 以每孔細(xì)胞密度1×104個(gè)/mL接種293T細(xì)胞到96孔板,待細(xì)胞融合率達(dá)70%~90%時(shí),分別加入用培養(yǎng)基配制的澤瀉單體化合物(1~14)、澤瀉三萜提取物(15)及陽性藥物(0.5 mg·L-1)干預(yù)24 h(加入的藥物均控制每孔DMSO含量<0.1%),避光條件下,每孔加入0.5 g·mL-1MTT的PBS溶液,使MTT終濃度達(dá)0.5 g·L-1,37 ℃孵育4 h,棄去培養(yǎng)液,每孔加入100 μL DMSO,低速振蕩10 min,在酶標(biāo)儀490 nm波長處測定其吸光度,計(jì)算細(xì)胞活力,結(jié)果表明受試藥物在實(shí)驗(yàn)相應(yīng)濃度下對細(xì)胞增殖無影響。

    2.4.3 加藥 轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后,0.25%胰酶消化細(xì)胞,然后鋪24孔板,6孔板一個(gè)孔的細(xì)胞鋪一個(gè)24孔板,每孔500 μL培養(yǎng)基,澤瀉化合物1~14加藥質(zhì)量濃度均為10 mg·L-1,澤瀉三萜提取物(15)加藥質(zhì)量濃度為50 mg·L-1,陽性藥物加藥質(zhì)量濃度均為0.5 mg·L-1,加藥后前后左右晃動(dòng)孔板混勻,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

    2.4.4 熒光素酶活性的檢測 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,拿出培養(yǎng)箱,棄去培養(yǎng)基,每孔細(xì)胞用1 mL 1× PBS緩沖液洗一遍,吸盡PBS緩沖液,每孔加入100 μL1×passive Lysis buffer,室溫?fù)u床晃動(dòng)裂解15 min,將裂解液轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中,12 000 r·min-1,4 ℃離心5 min,使用GloMax 20/20單管光度計(jì)測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的表達(dá):a.取10 μL裂解液置于Axygen的EP管中,向其中加入10 μL的LARII(Firefly),測定螢火蟲熒光;b.測定完成后,再向其中加入10 μL 1×Stop &Glo Reagent測定海腎熒光(Renilla)。記錄不同實(shí)驗(yàn)組firefly熒光素酶表達(dá)量對renilla熒光素酶表達(dá)量的比值,然后將各藥物處理組的值對陰性對照孔的值進(jìn)行歸一化處理,拿得到的新的比值進(jìn)行作圖統(tǒng)計(jì)。

    澤瀉受試藥物5,6,7,8,13,14,15能激活PPARα,受試藥物5,7,15能激活PPARβ,受試藥物6,7,8,12,15能激活PPARγ,其中化合物12對PPARγ激活能力最顯著,見圖6。

    3 討論

    PPAR篩選模型的構(gòu)建已有文獻(xiàn)[7,13-14]報(bào)道,多數(shù)文獻(xiàn)構(gòu)建了其中1種或者2種,主要篩選集中于PPARγ和PPARα[5],并且用于評價(jià)降脂降糖候選活性成分。近年來,隨著PPARβ研究的深入,發(fā)現(xiàn)其與糖脂紊亂和心血管疾病也存在密切聯(lián)系,也是降脂降糖功效靶點(diǎn)之一[15],因此,在前人研究的基礎(chǔ)上,通過將能被PPARα,PPARβ或PPARγ配體激活并誘導(dǎo)熒光素酶基因表達(dá)的重組質(zhì)粒(pBind-PPARα/β/γ-LBD),分別轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中,并分別以PPARs特異性或選擇性激動(dòng)劑(非諾貝特,L165041,羅格列酮)作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),構(gòu)建相應(yīng)的模型,研究澤瀉中15種活性成分對PPARα/β/γ是否具有激活作用。

    同時(shí),本研究PPARs激活作用的檢測采用雙熒光檢測法,pBIND質(zhì)粒是一種包含了酵母Gal4的DNA結(jié)合區(qū)(Gal4-DBD)和糖皮質(zhì)受體配體結(jié)合區(qū)(GR-LBD)的載體,當(dāng)其被配體激活時(shí),可誘導(dǎo)包含有Gal4上游激活序列的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本研究正是利用此機(jī)制,在GR-LBD區(qū)構(gòu)建一種帶有PPARα/β/γ-LBD的嵌合性質(zhì)粒,這種質(zhì)粒是由酵母的反作用子Gal4-DBD(DNA結(jié)合區(qū))和PPARα/β/γ-LBD(配體結(jié)合區(qū))組成,選擇的報(bào)告基因則是含有Gal4的特異性相應(yīng)原件的并帶有螢火蟲酶素基因(Firefly)的質(zhì)粒,pGL4.35為pBIND的配套報(bào)告基因。當(dāng)PPARα/β/γ-LBD被測試藥物激活后,就能誘導(dǎo)報(bào)告基因pGL4.35表達(dá)并產(chǎn)生熒光酶素,通過測定熒光酶素表達(dá)含量的高低,來確定測試藥物對PPARs的激活能力。其中renilla熒光素酶和PPARs-LBD在同一個(gè)載體上表達(dá),renilla熒光素酶的表達(dá)作為內(nèi)對照反映目標(biāo)基因PPARs-LBD的表達(dá),用來排除Firefly熒光素酶表達(dá)量高不是因?yàn)檗D(zhuǎn)染了更多的PPARs-LBD表達(dá)質(zhì)粒造成,因此將各藥物處理組的firefly與renilla比值(熒光素酶活性)對陰性對照孔的firefly與renilla比值進(jìn)行歸一化處理,將得到的新的比值進(jìn)行活性統(tǒng)計(jì)[14]

    在本研究中,首先根據(jù)重組質(zhì)粒pBind-PPARs-LBD及報(bào)告質(zhì)粒pGL4.35的鑒定結(jié)果對其進(jìn)行驗(yàn)證,鑒定結(jié)果為陽性,則采用該功能質(zhì)粒和報(bào)告基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。之后,通過Realtime PCR和Western Blot檢測細(xì)胞模型PPARs-LBD的表達(dá),結(jié)果表明重組質(zhì)粒pBind-PPARs-LBD轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞PPARs-LBD有明顯的表達(dá),確定細(xì)胞篩選模型構(gòu)建成功。另外,通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測14種澤瀉活性成分及3種陽性藥物在一定濃度下均沒有明顯抑制293T細(xì)胞的增殖。最后,通過檢測藥物處理后細(xì)胞篩選模型的熒光素酶活力來測定澤瀉中分離制備的化合物對PPARs的激活作用。

    澤瀉PPARs活性篩選初步結(jié)果表明,化合物5,6,7,8,13,14能激活PPARα,構(gòu)效分析可知激活PPARα的活性成分均具有的C16位的氧化取代,同時(shí)C11位羥基取代骨架結(jié)構(gòu);化合物5,7能激活PPARβ,兩者均為無乙酰基取代而具有C16位的氧化取代及同時(shí)C11位羥基取代的骨架結(jié)構(gòu);化合物6,7,8,12能激活PPARγ,其中化合物12對PPARγ激活能力最為顯著,可能與其獨(dú)特的13,17環(huán)氧取代有關(guān),并通過進(jìn)一步配制系列不同質(zhì)量濃度(1,2.5,5,7.5,10,15 mg·L-1)分別檢測其激活PPARγ活力,計(jì)算EC50為(6.94±0.84)mg·L-1 [陽性藥羅格列酮EC50為(0.32±0.08) mg·L-1]。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)澤瀉三萜提取物(15)具有同時(shí)激活PPARα,PPARβ和PPARγ的活性,Rau O等[7]研究表明澤瀉乙醇提取物具有同時(shí)激活PPARα,PPARβ和PPARγ的活性,與澤瀉總?cè)铺崛∥铮?5)篩選的結(jié)果一致,說明三萜類化合物可能是澤瀉PPARs活性的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。另外,本研究也發(fā)現(xiàn),當(dāng)澤瀉提取物給藥濃度較高時(shí)(≥75 mg·L-1)出現(xiàn)PPARs活性較為明顯的下降,未能呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系,可能與其產(chǎn)生的細(xì)胞抑制作用有關(guān)。

    4 結(jié)論

    本研究在配受體水平上,成功構(gòu)建含有PPARs-LBD的功能質(zhì)粒,將澤瀉中分離制備的14種化合物直接與PPARs受體作用,只有當(dāng)PPARs被激活時(shí),熒光蛋白酶才能有效的表達(dá)并被檢測,從而研究待測成分是否具有PPARs活性。采用該研究思路和方法,在細(xì)胞水平上成功建立一種以PPARα/β/γ為靶點(diǎn)的體外篩選細(xì)胞模型,以陽性藥物為對照,從澤瀉中的15種受試藥物篩選出PPARα,PPARβ或PPARγ的天然激動(dòng)劑。

    [致謝]中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所顏立沖博士對本課題研究中質(zhì)粒構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等工作提供了協(xié)助和指導(dǎo)。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1]Francisco A Monsalve, Radha D Pyarasani, Fernando Delgado-Lopez, et al. Peroxisome proliferator-activatedreceptor targets for the treatment of metabolic diseases[J].Mediators Inflamm, 2013, 2013(4):287.

    [2]Bogna Grygiel-Górniak. Peroxisome proliferator-activated receptors and their ligands: nutritional and clinical implications——a review[J]. Nutr J, 2014, 13: 17.

    [3]Daisuke Usuda, Tsugiyasu Kanda. Peroxisome proliferator-activated receptors for hypertension [J].World J Cardiol, 2014, 6(8): 744.

    [4]Gao D, Zhang Y, Yang F,et al.In vitro screening and evaluation of 37 traditional Chinese medicines for their potential to activate peroxisome proliferator-activated receptors-γ[J]. Pharmacogn Mag, 2016, 12(46):120.

    [5]姜慧潔,張曉靜,張慧,等.基于PPARs靶標(biāo)改善胰島素抵抗的中藥活性成分研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志,2015,40(22):4355.

    [6]Tian T, Chen H, Zhao Y Y. Traditional uses, phytochemistry, pharmacology, toxicology and quality control of Alisma orientale(Sam.) Juzep: a review [J]. J Ethnopharmacol, 2014, 158: 373.

    [7]Rau O, Wurglics M, Dingermann T, et al. Screening of herbal extracts for activation of the human peroxisome proliferator-activated receptor [J]. Pharmazie, 2006, 61: 952.

    [8]Xu W, Li T, Qiu J F, et al.Anti-proliferative activities of terpenoids isolated fromAlisma orientalis and their structure-activity relationships [J].Anticancer Agents Med Chem, 2015, 15(2):228.

    [9]許文,羅奮熔,趙萬里,等.澤瀉降糖活性提取物化學(xué)成分研究[J].中草藥,2014, 45(22):3238.

    [10]許文,徐明濤,趙萬里,等.澤瀉提取物三萜類成分含量測定研究[J].藥物分析雜志,2015,35(2):210.

    [11]Zhao W L, Huang X Q, Li X Y, et al. Qualitative and quantitative analysis of major triterpenoids in Alismatis Rhizoma by high performance liquid chromatography/diode-array detector/quadrupole-time-of-flight mass spectrometry and ultra-performance liquid chromatography/triple quadrupole mass spectrometry[J]. Molecules, 2015, 20: 13958.

    [12]羅奮熔,丘建芳,許文,等.澤瀉總?cè)铺崛〖兓に嚨膶?shí)驗(yàn)室試驗(yàn)及中試驗(yàn)證[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2014,45(8):729.

    [13]Xia Zhining, Lin Yexin, Guo Lixia, et al. Development of a cell-based high-throughput peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) screening model and its application for evaluation of the extracts from Rhizoma Coptis [J].J Asian Nat Prod Res, 2013,15(3):225.

    [14]環(huán)奕,彭軍,王悅,等.非激動(dòng)劑PPARγ配體的篩選方法建立和應(yīng)用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2014, 49(12):1658.

    [15]Vázquez-Carrera M. Unraveling the effects of PPARβ/δ on insulin resistance and cardiovascular disease[J].Trends Endocrinol Metab, 2016,27(5):319.

    [責(zé)任編輯 陳玲]

    猜你喜歡
    三萜澤瀉孔板
    核電廠高壓安注系統(tǒng)再循環(huán)管線節(jié)流孔板的分析與改進(jìn)
    澤瀉到底“毒”不“毒”
    中老年保健(2022年2期)2022-08-24 03:21:32
    澤瀉原三萜、降三萜和倍半萜的分離及其抗炎活性研究
    限流孔板的計(jì)算與應(yīng)用
    廣州化工(2020年6期)2020-04-18 03:30:20
    長距離礦漿管道系統(tǒng)中消能孔板的運(yùn)行優(yōu)化
    泄熱滲濕的建澤瀉
    佩氏靈芝中三個(gè)新三萜
    茯苓皮總?cè)频瓮柚苽涔に嚨膬?yōu)化
    中成藥(2016年4期)2016-05-17 06:08:05
    澤瀉的化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展
    澤瀉湯治療高脂血癥的臨床療效觀察
    bbb黄色大片| 免费不卡黄色视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产精华一区二区三区| 精品一区二区三区av网在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产在线观看jvid| 亚洲av熟女| 国产成人免费观看mmmm| netflix在线观看网站| 黄色 视频免费看| 日韩欧美三级三区| 91国产中文字幕| 在线播放国产精品三级| 国产视频一区二区在线看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 午夜亚洲福利在线播放| 色综合欧美亚洲国产小说| 丝袜美足系列| 嫩草影视91久久| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 亚洲av熟女| 无人区码免费观看不卡| 国产成人欧美在线观看 | 99在线人妻在线中文字幕 | 国产成人免费观看mmmm| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲精品乱久久久久久| 午夜免费成人在线视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲成人国产一区在线观看| videosex国产| 久久99一区二区三区| 成年人黄色毛片网站| 久久久久国产一级毛片高清牌| 老司机午夜十八禁免费视频| 夫妻午夜视频| 国产男女内射视频| 在线国产一区二区在线| 日韩免费高清中文字幕av| 最新美女视频免费是黄的| bbb黄色大片| 国产黄色免费在线视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 在线观看66精品国产| 亚洲精品久久午夜乱码| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 成人手机av| 久久久国产精品麻豆| 日韩欧美一区视频在线观看| 欧美中文综合在线视频| 国产黄色免费在线视频| 女性生殖器流出的白浆| 美女午夜性视频免费| 三上悠亚av全集在线观看| 韩国av一区二区三区四区| 欧美成人免费av一区二区三区 | 久久国产精品大桥未久av| 美女午夜性视频免费| 久久久久久久国产电影| 美国免费a级毛片| 黄色丝袜av网址大全| 国产麻豆69| 99国产精品一区二区蜜桃av | 最新在线观看一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 欧美亚洲日本最大视频资源| 精品久久久精品久久久| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 三级毛片av免费| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久久久精品人妻al黑| 午夜福利乱码中文字幕| 国产精品综合久久久久久久免费 | 老熟女久久久| 欧美精品啪啪一区二区三区| 黄色怎么调成土黄色| 中文字幕色久视频| 两性夫妻黄色片| 男女免费视频国产| 亚洲熟妇熟女久久| 一a级毛片在线观看| 成人国产一区最新在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲午夜理论影院| 欧美久久黑人一区二区| 夜夜夜夜夜久久久久| 久久性视频一级片| 电影成人av| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 18禁国产床啪视频网站| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久久久久人人人人人| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| netflix在线观看网站| 黑人欧美特级aaaaaa片| 婷婷丁香在线五月| 操出白浆在线播放| 久久久久国内视频| 日韩欧美免费精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产主播在线观看一区二区| videos熟女内射| 激情视频va一区二区三区| 免费日韩欧美在线观看| 成人精品一区二区免费| 韩国av一区二区三区四区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产亚洲欧美精品永久| 久久这里只有精品19| 国产成人影院久久av| 精品福利永久在线观看| 国产av精品麻豆| 亚洲久久久国产精品| 国产av一区二区精品久久| tube8黄色片| 嫩草影视91久久| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 在线观看66精品国产| 欧美精品啪啪一区二区三区| 香蕉久久夜色| 美女福利国产在线| 黄片播放在线免费| 久久ye,这里只有精品| 少妇的丰满在线观看| 性少妇av在线| 亚洲人成电影免费在线| 在线观看午夜福利视频| 夜夜爽天天搞| 欧美在线一区亚洲| 香蕉丝袜av| 久久国产精品大桥未久av| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 另类亚洲欧美激情| 国产主播在线观看一区二区| 在线视频色国产色| 国产野战对白在线观看| 两性夫妻黄色片| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 91国产中文字幕| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲色图综合在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 成人影院久久| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 热99re8久久精品国产| 三级毛片av免费| 热99re8久久精品国产| 欧美日韩福利视频一区二区| 麻豆国产av国片精品| 大香蕉久久成人网| 18在线观看网站| 久久精品91无色码中文字幕| 又大又爽又粗| 久久久久久久久久久久大奶| 国产精品 国内视频| 一级,二级,三级黄色视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久中文字幕一级| 国产有黄有色有爽视频| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 中文字幕人妻丝袜制服| 欧美日韩乱码在线| 久久中文字幕人妻熟女| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲av电影在线进入| 丝袜美腿诱惑在线| 午夜亚洲福利在线播放| 男女之事视频高清在线观看| 欧美激情高清一区二区三区| 18禁美女被吸乳视频| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 人成视频在线观看免费观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲精品自拍成人| 桃红色精品国产亚洲av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| а√天堂www在线а√下载 | 午夜老司机福利片| 国产精品 国内视频| 最新的欧美精品一区二区| 欧美精品一区二区免费开放| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 99精品久久久久人妻精品| 日本vs欧美在线观看视频| 久久久久视频综合| 夫妻午夜视频| 国产精品电影一区二区三区 | 欧美日本中文国产一区发布| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 午夜福利在线免费观看网站| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲黑人精品在线| 99riav亚洲国产免费| 国产av又大| 夜夜夜夜夜久久久久| 色综合欧美亚洲国产小说| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产在线精品亚洲第一网站| 在线观看免费高清a一片| 美国免费a级毛片| 曰老女人黄片| 久久久精品区二区三区| 久久久久久久国产电影| 亚洲美女黄片视频| 丰满的人妻完整版| 黄色视频不卡| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久人妻熟女aⅴ| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 三级毛片av免费| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 女人精品久久久久毛片| 99久久综合精品五月天人人| 久久午夜综合久久蜜桃| 看免费av毛片| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美日韩精品网址| 悠悠久久av| 午夜福利视频在线观看免费| 午夜福利一区二区在线看| 欧美日本中文国产一区发布| 91av网站免费观看| 高清毛片免费观看视频网站 | 在线永久观看黄色视频| 天堂√8在线中文| 国产一区二区激情短视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 久久99一区二区三区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久香蕉精品热| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 精品久久久久久电影网| 国产在视频线精品| 人妻 亚洲 视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美精品一区二区免费开放| 少妇的丰满在线观看| 制服人妻中文乱码| 在线国产一区二区在线| 黄色成人免费大全| 成人国产一区最新在线观看| av视频免费观看在线观看| 在线天堂中文资源库| 亚洲av熟女| 99精品久久久久人妻精品| 一级片'在线观看视频| 久久青草综合色| 女性被躁到高潮视频| 久久久久久人人人人人| 午夜福利欧美成人| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 成年人午夜在线观看视频| 热re99久久精品国产66热6| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲久久久国产精品| 日韩欧美免费精品| 中文欧美无线码| 国产成人欧美在线观看 | 国产淫语在线视频| 国产一区二区激情短视频| 中亚洲国语对白在线视频| 视频区图区小说| 欧美国产精品一级二级三级| 午夜91福利影院| 亚洲欧美激情在线| 国产日韩欧美亚洲二区| 久久精品国产清高在天天线| 日韩欧美免费精品| 久久午夜亚洲精品久久| 大码成人一级视频| 欧美最黄视频在线播放免费 | 精品一区二区三区四区五区乱码| av天堂久久9| 亚洲一区中文字幕在线| 日韩欧美国产一区二区入口| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 人人妻人人澡人人看| 久久人妻av系列| 婷婷成人精品国产| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 12—13女人毛片做爰片一| 久久人妻熟女aⅴ| 在线观看免费午夜福利视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 一本综合久久免费| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产主播在线观看一区二区| 黑丝袜美女国产一区| 两性夫妻黄色片| 国产精品欧美亚洲77777| av电影中文网址| ponron亚洲| 亚洲,欧美精品.| 精品福利永久在线观看| 性少妇av在线| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产亚洲av高清不卡| 搡老岳熟女国产| 免费高清在线观看日韩| 久久九九热精品免费| 国产男女内射视频| 91九色精品人成在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产av精品麻豆| 中文字幕人妻熟女乱码| svipshipincom国产片| 一本综合久久免费| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 天堂√8在线中文| 嫁个100分男人电影在线观看| 老司机福利观看| 精品国产国语对白av| ponron亚洲| 超碰97精品在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 一夜夜www| e午夜精品久久久久久久| 丁香六月欧美| 老汉色∧v一级毛片| 国产91精品成人一区二区三区| 天天操日日干夜夜撸| 欧美丝袜亚洲另类 | 欧美亚洲日本最大视频资源| 在线看a的网站| 精品高清国产在线一区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美日本中文国产一区发布| 国产精品免费大片| 成人av一区二区三区在线看| 国产伦人伦偷精品视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美一级毛片孕妇| 精品国产乱子伦一区二区三区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 黄片小视频在线播放| 国产色视频综合| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美在线黄色| 色94色欧美一区二区| 中文欧美无线码| 免费在线观看日本一区| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲国产看品久久| 交换朋友夫妻互换小说| 操美女的视频在线观看| 亚洲av成人一区二区三| 老熟女久久久| 欧美日本中文国产一区发布| 国产成人av教育| 亚洲色图综合在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 深夜精品福利| 午夜福利在线观看吧| av网站在线播放免费| 国产精品免费视频内射| 亚洲第一av免费看| 久久久国产精品麻豆| 亚洲欧美激情综合另类| 我的亚洲天堂| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 高清毛片免费观看视频网站 | 精品久久久久久久毛片微露脸| 三级毛片av免费| 国产激情欧美一区二区| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 大香蕉久久网| 免费观看a级毛片全部| 在线观看免费高清a一片| 男人舔女人的私密视频| 啦啦啦 在线观看视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美+亚洲+日韩+国产| 男女之事视频高清在线观看| 很黄的视频免费| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 男女午夜视频在线观看| 成人免费观看视频高清| 最新在线观看一区二区三区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产精品欧美亚洲77777| 9热在线视频观看99| 十八禁网站免费在线| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 免费不卡黄色视频| 久久 成人 亚洲| 久久香蕉精品热| 亚洲第一av免费看| 男女下面插进去视频免费观看| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲av美国av| 人人妻人人澡人人看| 老司机深夜福利视频在线观看| 久久狼人影院| 两性夫妻黄色片| 免费在线观看日本一区| 亚洲国产精品sss在线观看 | 亚洲精品国产区一区二| 亚洲av美国av| 国产成人免费观看mmmm| 曰老女人黄片| 国产免费av片在线观看野外av| 69精品国产乱码久久久| 高潮久久久久久久久久久不卡| 不卡一级毛片| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久久国产成人精品二区 | 韩国av一区二区三区四区| 亚洲美女黄片视频| 日本a在线网址| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 久久狼人影院| 香蕉国产在线看| 男男h啪啪无遮挡| 男女午夜视频在线观看| 亚洲人成电影观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产不卡一卡二| 亚洲熟女精品中文字幕| 日韩免费高清中文字幕av| 国产xxxxx性猛交| 男人的好看免费观看在线视频 | 精品一区二区三卡| 日韩大码丰满熟妇| 成人精品一区二区免费| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲五月天丁香| 中文字幕高清在线视频| 18禁国产床啪视频网站| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 高清欧美精品videossex| 久久亚洲精品不卡| 女警被强在线播放| 91九色精品人成在线观看| 久久久精品免费免费高清| 国产熟女午夜一区二区三区| 12—13女人毛片做爰片一| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久久久视频综合| 九色亚洲精品在线播放| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产精品亚洲av一区麻豆| 中文亚洲av片在线观看爽 | 国产精品欧美亚洲77777| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 日韩欧美免费精品| 国产精品一区二区在线不卡| 乱人伦中国视频| 一级片免费观看大全| 美女国产高潮福利片在线看| 久久人妻熟女aⅴ| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产又爽黄色视频| 久久精品国产a三级三级三级| 69精品国产乱码久久久| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲成a人片在线一区二区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 精品午夜福利视频在线观看一区| 无遮挡黄片免费观看| 精品久久蜜臀av无| 亚洲片人在线观看| 国产男女内射视频| 亚洲精品一二三| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产午夜精品久久久久久| 丁香六月欧美| 黑丝袜美女国产一区| 丁香六月欧美| 美女高潮到喷水免费观看| 在线观看免费高清a一片| 色94色欧美一区二区| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 9色porny在线观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 精品少妇久久久久久888优播| 国产精品二区激情视频| 亚洲在线自拍视频| 91精品三级在线观看| 午夜老司机福利片| 黑人欧美特级aaaaaa片| 18禁国产床啪视频网站| 久久人妻av系列| 1024香蕉在线观看| 精品久久蜜臀av无| 国产深夜福利视频在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| av电影中文网址| 另类亚洲欧美激情| 国产亚洲欧美精品永久| 免费在线观看影片大全网站| 电影成人av| 美女福利国产在线| 亚洲av美国av| 久久久久国产一级毛片高清牌| 婷婷成人精品国产| 日韩大码丰满熟妇| 热99国产精品久久久久久7| 女人久久www免费人成看片| 欧美精品av麻豆av| 欧美在线黄色| 老司机午夜十八禁免费视频| 激情视频va一区二区三区| 国产伦人伦偷精品视频| 丝袜美足系列| 午夜福利一区二区在线看| 久久草成人影院| 飞空精品影院首页| 两性夫妻黄色片| 757午夜福利合集在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 最新美女视频免费是黄的| av视频免费观看在线观看| 免费不卡黄色视频| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 成年人午夜在线观看视频| 国产精品一区二区在线观看99| 欧美大码av| av视频免费观看在线观看| 女人精品久久久久毛片| 亚洲伊人色综图| 久久香蕉激情| 麻豆成人av在线观看| 夜夜爽天天搞| 国产亚洲精品一区二区www | 中文字幕人妻熟女乱码| 国产精品亚洲一级av第二区| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 制服人妻中文乱码| 另类亚洲欧美激情| 欧美中文综合在线视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 看片在线看免费视频| 91av网站免费观看| 午夜激情av网站| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲免费av在线视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 欧美在线黄色| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产深夜福利视频在线观看| 香蕉国产在线看| 妹子高潮喷水视频| 午夜福利在线观看吧| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 色综合婷婷激情| 亚洲av成人av| av国产精品久久久久影院| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 亚洲一区高清亚洲精品| 午夜精品国产一区二区电影| 久久香蕉激情| 国产99白浆流出| 午夜精品久久久久久毛片777| 在线观看免费视频日本深夜| 高清毛片免费观看视频网站 | tocl精华| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品成人在线| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 99国产综合亚洲精品| 国产在视频线精品| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲av片天天在线观看| 午夜福利免费观看在线| 看黄色毛片网站| 美女高潮到喷水免费观看| 午夜日韩欧美国产| 久久久国产精品麻豆| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 最近最新免费中文字幕在线| 国产精品免费视频内射| 国产精品久久视频播放| 在线观看免费视频日本深夜| 久久精品91无色码中文字幕| 动漫黄色视频在线观看| 成年人黄色毛片网站| 天堂俺去俺来也www色官网|