宮頸癌組織中S6K1和S6K2的表達(dá)及其臨床意義

韓 冰 趙國軍 蘭素偉 吉 潔 付子毅

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，河北 承德 067000)

·腫 瘤·

宮頸癌組織中S6K1和S6K2的表達(dá)及其臨床意義

韓 冰 趙國軍 蘭素偉 吉 潔 付子毅1

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，河北 承德 067000)

目的 探討宮頸癌組織中核糖體蛋白S6激酶(S6K)1和S6K2的表達(dá)及其臨床意義。方法 經(jīng)手術(shù)切除的宮頸癌組織94例、正常宮頸組織52例及宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)組織103例(CINⅠ 33例、CINⅡ 29例、CIN Ⅲ 41例)，采用免疫組化法檢測以上組織中S6K1和S6K2的表達(dá)情況，分析兩者表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、FIGO分期、脈管瘤栓、深肌層浸潤及宮旁浸潤)，采用單因素分析和多因素分析影響宮頸癌預(yù)后的因素。結(jié)果 宮頸癌組織中S6K1和S6K2陽性表達(dá)率均高于正常宮頸組織和CIN組織(P<0.05)；正常宮頸組織和CIN組織中S6K1、S6K2陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。S6K1表達(dá)與分化程度和FIGO分期均有關(guān)(P<0.05)，而S6K2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、FIGO分期和深肌層浸潤均有關(guān)(P<0.05)；S6K1、S6K2陽性者的5年生存率均低于陰性表達(dá)者(P<0.05)。多因素分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、FIGO分期、宮旁浸潤及S6K1和S6K2表達(dá)為影響宮頸癌預(yù)后的獨(dú)立因素。結(jié)論 宮頸癌組織中的S6K1和S6K2為高表達(dá)，均與分化程度和FIGO分期有關(guān)，且S6K1、S6K2陽性者的預(yù)后較差，可作為預(yù)測預(yù)后的影響因素。

宮頸癌；核糖體蛋白S6激酶(S6K)1；S6K2

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多階段、多步驟的復(fù)雜過程，其中涉及多個基因的異常表達(dá)〔1〕。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過調(diào)控必要蛋白質(zhì)的翻譯過程來影響細(xì)胞生長、增殖及代謝〔2〕。mTOR是一種調(diào)節(jié)多個細(xì)胞功能的關(guān)鍵效應(yīng)子，其在多種腫瘤組織中表達(dá)升高，且其參與的信號通路處于激活狀態(tài)。由于mTOR參與了多種致癌細(xì)胞通路，故探討mTOR的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其下游效應(yīng)因子的表達(dá)在癌癥靶向治療中有重要意義〔3,4〕。核糖體蛋白S6激酶(S6K)1和S6K2是mTOR的重要底物，近年來發(fā)現(xiàn)兩者參與了惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔5,6〕，但在宮頸癌中的表達(dá)模式及作用尚不清楚。本研究旨在探討宮頸癌組織中S6K1和S6K2的表達(dá)情況及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2011年1月至2014年6月經(jīng)手術(shù)切除的宮頸癌組織94例、正常宮頸組織52例及宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)組織103例。宮頸癌組織來源于接受手術(shù)治療的94例宮頸癌患者，均為鱗癌，年齡27～61歲，中位年齡42.5歲，均接受廣泛性全子宮切除術(shù)加盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)后接受盆腔常規(guī)外照射放療，總劑量45～50 Gy；正常宮頸組織來源于同期52例子宮肌瘤手術(shù)者，年齡31～60歲，中位年齡43.0歲；103例CIN組織均經(jīng)病理活檢確診，其中CINⅠ 33例、CINⅡ 29例和CIN Ⅲ 41例，年齡30～58歲，中位年齡41.0歲。

1.2 試劑 兔抗人S6K1、S6K2 多克隆抗體(工作濃度為1∶5 000)均購自美國Abcam公司，免疫組化試劑盒及DAB顯色試購自武漢博士德生物公司，其他輔助用液及材料均由本院病理科專業(yè)技術(shù)人員配制。

1.3 免疫組化SP法 取病理科保存的術(shù)后石蠟包埋組織進(jìn)行切片，將石蠟切片脫蠟至水后，進(jìn)行微波爐抗原熱修復(fù)，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每張切片滴加適當(dāng)比例的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2 h或4℃過夜，PBS沖洗3次，5 min/次，每張切片滴加適量新鮮生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，5 min/次，DAB顯色(顯微鏡下控制顯色時間)，依次經(jīng)蘇木素復(fù)染、脫水及二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性對照選已訂購的陽性對照片，陰性對照為PBS代替一抗。

1.4 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 光鏡下觀察整個切片，每例切片隨機(jī)選取5個高倍鏡視野進(jìn)行結(jié)果判定。免疫組化結(jié)果判定采用雙盲法，即由兩位資深病理醫(yī)師對免疫組化結(jié)果進(jìn)行觀察及評估，當(dāng)出現(xiàn)不一致時由雙方協(xié)商確定。S6K1和S6K2的陽性染色為出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒。采用染色強(qiáng)度×染色細(xì)胞百分率綜合記分方式評估：陽性細(xì)胞數(shù)≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分；(2)按染色深淺：無陽性細(xì)胞計0分，黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。將兩者得分相乘：0分為-，1～2分為+，3～4分為，5～12分為；設(shè)+～為陽性。

1.5 評價指標(biāo) (1)比較宮頸癌組織、正常宮頸組織及CIN組織中的S6K1和S6K2陽性表達(dá)率情況；(2)收集以上患者的一般資料，如年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、FIGO分期、脈管瘤栓、深肌層浸潤及宮旁浸潤，分析S6K1和S6K2表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系；(3)采用電話或門診的方式進(jìn)行隨訪預(yù)后情況，采用單因素分析和多因素分析影響宮頸癌預(yù)后的因素。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析并行Log-rank檢驗(yàn)，采用Cox比例風(fēng)險模型分析影響預(yù)后的因素。

2 結(jié) 果

2.1 S6K1表達(dá)情況 S6K1陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)宮頸癌組織中的S6K1陽性表達(dá)率為70.21%(-28例，+15例，29例，22例)，高于正常宮頸組織(36.54%，其中-33例，+8例，7例，4例)和CIN組織(CIN Ⅰ 36.36%，其中-21例，+3例，7例，2例；CIN Ⅱ 34.48%，其中-19例，+4例，3例，3例；CIN Ⅲ 39.02%，其中-25例，+10例，4例，2例)(P<0.05)；正常宮頸組織和CIN組織中S6K1陽性表達(dá)率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 S6K2表達(dá)情況 S6K2陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。宮頸癌組織中的S6K2陽性表達(dá)率為62.77%(-35例，+26例，19例，14例)，高于正常宮頸組織(21.15%，其中-41例，+4例，5例，2例)和CIN組織(CIN Ⅰ 18.18%，其中-27例，+2例，3例，1例；CIN Ⅱ 20.69%，-23例，+4例，2例，0例；CIN Ⅲ 21.95%，其中-32例，+5例，3例，1例)(P<0.05)；正常宮頸組織和CIN組織中S6K2陽性表達(dá)率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 宮頸癌組織S6K1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 S6K1表達(dá)與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管瘤栓、深肌層浸潤及宮旁浸潤均無關(guān)(P>0.05)，與分化程度和FIGO分期均有關(guān)(P<0.05)，其中低分化者的S6K1陽性表達(dá)率高于中、高分化者，F(xiàn)IGO分期Ⅱa期者的S6K1陽性表達(dá)率高于Ⅰb期(均P<0.05)。見表1。

表1 宮頸癌組織S6K1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系〔n(%),n=94〕

2.4 宮頸癌組織S6K2表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 S6K2表達(dá)與年齡、脈管瘤栓及宮旁浸潤均無關(guān)(P>0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、FIGO分期和深肌層浸潤均有關(guān)(P<0.05)，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的S6K2陽性表達(dá)率，高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，低分化者陽性表達(dá)率，高于中、高分化者(P<0.05)，F(xiàn)IGO分期Ⅱa期者陽性表達(dá)率，高于Ⅰb期，有深肌層浸潤者的陽性表達(dá)率，高于無深肌層浸潤者(P<0.05)。見表1。

2.5 影響宮頸癌患者預(yù)后的單因素、多因素分析 單因素分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、FIGO分期、脈管瘤栓、深肌層浸潤、宮旁浸潤及S6K1和S6K2表達(dá)情況均與宮頸癌患者的預(yù)后有關(guān)，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化程度、FIGO Ⅱa期、有脈管瘤栓、有深肌層浸潤、有宮旁浸潤及S6K1和S6K2陽性者的5年生存率較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)多因素分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、FIGO分期、宮旁浸潤及S6K1和S6K2表達(dá)為影響宮頸癌預(yù)后的獨(dú)立因素。見表2、表3。

表2 影響宮頸癌患者預(yù)后的單因素分析(%)

表3 影響宮頸癌患者預(yù)后的多因素分析

3 討 論

作為mTOR的重要底物，S6K1和S6K2的氨基酸序列中有70%以上的同源性，而且兩者催化結(jié)構(gòu)域有更高的序列同源性(>83%)〔7〕。兩者在域結(jié)構(gòu)及多個磷酸化位點(diǎn)上序列保守，表明在哺乳動物中S6K1和S6K2這兩個異構(gòu)體位基因復(fù)制的結(jié)果〔8〕。盡管兩者均可將40S核糖體蛋白S6激酶磷酸化，但仍被認(rèn)為具有不同的生物學(xué)功能〔9〕。與S6K1相比，S6K2包含一個富含脯氨酸的序列，該序列與PI3K的p85亞基中的一個序列同源，可與SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相互作用〔10〕。編碼S6K1和S6K2的基因分別位于染色體17q21-23和11q13區(qū)域，在多種惡性腫瘤中處于擴(kuò)增狀態(tài)〔11〕。研究發(fā)現(xiàn)S6K1和S6K2過表達(dá)與乳腺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)〔12〕，抑制S6K1表達(dá)可增強(qiáng)Bcl-2/Bcl-xL活性缺失誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡〔13〕。此外，S6K1還參與了EGFR野生型NSCLC細(xì)胞對厄洛替尼的敏感性調(diào)節(jié)〔14〕，以上提示S6K1和S6K2在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮癌基因的作用。

本研究結(jié)果表明S6K1和S6K2可能在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮癌基因的作用。Pérez-Tenorio等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中S6K1和S6K2基因位于的染色體17q21-23和11q13區(qū)域中多為擴(kuò)增狀態(tài)，且同屬此區(qū)域的HER2和CCND1是重要的癌基因。本研究提示腫瘤負(fù)荷越大時，編碼S6K1和S6K2的基因擴(kuò)增越明顯，最終導(dǎo)致兩者蛋白表達(dá)升高。此外，S6K2還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和深肌層浸潤有關(guān)，以上表明S6K2與宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能原因?yàn)楸M管S6K1和S6K2具有較高的同源性，但在具體生物學(xué)功能上仍有差異，下一步將采用分析生物學(xué)手段驗(yàn)證兩者在調(diào)控侵襲轉(zhuǎn)移上的作用模式。另一方面本研究的樣本量較少也可能是導(dǎo)致兩者差異的一個原因。

降低復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、提高生存獲益是宮頸癌治療的一個目標(biāo)〔15〕。本研究通過對隨訪資料分析發(fā)現(xiàn)S6K1和S6K2與宮頸癌患者的預(yù)后有關(guān)，S6K1、S6K2表達(dá)是宮頸癌預(yù)后的獨(dú)立因素，盡管S6K1與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)無關(guān)，但由于其與S6K2有較高的同源性，在功能上有一個重疊〔7,11〕，推測可能通過間接的方式來影響宮頸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。以上結(jié)果表明檢測宮頸癌組織中S6K1和S6K2的表達(dá)情況具有一定的臨床價值，可用于宮頸癌患者預(yù)后的預(yù)測。本研究為小樣本探索性研究，還需要進(jìn)一步開展大樣本的臨床驗(yàn)證。

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〔2016-12-23修回〕

(編輯 滕欣航)

國家自然科學(xué)基金(81302304)

吉 潔(1978-)，女，主治醫(yī)師，主要從事婦科研究。

韓 冰(1976-)，女，主治醫(yī)師，主要從事婦科研究。

R737.33

A

1005-9202(2017)09-2182-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.045

1 南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市婦幼保健院醫(yī)學(xué)研究中心