氯化兩面針堿對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用

郭桂元 黃子成 林嬋嬋 黃志鵬

(泉州市第一醫(yī)院消化內(nèi)科，福建 泉州 362000)

氯化兩面針堿對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用

郭桂元 黃子成 林嬋嬋 黃志鵬

(泉州市第一醫(yī)院消化內(nèi)科，福建 泉州 362000)

目的 探討氯化兩面針堿(NC)對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、遷移的作用及其機(jī)制。方法 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NC對(duì)SGC-7901細(xì)胞的增殖作用； Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NC對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移和侵襲的影響；Western印跡檢測(cè)NC對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞中Bax,Bcl-2,PCNA,MMP2,MMP1和GAPDH表達(dá)的影響。結(jié)果 MTT實(shí)驗(yàn)表明NC抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，并且呈時(shí)間、劑量依賴性(P<0.05)；此外，NC顯著抑制SGC-7901細(xì)胞中PCNA表達(dá)，呈劑量依賴性(P<0.05)；Transwell小室實(shí)驗(yàn)表明NC顯著抑制SGC7901細(xì)胞遷移和侵襲，呈劑量、時(shí)間依賴性(P<0.05)；Western印跡表明NC上調(diào)凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，抑制MMP1以及MMP2的表達(dá)(均P<0.05)。結(jié)論 NC通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制SGC-7901細(xì)胞增殖，通過(guò)降解MMP1和MMP2從而抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲和遷移。

氯化兩面針堿；人胃癌SGC-7901細(xì)胞；增殖；侵襲；遷移

胃癌特征就是細(xì)胞增殖、遷移以及侵襲不受控制〔1〕。胃癌早期很難診斷，一般確診時(shí)已進(jìn)入晚期〔2〕。兩面針來(lái)源于植物兩面針的根，是天然的植物生物堿〔3〕。氯化兩面針堿(NC)是兩面針的氯化物，有抗感染〔4〕、抗瘧〔5〕、抗真菌〔5〕、抗血管生成〔6〕以及抗腫瘤等活性〔7〕。NC抗腫瘤有一定的效果，然而，鮮有文章報(bào)道NC對(duì)于胃癌增殖、遷移的影響。本文旨在探討NC對(duì)于人胃癌細(xì)胞SGC7901增殖、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑：Trypsin-乙二胺四乙酸(EDTA)和噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，RPMI1640和胎牛血清(FBS)購(gòu)自英國(guó)Hyclone 公司。Bax,Bcl-2,PCNA,MMP2,MMP1和GAPDH購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。NC購(gòu)自Tauto Biotech公司，SGC-7901細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)Cell Resource Center of Life Sciences，培養(yǎng)在包含有10%FBS和100 U/ml青霉素及100 U/ml鏈霉素。在5%CO2和37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時(shí)用0.25%的胰酶處理。

1.2 方法

1.2.1 MTT實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)用MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定。SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，接種密度為1×104，接種24 h，并且設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。之后分兩組處理。第一組用不同濃度NC處理細(xì)胞48 h。將NC溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，濃度分別為0、20、40、80 μmol/L。另外一組用40 μmol/L NC處理SGC-7901細(xì)胞24、48、72 h。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞之后，用20 μl的5 mg/ml MTT在37℃處理細(xì)胞4 h。棄掉MTT之后，每孔加入100 μl DMSO溶液。96孔板在室溫下溫和搖蕩10 min。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm處檢測(cè)吸光值。

1.2.2 Transwell小室實(shí)驗(yàn) 將基質(zhì)膠溶液(培養(yǎng)基∶基質(zhì)膠=7∶1)鋪滿Transwell小室底部，將Transwell小室放在細(xì)胞培養(yǎng)箱(5%CO2，37℃)中培養(yǎng)過(guò)夜，使底部的基質(zhì)膠溶液凝固；將不同濃度(0、20、40、80 μmol/L)或者不同時(shí)間(24、48、72 h)NC處理SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)直至細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml。用胰酶消化細(xì)胞，重懸的細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清培養(yǎng)基，細(xì)胞液加入上室，下室加入500 μl含有10%FBS培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h。之后用棉簽擦拭基質(zhì)膠以及上室的細(xì)胞。用95%乙醇處理小室10 min，晾干之后加入4 g/L結(jié)晶紫200 μl染色10 min。清水洗滌。取4個(gè)視野，記錄通過(guò)半膜的細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.2.3 Western印跡實(shí)驗(yàn) 不同處理的細(xì)胞用PBS洗滌2次，然后用裂解液在冰上裂解30 min。然后用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞裂解液的濃度。將50 μg蛋白上樣于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠中，然后電轉(zhuǎn)到聚偏氟丙烯(PVDF)膜上。然后用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗5 min，3次，然后孵育相應(yīng)的一抗，并且4℃過(guò)夜；之后TBST洗滌5 min，3次；然后孵育二抗2 h；之后用化學(xué)發(fā)光液均勻撒在膜上，顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，采用Image J軟件對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行定量分析，統(tǒng)計(jì)圖采用GraphPad Prism5軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1 NC抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖 見圖1。0、20、40、80 μmol/L NC組細(xì)胞存活率分別為(91.2±2.56)%、(74.6±5.23)%、(52.6±3.14)%、(45.3±2.46)%，表明NC顯著抑制SGC-7901細(xì)胞增殖，并且具有劑量依賴關(guān)系(P<0.05)。NC抑制SGC-7901細(xì)胞增殖還呈現(xiàn)時(shí)間依賴關(guān)系24、48、72 h細(xì)胞存活率分別為(72.3±3.26)%，(53.6±3.14)%,(38.1±2.07)%(P<0.05)。此外，Western印跡結(jié)果表明NC顯著抑制SGC-7901細(xì)胞中PCNA表達(dá)，呈劑量依賴性0、20、40、80 μmol/L NC組PCNA相對(duì)表達(dá)量分別為(0.26±0.013)、(0.22±0.015)、(0.14±0.010)、(0.09±0.019)(P<0.05)。

2.2 Transwell chamber法檢測(cè)NC對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移、侵襲的影響 采用濃度分別為20、40、80 μmol/L的NC處理SGC-7901細(xì)胞，穿過(guò)膜的數(shù)量〔(62.4±1.58)個(gè)、(49.2±1.21)個(gè)、(40.2±1.77)個(gè)〕少于對(duì)照組〔(86.2±3.67)個(gè)〕，并且呈劑量依賴性(P<0.05)。40 μmol/L NC處理SGC-7901細(xì)胞24、48、72 h后，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SGC-7901細(xì)胞穿膜數(shù)量減少〔(64.6±2.13)個(gè)、(48.4±1.65)個(gè)、(32.6±1.73)個(gè)〕，呈時(shí)間依賴性(P<0.05)。見圖2。

2.3 Western印跡 NC可以抑制SGC-7901細(xì)胞增殖，可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。NC可以抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲、遷移，而降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是細(xì)胞侵襲、遷移的關(guān)鍵，MMP1和MMP2是ECM降解酶〔13〕，可以降解基質(zhì)或者非基質(zhì)蛋白。不同濃度NC(0、20、40、80 μmol/L)處理SGC-7901細(xì)胞后，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)〔(0.15±0.01)，(0.25±0.01)，(0.41±0.01)，(0.50±0.02)〕，Bcl-2蛋白表達(dá)減少〔(0.63±0.02),(0.48±0.02),(0.40±0.01),(0.31±0.01)〕，呈劑量依賴性(P<0.05)。MMP1〔(0.72±0.02,(0.58±0.01),(0.51±0.01),(0.43±0.01)〕和MMP2蛋白〔(0.73±0.05),(0.60±0.02),(0.48±0.02),(0.32±0.01)〕表達(dá)降低，呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖3。

圖2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分析NC對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移、侵襲的影響

圖3 在SGC-7901細(xì)胞中，用Western印跡檢測(cè)不同濃度NC對(duì)Bax、Bcl-2、MMP1和MMP2表達(dá)影響

3 討 論

胃癌的進(jìn)展從原發(fā)部位到繼發(fā)部位，從而導(dǎo)致在多級(jí)過(guò)程中遷移、侵襲。首先從原發(fā)部位分離之后遷移到ECM，然后滲入血管或者淋巴管，緊接著腫瘤細(xì)胞在脈管系統(tǒng)中存活進(jìn)而形成繼發(fā)性腫瘤〔8〕。從植物中提取的化學(xué)物質(zhì)包括萜類、黃酮類、異硫氰酸酯類以及生物堿類都是從中藥植物中提取〔9〕。NC通過(guò)ERK相關(guān)的信號(hào)通路誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞的凋亡，并且伴隨著Bax上調(diào)以及Bcl-2的下調(diào)〔10〕。NC通過(guò)c-scr-fak信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移〔11〕。本文發(fā)現(xiàn)NC抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，其抑制作用呈劑量、時(shí)間依賴性。已有報(bào)道表明NC可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡〔10〕，推測(cè)NC抑制SGC-7901細(xì)胞增殖是通過(guò)誘導(dǎo)其凋亡。Bcl-2家族蛋白包括Bcl-2，Bcl-XL，Bad和Bax是凋亡通路關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子〔12〕。

本文進(jìn)一步通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)NC可以抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲。MMPs是一種Zn2+依賴的內(nèi)源性蛋白酶，能夠降解ECM從而促進(jìn)細(xì)胞侵襲和遷移。Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NC抑制MMP1和MMP2表達(dá)，呈劑量依賴性。

綜上所述，NC通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制SGC-7901細(xì)胞增殖，通過(guò)降解MMP1和MMP2從而抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲和遷移。NC可能成為治療胃癌的新型藥物。

1 鄒文斌，李兆申.中國(guó)胃癌發(fā)病率及死亡率研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志,2014;34(4):408-15.

2 Busweiler LA,Wijnhoven BP,van Berge HM,etal.Early outcomes from the Dutch upper gastrointestinal cancer audit〔J〕.Br J Surg,2016;103(13):1855-63.

3 劉麗敏，劉華鋼.氯化兩面針堿的研究近況〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2007;18(1):60-2.

4 李丹妮，劉華鋼，劉麗敏，等.氯化兩面針堿誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡的研究〔J〕.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009;30(1):40-3.

5 Chen J,Wang J,Lin L,etal.Inhibition of STAT3 signaling pathway by nitidine chloride suppressed the angiogenesis and growth of human gastric cancer〔J〕.Mol Cancer Ther,2012;11(2):277-87.

6 程翔宇.氯化兩面針堿對(duì)前列腺癌細(xì)胞抑制增殖、侵襲與誘發(fā)凋亡的研究〔D〕.濟(jì)南：山東大學(xué),2015.

7 王 勇，楊永濱，馬玉琛.MMP1,MMP2和TIMP2在雄附方干預(yù)大鼠肺間質(zhì)纖維化中的作用〔J〕.解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013；34(4):376-8.

8 Hood JD,Cheresh DA.Role of integrins in cell invasion and migration〔J〕.Nat Rev Cancer,2002;2(2):91-100.

9 王躍虎，牛紅梅，張兆云，等.重樓屬植物的藥用價(jià)值及其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)〔J〕.中國(guó)中藥雜志,2015；40(5):833-9.

10 Zhai H,Hu S,Liu T,etal.Nitidine chloride inhibits proliferation and induces apoptosis in colorectal cancer cells by suppressing the ERK signaling pathway〔J〕.Mol Med Rep,2016;13(3):2536-42.

11 Pan X,Han H,Wang L,etal.Nitidine chloride inhibits breast cancer cells migration and invasion by suppressing c-Src/FAK associated signaling pathway〔J〕.Cancer Lett,2011;313(2):181-91.

12 Lohmann CM,League AA,Clark WS,etal.Bcl-2:bax and bcl-2:Bcl-x ratios by image cytometric quantitation of immunohistochemical expression in ovarian carcinoma:correlation with prognosis〔J〕.Cytometry,2000;42(1):61-6.

〔2016-11-25修回〕

(編輯 袁左鳴)

郭桂元(1974-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤研究。

R28

A

1005-9202(2017)09-2137-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.023