Akt信號通路在非典型性抗精神病藥物阿立哌唑調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用

呂 路 梅 蕊 彭 樊 王 昉 王 婧

(武漢市精神衛(wèi)生中心醫(yī)務(wù)處，湖北 武漢 430022)

Akt信號通路在非典型性抗精神病藥物阿立哌唑調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用

呂 路 梅 蕊 彭 樊1王 昉2王 婧3

(武漢市精神衛(wèi)生中心醫(yī)務(wù)處，湖北 武漢 430022)

目的 探討非典型性抗精神病藥物阿立哌唑是否通過Akt信號通路對海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡發(fā)揮作用。方法 通過構(gòu)建精神分裂癥(CPZ)模型小鼠，設(shè)置對照組、阿立哌唑組、CPZ組、CPZ+阿立哌唑四組，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對小鼠斷頭取腦，冰上分離出海馬組織和脊髓，培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，MTT檢測細(xì)胞增殖、Western印跡檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)情況；使用磷酸化Akt信號通路試劑盒對總Akt,磷酸化Akt(Ser473)含量的變化情況進(jìn)行檢測。結(jié)果 對飼養(yǎng)6 w后的小鼠提取海馬神經(jīng)細(xì)胞，流式細(xì)胞儀、MTT檢測結(jié)果表明，建立CPZ模型的小鼠，在飼養(yǎng)過程中使用阿立哌唑能明顯降低海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率；MTT檢測結(jié)果表明，與對照組相比，使用阿立哌唑的CPZ模型小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的存活率明顯提高(P<0.01)；Western印跡檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1的結(jié)果表明，構(gòu)建的CPZ模型小鼠脊髓受到一定程度損傷，Beclin1的表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，給阿立哌唑后其表達(dá)量顯著下降；在CPZ組中總Akt及Ser473的表達(dá)水平均顯著下降(P<0.01)，通過服用阿立哌唑后表達(dá)水平出現(xiàn)回升，與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。結(jié)論 非典型性抗精神病藥物阿立哌唑可通過Akt信號通路使海馬神經(jīng)細(xì)胞免于凋亡。

阿立哌唑；Akt信號通路

抑郁癥主要是由于認(rèn)知與現(xiàn)實(shí)的不協(xié)調(diào)造成的，其癥狀的輕重程度與環(huán)境及受教育程度密切相關(guān)〔1,2〕。目前，藥物治療仍作為該病的首選方式〔2〕。與傳統(tǒng)抗精神病藥物相比，非典型性抗精神病藥物療效好，副作用小，已被廣泛應(yīng)用于臨床治療〔3〕。磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白酶B(PI3K/Akt)信號通路作為一種促生存信號通路，其激活對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)具有重要作用，從而起到緩解抑郁癥狀的作用〔4〕。本研究通過構(gòu)建精神分裂癥(CPZ)模型小鼠，觀察非典型性抗精神病藥物阿立哌唑是否通過PI3K/Akt信號通路發(fā)揮抗抑郁癥的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及動物模型的制備 實(shí)驗(yàn)所用小鼠均購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，6～7周齡，體重(18±2)g。購買之后常規(guī)飼養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)環(huán)境的溫度約23.5℃、濕度控制在40%～60%。

動物模型的制備:采用0.2%質(zhì)量濃度的 cuprizone 連續(xù)給藥6 w構(gòu)建CPZ。具體制作方法：將CPZ按照0.2%的添加量與飼料混勻，用自來水使之混合凝結(jié)成團(tuán)狀，用模具制成圓柱狀小鼠顆粒飼料，于陰涼通風(fēng)處烘干，使用該飼料飼喂小鼠6 w即可。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 阿立哌唑。

1.3 主要儀器和試劑 胎牛血清(北京索萊寶科技有限公司),RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),蛋白質(zhì)提取試劑盒(上海純優(yōu)生物科技有限公司),BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程有限公司),實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(上海信帆生物科技有限公司),磷酸化Akt信號通路試劑盒(Cell Signaling),Annexin-V-FTTC-P1試劑盒(美國Coulter),MTT(美國Invitrogen),流式細(xì)胞儀(美國Coulter),離心機(jī)(Eppendorf),CO2培養(yǎng)箱(長沙長錦生物科技有限公司),超凈工作臺(無錫云潔凈化設(shè)備有限公司),倒置顯微鏡(日本尼康),熒光素酶分析儀(北京普力特儀器有限公司),離心機(jī)(德國Sorvall)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 分為對照組、阿立哌唑組、CPZ組、CPZ+阿立哌唑組，其中對照組常規(guī)飼養(yǎng)，阿立哌唑組在常規(guī)飼養(yǎng)過程中通過飲水飼喂阿立哌唑，CPZ組在建模過程中飼喂0.2%質(zhì)量濃度的CPZ；CPZ+阿立哌唑組在建模過程中飼喂0.2%質(zhì)量濃度的CPZ，同時(shí)飲水服用阿立哌唑(10 mg/d)。實(shí)驗(yàn)周期為6 w。

1.5 海馬細(xì)胞培養(yǎng) 6 w后，分別對各組小鼠斷頭取腦，冰上分離出海馬組織，0.25%的胰酶對海馬組織消化15 min，并吹打均勻，制成單細(xì)胞懸液。隨后對單細(xì)胞懸液進(jìn)行過濾，細(xì)胞計(jì)數(shù)后分裝入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)瓶中，37℃飽和濕度、5%CO2條件下進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 0.25%的胰蛋白酶消化收集海馬細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗后加入5 μl膜聯(lián)蛋白(Annexin V)，室溫條件下孵育10～15 min后加入5 μl 7-AAD，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.7 MTT檢測細(xì)胞增殖情況 收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中過夜培養(yǎng)至48 h。加入MTT溶液10 μl(5 mg/ml)，37℃培養(yǎng)4 h，加入二甲基亞砜(DMSO)溶液100 μl震蕩，待沉淀完全溶解后置于酶標(biāo)儀測定OD值。

1.8 Western印跡檢測Akt信號通路的變化 通過使用磷酸化Akt信號通路試劑盒對總Akt,磷酸化Akt(Ser473)含量的變化情況進(jìn)行檢測，分別對其總蛋白進(jìn)行提取，提取方法參照說明書進(jìn)行。將蛋白樣品與上樣緩沖液以3∶1的比例混合，100℃煮沸5 min，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)檢測。電壓采用先低后高的趨勢，以保證條帶的質(zhì)量，當(dāng)Marker遷移至分離膠底部時(shí)終止電泳。取出凝膠在4℃條件下轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入一抗4℃孵育過夜，Trist鹽酸緩沖液(TBST)洗滌后與兔抗小鼠二抗室溫孵育1 h。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影后成像。

1.9 Western印跡檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá) 6 w后采用頸部處死的方式，分別取出各組小鼠的脊髓：快速暴露損傷部位的脊髓，在無菌條件下取出小塊損傷的脊髓并置于液氮中保存。隨后參照蛋白提取試劑盒說明書，分別對各組的脊髓相關(guān)蛋白Beclin1進(jìn)行提取，采用紫外分光光度計(jì)測定蛋白含量，并通過Western印跡進(jìn)行檢測。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況 建立CPZ模型小鼠，在飼養(yǎng)過程中使用阿立哌唑能明顯降低海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率；而在對照組和阿立哌唑組效果不顯著。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況

2.2 MTT檢測細(xì)胞增殖情況 對照組〔(78.16±4.64)%〕和阿立哌唑組〔(79.82±6.31)%〕海馬細(xì)胞存活情況大致一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但CPZ模型小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的存活率〔(29.64±2.56)%〕明顯下降，服用阿立哌唑后細(xì)胞存活率〔(62.47±1.64)%〕明顯升高(P<0.01)。

2.3 Beclin1的表達(dá)情況 構(gòu)建的CPZ模型的小鼠脊髓受到一定程度損傷，Beclin1表達(dá)量明顯升高(對照組為0.53±0.05,CPZ組為0.84±0.06，阿立哌唑組為0.52±0.04，P<0.01)，給予阿立哌唑后表達(dá)量(0.46±0.07)顯著下降，與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 Western印跡檢測Akt信號通路的變化情況 總Akt 及Ser473表達(dá)水平的變化情況基本一致，CPZ組中兩者的表達(dá)水平(0.63±0.08，0.79±0.06)均顯著下降(P<0.01)，服用阿立哌唑后表達(dá)水平出現(xiàn)回升(1.75±0.17，1.48±0.10)，與對照組(1.62±0.11,1.73±0.13)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。阿立哌唑組總Akt、Ser473表達(dá)量分別為2.25±0.16，1.94±0.12。

3 討 論

非典型性抗精神病藥物作為治療抑郁癥的首選，治療效果較好，且副作用小，具有很好的應(yīng)用前景〔5～7〕，其作用機(jī)制為：(1)可能限制了黑質(zhì)紋狀體通路的5-羥色胺(5-HT)2A受體，使紋狀體D2受體功能的選擇性得以改善，并通過阻斷中腦皮層通路，增加了前額皮層的D1 受體功能。(2)通過阻斷中腦邊緣系統(tǒng)的D2 受體,調(diào)節(jié)多巴胺功能亢進(jìn),使注意力得到改進(jìn)。阿立哌唑是首個(gè)用于治療抑郁癥的D2 受體拮抗劑，主要是通過拮抗多巴胺D2 受體的活性進(jìn)行介導(dǎo)的。前期研究結(jié)果表明，在CPZ患者中，阿立哌唑較氯丙嗪的治療效果好〔8〕。研究報(bào)道〔9〕，抑郁癥患者中，海馬神經(jīng)元明顯減少，進(jìn)一步研究證實(shí)，重癥CPZ患者的海馬體積顯著縮小，推測這與海馬神經(jīng)元的凋亡密切相關(guān)。PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞中廣泛存在，主要參與細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等過程，作為一種促生存信號通路，其激活對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)具有重要作用〔10〕。Akt即蛋白激酶B，作為PI3K的靶蛋白之一，其特異性與底物中絲氨酸(蘇氨酸)殘基相互作用，使其磷酸化，從而在蛋白質(zhì)的相互作用間起作用。Ser-473作為主要的磷酸化位點(diǎn)，其表達(dá)量的升高預(yù)示著PI3K/Akt信號通路的激活，從而保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。本研究結(jié)果表明，對CPZ模型的小鼠使用阿立哌唑后，總Akt及Ser-473的表達(dá)量明顯回升。后續(xù)對海馬細(xì)胞的凋亡情況及細(xì)胞存活率研究表明，與CPZ組的小鼠相比，服用阿立哌唑的CPZ模型組的小鼠，海馬細(xì)胞的存活率明顯提高、凋亡率明顯降低。提示阿立哌唑可通過激活PI3K/Akt信號通路，從而使海馬神經(jīng)細(xì)胞免于凋亡。

抑郁癥患者會伴隨不同程度的脊髓損傷，脊髓損傷會導(dǎo)致自噬現(xiàn)象的發(fā)生，而自噬在海馬神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮中藥作用，可作為細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，防治細(xì)胞凋亡〔11〕。Beclin1作為一種自噬相關(guān)蛋白，能夠促進(jìn)自噬的發(fā)生，且在脊髓損傷后Beclin1的表達(dá)量顯著增高〔12〕。Beclin1在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，這在一定程度上促進(jìn)了自噬現(xiàn)象的激活，這對細(xì)胞凋亡的抑制具有促進(jìn)作用。本研究表明阿立哌唑?qū)σ钟舭Y的小鼠具有一定的緩解作用。由于本文僅研究單一的非典型性抗精神病藥物通過Akt信號通路對海馬神經(jīng)細(xì)胞的作用，但就其一類藥物中的其他藥物是否都是通過Akt信號通路發(fā)揮作用及其具體的作用機(jī)制還有待深入研究。

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〔2016-11-22修回〕

(編輯 袁左鳴)

湖南省自然科學(xué)基金(No.2015JJ1010)

王 昉(1980-)，女，主治醫(yī)師，主要從事精神疾病方面研究。

呂 路(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要從事精神疾病方面研究。

R749.05

A

1005-9202(2017)09-2110-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.012

1 武漢市中醫(yī)醫(yī)院院辦 2 武漢市精神衛(wèi)生中心司法鑒定科

3 武漢市精神衛(wèi)生中心綜合科