納米二氧化硅對大鼠心肺的損傷作用及機制

陸 敏 孫湖泊 李 妍

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

納米二氧化硅對大鼠心肺的損傷作用及機制

陸 敏 孫湖泊1李 妍

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

目的 探討納米二氧化硅對大鼠心肺的損傷作用及其分子機制。方法 成年雄性Wistar大鼠16只，隨機分為對照組及納米二氧化硅染毒組，通過氣管滴注50 nm粒徑的納米二氧化硅構(gòu)建大鼠染毒模型。染毒30 d后稱重并計算大鼠臟器系數(shù)，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察大鼠心、肺組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)法檢測大鼠心、肺轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、 p-Smad2/3信號分子的表達(dá)活性。結(jié)果 與對照組相比，納米二氧化硅染毒組大鼠臟器系數(shù)沒有顯著改變，HE染色可見納米二氧化硅對大鼠心、肺組織損傷明顯，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示納米二氧化硅染毒組大鼠心、肺TGF-β1陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，而p-Smad2/3表達(dá)量在心組織中無明顯改變，在肺組織中明顯增高。結(jié)論 50 nm粒徑的二氧化硅可引起大鼠心、肺組織損傷，其作用可能與TGF-β1信號分子的活化有關(guān)。

納米二氧化硅；心肺損傷；轉(zhuǎn)化生長因子β1

納米二氧化硅顆粒因其純度高、裝載量大、分散均勻等特性，被廣泛應(yīng)用于橡膠、塑料、纖維材料、添加劑、潤滑油及藥物載體等產(chǎn)品的生產(chǎn)。實驗證實，納米二氧化硅對實驗動物及細(xì)胞模型均具有明顯的毒性作用〔1〕。Flaherty等〔2〕研究發(fā)現(xiàn)，納米二氧化硅慢性暴露不僅能夠引起小鼠肺泡巨噬細(xì)胞模型產(chǎn)生急性毒性效應(yīng)，同時能夠引起機體發(fā)生慢性炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致細(xì)胞中活性氧的生成。Okoturo-Evans等〔3〕通過MTT實驗及流式細(xì)胞術(shù)等實驗技術(shù)證實，納米二氧化硅染毒能夠?qū)е翧549肺上皮細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白，如UCP2及calpain-12的表達(dá)量異常升高，提示納米二氧化硅具有明確的細(xì)胞毒性作用。Musa等〔4〕研究顯示，納米二氧化硅能夠引起人肺支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B及小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞DNA損傷。本研究旨在探討納米二氧化硅對大鼠心肺的毒性作用及其引起心肺損傷的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 JEM-1011 型透射電鏡(日本電子株式會社)，光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)，JA1203電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，中國)，低溫高速離心機(Eppendorf，德國)，全自動梯度脫水機(Leica，德國)，納米二氧化硅(阿拉丁，中國)，羥脯氨酸(HYP)試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)，p-Smad2/3、Smad2及Smad3抗體(Cell Signaling Technology，美國)，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1抗體(Abcam生物科技公司，美國)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗動物分組和處理 健康SPF級雄性Wistar大鼠16只，體重(200±20)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供(實驗動物批準(zhǔn)號：2011-x-072)。隨機分為兩組，每組8只。對照組大鼠氣管滴注及灌胃生理鹽水；染毒組大鼠采用非暴露式的氣管滴注染毒及灌胃生理鹽水，隔日染毒；共處理30 d。50 nm粒徑的納米二氧化硅作用濃度為10 mg/kg體重。

1.3 大鼠心、肺臟器系數(shù)檢測 全部實驗大鼠處死前稱重，處死后迅速取出大鼠心及肺，生理鹽水沖洗并用濾紙吸干水分，稱重并計算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=(臟器濕重/體重)×100%。

1.4 大鼠心、肺組織形態(tài)學(xué)觀察 對照組及染毒組大鼠心、肺用10%多聚甲醛固定24 h后，經(jīng)梯度濃度的乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟和包埋后做常規(guī)石蠟切片，并進行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察大鼠心、肺組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.5 大鼠心、肺TGF-β1、 p-Smad2/3信號分子活性檢測 免疫組化法檢測大鼠心、肺細(xì)胞中TGF-β1、p-Smad2/3的表達(dá)情況。心、肺組織切片后分別按照免疫組織化學(xué)染色的步驟進行不同信號分子的抗體孵育及染色過程，顯微鏡下觀察相應(yīng)切片，并對每個400倍視野下的陽性細(xì)胞數(shù)進行計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠心、肺臟器系數(shù)檢測 臟器系數(shù)是實驗動物某臟器的重量與其體重的比值數(shù)，正常時各臟器與體重的比值比較恒定。與對照組(心系數(shù)0.360 7%，肺系數(shù)0.523 3%)相比，10 mg/kg體重的納米二氧化硅暴露對于大鼠心系數(shù)(0.359 3%)及肺系數(shù)(0.498 1%)均沒有明顯影響。

圖1 納米二氧化硅對大鼠心、肺 組織形態(tài)的影響(HE，×400)

2.2 大鼠心、肺病理學(xué)改變 見圖1。對照組大鼠心肌纖維排列較為整齊緊密，染毒組大鼠的心肌纖維之間間隙增大，心肌細(xì)胞水腫明顯。對照組肺組織的支氣管結(jié)構(gòu)清晰，其肺泡間隔無明顯增寬，且無炎細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)無明顯的滲出及出血。而染毒組大鼠肺組織充血，肺間隔增厚、變寬，顯微鏡下可見巨噬細(xì)胞增生。

2.3 TGF-β1、p-Smad2/3表達(dá)的改變 TGF-β1、p-Smad2/3免疫組織化學(xué)染色陽性細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有黃色或棕黃色顆粒(圖2，圖3)。染毒組大鼠的心、肺組織中TGF-β1(223，160)陽性細(xì)胞數(shù)均明顯高于對照組(P<0.01)。肺組織中p-Samd2/3陽性細(xì)胞數(shù)(2.75)明顯高于對照組(0.75，P<0.05)。而心臟中p-Smad2/3陽性細(xì)胞數(shù)(1.00)與對照組(0.75)未見明顯差異(P>0.05)。

圖2 納米二氧化硅對大鼠心、肺細(xì)胞中 TGF-β1表達(dá)量的影響(DAB，×400)

圖3 納米二氧化硅染毒大鼠心、肺 p-Smad2/3組織學(xué)檢查結(jié)果(DAB，×400)

3 討 論

近年來，隨著納米二氧化硅在工業(yè)上的廣泛應(yīng)用及環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，人群接觸其的機會越來越多，納米二氧化硅對人體的生物學(xué)效應(yīng)也逐漸引起人們的關(guān)注。本研究證實一定濃度的納米二氧化硅對大鼠具有明顯的心肺損傷作用。有研究指出，環(huán)境中的納米材料可通過呼吸道、皮膚、消化道進入哺乳動物體內(nèi)，并通過淋巴循環(huán)及血循環(huán)到達(dá)全身各組織器官，引起機體廣泛的生物學(xué)效應(yīng)〔5,6〕。臟器系數(shù)常用于檢測藥物及毒物對實驗動物的各臟器的影響，筆者測定了染毒大鼠的心肺臟器系數(shù)，顯示10 mg/kg體重的納米二氧化硅暴露30 d并未引起大鼠心肺臟器系數(shù)的明顯變化，提示納米二氧化硅對大鼠的損傷作用可能較為廣泛，而非心、肺特異性損傷。

TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在許多生理及病理過程中均發(fā)揮著重要的作用。其中，TGF-β1基因在正常組織細(xì)胞中處于沉默狀態(tài)，當(dāng)機體受到內(nèi)外環(huán)境變化的影響而發(fā)生損傷時，組織細(xì)胞中的TGF-β1基因活化，并參與損傷組織的炎癥反應(yīng)及損傷修復(fù)過程〔7～9〕。通過體外劃痕實驗研究發(fā)現(xiàn)，給予TGF-β1能夠促進膠原蛋白的生成及遷移〔10〕。Takano等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞RLE/Abca3給予TGF-β1 后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，呈細(xì)長的成纖維細(xì)胞樣；同時上皮細(xì)胞標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白(CK)19及Abca3表達(dá)量下降，間充質(zhì)標(biāo)志物如α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)增加，并促進了細(xì)胞板層體的形成。本實驗結(jié)果證實，納米二氧化硅染毒能夠促進大鼠心、肺TGF-β1表達(dá)量的明顯增多，說明納米二氧化硅可能是通過激活TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而影響心、肺功能的。

p-Smad2/3是TGF-β1的重要下游信號分子，當(dāng)TGF-β1與受體結(jié)合后，可以進一步活化細(xì)胞中的Smad2/3，使之磷酸化活化，并從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，將信號轉(zhuǎn)至核內(nèi)，引起相應(yīng)基因表達(dá)改變〔12～14〕。本研究結(jié)果提示TGF-β1在不同的組織器官可能激活不同的下游信號分子，產(chǎn)生不同的損傷效應(yīng)機制。

1 范玉蘭,陶功華,肖 萍,等.Nrf-2在納米二氧化硅致人支氣管上皮細(xì)胞氧化損傷中的作用〔J〕.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2014；31(4)：252-7.

2 Flaherty NL,Chandrasekaran A,del Pilar Sosa Pea M,etal.Comparative analysis of redox and inflammatory properties of pristine nanomaterials and commonly used semiconductor manufacturing nano-abrasives〔J〕.Toxicol Lett,2015；239(3):205-15.

3 Okoturo-Evans O,Dybowska A,Valsami-Jones E,etal.Elucidation of toxicity pathways in lung epithelial cells induced by silicon dioxide nanoparticles〔J〕.PLoS One,2013；8(9):e72363.

4 Musa M,Ponnuraj KT,Mohamad D,etal.Genotoxicity evaluation of dental nanocomposite using comet assay and chromosome aberration test〔J〕.Nanotechnology,2013；24(1):284-8.

5 Daughton CG,Ternes TA.Pharmaceuticals and personal care products in the environment:agents of subtle change〔J〕.Environ Health Perspect,1999；6(6):903-38.

6 Petrochenko PE,Kumar G,Fu W,etal.Nanoporous aluminum oxide membranes coated with atomic layer deposition-grown titanium dioxide for biomedical applications:an in vitro evaluation〔J〕.J Biomed Nanotechnol,2015；11(12):2275-85.

7 Sipil? KH,Ranga V,Rappu P,etal.Extracellular citrullination inhibits the function of matrix associated TGF-β〔J〕.Matrix Biol,2016；55(1):77-89.

8 彭海兵，王永恒，曹福源,等.熊果酸抑制矽肺大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1、白介素1的表達(dá)及其作用機制〔J〕.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2016；33(6)：567-70.

9 Thatcher SE.TGF-β signaling:new insights into aortic aneurysms〔J〕.Ebiomedicine,2016；10(16):30447-9.

10 Wu CS,Wu PH,Fang AH,etal.FK506 inhibits the enhancing of effects transforming growth factor(TGF)-β1 on collagen expression and TGF-β/Smad signalling in keloid fibroblasts:implication for new therapeutic approach〔J〕.Br J Dermatol,2012；167(3):532-41.

11 Takano M,Yamamoto C,Yamaguchi K,etal.Analysis of TGF-β1 and drug-induced epithelial-mesenchymal transition in cultured alveolar epithelial cell line RLE/Abca3〔J〕.Drug Metab Pharmacokinet,2015；30(1):111-8.

12 Sun X,Liu J,Zhuang C,etal.Aluminum trichloride induces bone impairment through TGF-β1/Smad signaling pathway〔J〕.Toxicology,2016；10(5):30237-42.

13 Peng FF,Xiao ZL,Chen HM,etal.Parathyroid hormone inhibits TGF-β/Smad signaling and extracellular matrix proteins upregulation in rat mesangial cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2016；478(3):1093-8.

14 Zhou Q,Zheng X,Chen L,etal.Smad2/3/4 Pathway contributes to TGF-β-induced MiRNA-181b expression to promote gastric cancer metastasis by targeting timp3〔J〕.Cell Physiol Biochem,2016；39(2):453-66.

〔2016-11-14修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81372952)；吉林省教育廳科研項目(No.2015407)

李 妍(1974-)，女，副教授，博士，主要從事神經(jīng)毒理學(xué)相關(guān)機制研究。

陸 敏(1993-)，女，主要從事衛(wèi)生毒理學(xué)研究。

R135.2

A

1005-9202(2017)09-2092-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.005

1 北京體育大學(xué)附屬醫(yī)院