持續(xù)性與間歇性低載荷機械振動對成骨細胞增殖與分化的影響

趙 濱 譚 磊 郝寶輝 王林祥 喬偉松 陳玉穎 劉 超 李 晨 朱 東

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院，吉林 長春 130021)

持續(xù)性與間歇性低載荷機械振動對成骨細胞增殖與分化的影響

趙 濱 譚 磊 郝寶輝 王林祥 喬偉松 陳玉穎1劉 超 李 晨 朱 東

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院，吉林 長春 130021)

目的 觀察不同低載荷振動方式對成骨細胞增殖與分化的影響。方法 應(yīng)用振動加載器給予培養(yǎng)的成骨細胞MC3T3-E1以強度為0.25 g、頻率35 Hz的振動載荷，設(shè)置空白組(A組)，持續(xù)振動10 min(B組)及振動5 min間歇5 min再振動5 min(C組)兩種加載模式組，加載結(jié)束后分別檢測各組MC3T3-E1細胞的增殖能力(CCK-8法)、堿性磷酸酶(ALP)活性及Runx-2蛋白的表達變化。結(jié)果 3組之間成骨細胞增殖情況無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.742)，B組與C組ALP活性及Runx-2蛋白的表達明顯高于A組，C組的ALP活性及Runx-2蛋白的表達顯著高于B組(P<0.05)。結(jié)論 低載荷機械振動對成骨細胞的增殖并無影響，然而低載荷機械振動可以促進成骨細胞的分化，特別是適當?shù)拈g歇低載荷機械振動能夠更加明顯的促進成骨細胞的分化。

持續(xù)性低載荷機械振動；間歇性低載荷振動；成骨細胞；增殖；分化

骨質(zhì)疏松引起的公共健康負擔一直居高不下，特別是低能量損傷使得老年骨質(zhì)疏松患者罹患骨折的風險增加，同時其引發(fā)的高殘障率和死亡率已成為一項嚴重的公共健康威脅〔1〕。目前為止，關(guān)于防治骨質(zhì)疏松的研究主要有以下幾個方面〔2～4〕：電刺激、低強度脈沖超聲波、體外沖擊波療法、高能震蕩波、高壓氧吸入、叩擊式骨應(yīng)力刺激儀、針刺療法、中藥熏洗加關(guān)節(jié)松動訓(xùn)練等，但這些方法的治療效果并非令人完全滿意且尚存在一定的爭議。研究表明，低載荷(頻率32～37 Hz，加速度0.2～0.3 g)振動能夠促進骨的生長并對抗骨質(zhì)疏松〔5～8〕。然而以上諸多研究都是通過各種不同的持續(xù)加載方式作用于研究對象，本研究將通過對成骨細胞施加間歇性的低載荷振動來研究間歇的加載是否會產(chǎn)生不同的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 小鼠成骨細胞株MC3T3-E1購買自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，α-MEM(HYCLONE，美國)，新生牛血清(杭州四季青生物公司)，CCK-8試劑盒(南京凱基生物有限公司)，堿性磷酸酶(ALP)活性檢測試劑盒(南京凱基生物有限公司)，Runx-2鼠單克隆抗體(Abcam，美國)，羊抗小鼠二抗(博奧森，北京)，GAPDH內(nèi)參(博奧森，北京)，一次性細胞培養(yǎng)板(Corning，美國)。

1.2 成骨細胞的培養(yǎng) 將成骨細胞接種于含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)瓶放置于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次，細胞生長至鋪滿培養(yǎng)瓶底部80%時按照1∶3傳代。

1.3 細胞加載與分組 待培養(yǎng)瓶中細胞生長至鋪滿培養(yǎng)瓶底部80%時，換成不含血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h以同步化細胞，然后將細胞消化，吹打均勻后用含血清培養(yǎng)基稀釋60倍接種于6孔空培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將接種于6孔板的細胞分為3組：空白組(A組)，持續(xù)振動10 min(B組)，振動5 min間歇5 min再振動5 min(C組)；其中B、C組均給予強度0.25 g，頻率35 Hz的振動載荷。

1.4 成骨細胞增殖檢測 分別檢測加載3、5、7 d時成骨細胞的增殖情況。將各組細胞消化后制成等體積的細胞混懸液，按照說明書檢測各組在450 nm處的吸光度。計算各組細胞活力，最終與A組相比。

1.5 成骨細胞ALP活性檢測 每天按照預(yù)定的加載方式加載成骨細胞，待觀測到細胞鋪滿培養(yǎng)板底面積的80%后終止加載。將成骨細胞消化、離心并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次。將離心好的細胞加入200 μl含0.1% Triton X-100細胞裂解液，吹打均勻，4℃裂解12 h，然后用超聲細胞破碎儀再次處理細胞。將處理好的樣本按照給定的操作步驟檢測各組ALP活性。

1.6 Runx-2蛋白表達的檢測 每天按照預(yù)定的加載方式加載成骨細胞，待觀測到細胞鋪滿培養(yǎng)板底面積的80%后終止加載。消化、洗滌并離心收集細胞。RIPA強效裂解液冰上裂解細胞20 min，15 000 r/min離心20 min后取上清，并檢測蛋白濃度。各組樣品加入上樣緩沖液100℃加熱10 min備用。配制分離膠及濃縮膠，每孔上樣20 μg蛋白樣本，電泳濃縮膠45 min，分離膠45 min，濕法轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，1∶1 000一抗4℃孵育過夜，充分洗膜3次，1∶5 000二抗室溫孵育1 h，充分洗膜3次后顯影。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS11.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 不同加載方式對成骨細胞增殖的影響 分別檢測各組在加載3、5、7 d后成骨細胞增殖情況(見圖1)。A、B、C 3組之間的細胞增殖相比差異并無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.742)。

圖1 不同加載方式對成骨細胞增殖的影響

2.2 不同加載方式對成骨細胞ALP活性及Runx-2蛋白表達的影響 B、C組在接受低載荷的振動加載后，ALP活性〔(9.51±1.05)U/ml、(16.70±1.44)U/ml〕及Runx-2(47 801、98 471)較A組〔(5.03±0.96)U/ml，35 673〕有明顯的升高(P<0.05)，C組明顯高于B組(P<0.05)。

3 討 論

老年性骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為一項嚴重威脅老年人健康的疾病，Rubin教授早期將低載荷機械振動用于骨科治療及康復(fù)領(lǐng)域，他通過大鼠、羊、火雞等動物實驗發(fā)現(xiàn)低載荷機械振動可以促進骨細胞生長，拓展了這種機械加載方法在治療骨科疾病方面的應(yīng)用價值〔5，8，9〕。

成骨細胞是在成骨過程中起調(diào)控作用的關(guān)鍵細胞〔10〕。在成骨過程中，成骨細胞的增殖與分化是兩個非常關(guān)鍵的步驟，本實驗研究結(jié)果顯示在成骨細胞增殖方面，A、B、C三組之間并未出現(xiàn)明顯的差異，然而關(guān)于力學(xué)加載對于成骨細胞增殖具體會產(chǎn)生哪種影響目前仍然存在爭議，但是我們認為產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能與細胞種類、力學(xué)加載類型有關(guān)，這仍需要進一步研究。ALP是成骨細胞分化的早期標志因子〔11〕，Runx-2蛋白被認為是調(diào)節(jié)骨平衡響應(yīng)機械負荷的關(guān)鍵因子〔12，13〕，因此通過檢測ALP及Runx-2的變化可以初步檢測成骨細胞的分化情況。我們的研究發(fā)現(xiàn)，C與B兩組在受到低載荷機械振動加載后，其ALP活性及Runx-2的表達均較A組有顯著升高，這與以往的研究吻合。

本研究結(jié)果的振動加載所產(chǎn)生的促進成骨細胞分化的效果優(yōu)于持續(xù)的振動加載。產(chǎn)生這種結(jié)果可能是因為成骨細胞在接受力學(xué)刺激一定時間后產(chǎn)生了疲勞或者是適應(yīng)，進而導(dǎo)致其不能進一步對力學(xué)信號產(chǎn)生響應(yīng)。當我們停止力學(xué)刺激一定時間后，成骨細胞得到休息不再疲勞或者是再次恢復(fù)其對力學(xué)刺激的敏感性，其后再次接受力學(xué)刺激后能夠再次響應(yīng)，較持續(xù)振動相同時間產(chǎn)生更明顯的效果，但是這種猜測需要深入研究。

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〔2016-09-09修回〕

(編輯 郭 菁)

國家自然科學(xué)基金資助(No.11432016,11272134,11602093)

朱 東(1941-)，男，教授，主要從事四肢骨折的治療骨生物力學(xué)研究。

趙 濱(1990-)，男，碩士，主要從事四肢骨折的治療骨生物力學(xué)研究。

R681

A

1005-9202(2017)09-2084-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.002

1 大連醫(yī)科大學(xué)