針康法對腦缺血大鼠神經(jīng)功能和缺血半暗區(qū)皮層血管內(nèi)皮生長因子受體表達(dá)的影響①

葉濤，唐 強(qiáng)，朱路文，陳慧杰，吳孝軍，李宏玉，田 源

針康法對腦缺血大鼠神經(jīng)功能和缺血半暗區(qū)皮層血管內(nèi)皮生長因子受體表達(dá)的影響①

葉濤1，唐 強(qiáng)2，朱路文2，陳慧杰2，吳孝軍1，李宏玉1，田 源1

目的觀察針康法對腦缺血大鼠神經(jīng)功能和缺血半暗區(qū)皮層血管內(nèi)皮生長因子受體Flt-1、Flk-1蛋白表達(dá)的影響。方法90只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分入假手術(shù)組、模型組、針刺組、康復(fù)組和針康組，每組再分為術(shù)后3 d、7 d、14 d三個亞組(n=6)。模型組、針刺組、康復(fù)組和針康組用線栓法制備永久性局灶性腦缺血模型。假手術(shù)組和模型組不進(jìn)行治療，針刺組采用頭穴叢刺針法治療，康復(fù)組給予跑臺訓(xùn)練，針康組采用頭穴叢刺結(jié)合跑臺訓(xùn)練治療。術(shù)后各時間點(diǎn)，采用改良神經(jīng)損害嚴(yán)重程度評分(mNSS)進(jìn)行評定，Western blotting法檢測缺血半暗區(qū)皮層Flt-1、Flk-1表達(dá)。結(jié)果與模型組比較，各治療組術(shù)后各時間點(diǎn)mNSS評分降低(P＜0.05)；術(shù)后7 d、14 d，與針刺組、康復(fù)組比較，針康組評分進(jìn)一步降低(P＜0.05)。與模型組比較，各治療組術(shù)后各時間點(diǎn)Flt-1、Flk-1蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)；與針刺組、康復(fù)組比較，針康組Flt-1、Flk-1蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高(P＜0.05)。結(jié)論針康法治療可進(jìn)一步改善腦缺血大鼠神經(jīng)行為，可能與其持續(xù)促進(jìn)缺血半暗區(qū)皮層Flt-1、Flk-1蛋白表達(dá)有關(guān)。

腦缺血；針康法；神經(jīng)功能；血管內(nèi)皮生長因子受體；Flt-1；Flk-1；大鼠

缺血性腦卒中約占全部腦卒中的70%，是由于栓塞、椎動脈和/或頸動脈閉塞或狹窄等因素造成腦部供血不足，引起腦組織缺血缺氧，導(dǎo)致局限性腦組織壞死的總稱，發(fā)病率、致殘率、致死率居高不下，并呈現(xiàn)年輕化趨勢[1]。針康法已經(jīng)廣泛運(yùn)用于腦卒中患者各類功能障礙的治療，臨床療效顯著，安全性和有效率得到大量臨床與基礎(chǔ)研究證實(shí)[2]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)/血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)是新生血管和側(cè)支循環(huán)形成所必須的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1)表達(dá)的上調(diào)，可增強(qiáng)VEGF促血管新生、細(xì)胞分化與神經(jīng)營養(yǎng)再生等效應(yīng)[3-5]。本研究觀察針康法對腦缺血大鼠神經(jīng)功能及缺血半暗區(qū)皮層Flt-1和Flk-1蛋白表達(dá)的影響，探討針康法神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠，初始體質(zhì)量(250±20)g，鼠齡10～12周，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心提供，合格證書編號SYXK(黑) 2010007。飼養(yǎng)條件：溫度23～25℃，濕度55%～65%，12 h明暗交替。實(shí)驗(yàn)前所有大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周及跑臺訓(xùn)練3 d(15 m/min，30 min/d)，篩選可完成跑臺訓(xùn)練方案的大鼠90只。實(shí)驗(yàn)過程中大鼠的處置嚴(yán)格遵守動物倫理準(zhǔn)則和指南的相關(guān)規(guī)定。

將90只大鼠編號，計算機(jī)生成含90個數(shù)的隨機(jī)數(shù)字表，任意選擇表中一個數(shù)為起始點(diǎn)對應(yīng)大鼠編號1，從左至右，自上而下分別對應(yīng)1～90號大鼠。用隨機(jī)數(shù)字除以5得余數(shù)確定每只大鼠的分組，余數(shù)0、1、2、3、4分別對應(yīng)假手術(shù)組、模型組、針刺組、康復(fù)組及針康組，各組均有18只大鼠；同法將18只大鼠再分入3 d、7 d、14 d三個亞組(n=6)。

造模失敗或死亡大鼠另選大鼠補(bǔ)充。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

Flt-1、Flk-1多克隆抗體：SANTA CRUZ公司。預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)：FERMENTAS公司。TEMED：AMRESCO公司。PVDF膜：MILLIPORE公司。羊抗兔IgG-HRP：BEYOTIME公司。β-actin抗體：WANLEIBIO公司。

ZH-PT型動物實(shí)驗(yàn)跑臺：安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司。Multiskan FC型酶標(biāo)儀：THERMO公司。3K-18高速冷凍離心機(jī)：SIGMA公司。DYCZ-24DN型蛋白凝膠電泳儀、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)印電泳儀、DYY-7C型電泳儀電源、WD-9405B型脫色搖床：北京六一儀器廠。BIS910凝膠成像分析系統(tǒng)：北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。微量移液器：THERMO公司。

1.3 模型制備

參考Longa法[6]及前期實(shí)驗(yàn)研究[7]制備永久性腦缺血大鼠模型。術(shù)前12 h禁食。10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。頸部備皮，碘伏消毒后頸正中切口，暴露大鼠右側(cè)頸總、頸外及頸內(nèi)動脈。結(jié)扎頸外、頸總動脈，用微動脈夾阻閉分叉處血流，在其下面3～5 mm處用2 ml注射器針頭斜刺一個“V”形小口；將頭端2 mm過蠟、長3 cm的魚線送入血管，備活結(jié)以固定線栓；松開動脈夾，將魚線送入頸內(nèi)動脈，阻斷大腦中動脈血流。將活結(jié)扎死以固定線栓。消毒，逐層縫合。

假手術(shù)組大鼠不插入線栓，其余操作相同。

術(shù)后1 d，采用Longa 5級4分制標(biāo)準(zhǔn)[6]篩選模型，1～3分大鼠納入實(shí)驗(yàn)。

1.4 方法

假手術(shù)組及模型組術(shù)后回籠飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何治療，只給予同等條件抓取。

針刺組于術(shù)后1 d，采用頭穴叢刺針法治療，每天1次。取百會穴及其左、右各旁開2 mm處，用直徑0.25 mm、長25 mm針灸針進(jìn)行叢刺，快速捻轉(zhuǎn)1 min后留針2 h[7]。

康復(fù)組于術(shù)后1 d進(jìn)行跑臺訓(xùn)練，每次30 min，每天1次。坡度0°，速度：第1～3天8 m/min，第4～7天12 m/min，第7天后15 m/min[7]。

針康組于術(shù)后1 d行針康法治療，每天1次。頭穴叢刺針留針期間進(jìn)行跑臺訓(xùn)練，頭穴叢刺方案與跑臺訓(xùn)練方案同針刺組與康復(fù)組。

1.5 神經(jīng)行為學(xué)評估

術(shù)后各時間點(diǎn)，大鼠干預(yù)結(jié)束后，采用改良神經(jīng)損害嚴(yán)重程度評分(modified Neurologic Severity Score,mNSS)[8]評估大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況。見表1。

表1 mNSS評分標(biāo)準(zhǔn)

1.6 Western blotting

mNSS評分結(jié)束后，大鼠10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，冰板上快速斷頭取腦，剝離大腦中動脈梗死周邊皮層缺血組織，液氮速凍5 min，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

取一定量標(biāo)本，加入RIPA裂解液、PMSF制成蛋白勻漿，低溫孵育5 min，12000 r/min、4℃離心10 min，取上清液。BCA法測定上清液中蛋白質(zhì)總濃度，上樣體積20 μl，含蛋白50 μg。10%SDS-PAGE電泳分離目的蛋白(80 V,2.5 h)，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(70 V,1.5 h)。TTBS緩沖液配制的5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，將膜放入Flt-1(1∶200)、Flk-1(1∶200)一抗中，4℃過夜。加入已羊抗兔IgG-HRP(1∶5000)二抗，37℃孵育45 min，TBST洗膜，加入ECL發(fā)光孵育5 min，顯影，凝膠成像儀照相記錄，用Gel-Pro Analyzer 4.0對反應(yīng)條帶進(jìn)行定量分析，計算相對灰度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，mNSS評分與Flt-1、Flk-1蛋白相對表達(dá)量均以(xˉ±s)表示，各時間點(diǎn)組間比較采用單因素方差分析，事后兩兩比較采用LSD t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 mNSS

各時間點(diǎn)，假手術(shù)組mNSS評分均為0；與假手術(shù)組比較，模型組評分升高(P＜0.05)；與模型組比較，針刺組、康復(fù)組、針康組評分均降低(P＜0.05)。術(shù)后7 d、14 d，與針刺組、康復(fù)組比較，針康組mNSS評分降低(P＜0.05)。見表2。

表2 各組各時間點(diǎn)mNSS評分比較

2.2 Flt-1

各時間點(diǎn)，假手術(shù)組Flt-1蛋白少量表達(dá)；模型組較假手術(shù)組Flt-1蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)；與模型組比較，針刺組、康復(fù)組、針康組Flt-1蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)；與針刺組、康復(fù)組比較，針康組Flt-1蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高(P＜0.05)。見表3、圖1。

表3 各組各時間點(diǎn)Flt-1蛋白表達(dá)

圖1 各組各時間點(diǎn)Flt-1蛋白表達(dá)

2.3 Flk-1

各時間點(diǎn)，假手術(shù)組Flk-1蛋白少量表達(dá)；模型組較假手術(shù)組Flk-1蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)；與模型組比較，針刺組、康復(fù)組、針康組Flk-1蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)；與針刺組、康復(fù)組比較，針康組Flk-1蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高(P＜0.05)。見表4、圖2。

表4 各組各時間點(diǎn)Flk-1蛋白表達(dá)

3 討論

針康法是基于腦卒中后各類功能障礙創(chuàng)立的針、康一體化治療體系，是中醫(yī)康復(fù)方法與現(xiàn)代康復(fù)技術(shù)有機(jī)融合，具有“針康同步、動態(tài)治療、整體康復(fù)”治療優(yōu)勢[2]。前期我們借助現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)手段，在神經(jīng)血管單元的框架內(nèi)，從突觸重塑、神經(jīng)血管再生、細(xì)胞凋亡及內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞等角度闡釋針康法干預(yù)效應(yīng)的機(jī)理，取得一系列研究成果[2,9-16]，但針康法腦保護(hù)作用機(jī)制并不局限于此，仍有待進(jìn)一步闡明。

mNSS從運(yùn)動、感覺、平衡、反射缺損及異?；顒铀膫€方面評定神經(jīng)功能。本研究顯示，針康法可加速神經(jīng)功能的恢復(fù)，優(yōu)于單一頭穴叢刺或康復(fù)治療，且遠(yuǎn)期的神經(jīng)功能預(yù)后更佳，充分體現(xiàn)兩者有機(jī)結(jié)合的優(yōu)勢，與我們此前的研究一致。

圖2 各組各時間點(diǎn)Flk-1蛋白表達(dá)

血管發(fā)生是指從原有的血管上生出新的毛細(xì)血管，是缺血后腦組織再次獲得氧和營養(yǎng)的自然保護(hù)機(jī)制，可減輕缺血性腦損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。VEGF作為機(jī)體內(nèi)最重要的促血管生長因子，不僅可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加血管通透性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和浸潤，促進(jìn)新生血管和側(cè)支循環(huán)形成，還能直接作用于皮質(zhì)、海馬和小腦等各部位神經(jīng)細(xì)胞，發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)再生、神經(jīng)保護(hù)和細(xì)胞分化等功能[3,5,17-18]。研究證實(shí)[5,19-22]，VEGF通過與其主要受體Flt-1和Flk-1結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。腦缺血后，因低氧、缺血刺激，VEGF/VEGFR系統(tǒng)被激活，誘導(dǎo)大量新生血管形成，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立，使缺血腦組織得以重新灌注，改善組織缺氧與營養(yǎng)供應(yīng)，從而減少神經(jīng)元凋亡或死亡，降低腦損傷程度，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。劉娟等[23]發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯對大鼠局灶性腦缺血損傷的治療作用與增強(qiáng)VEGF及Flk-1表達(dá)有關(guān)。

前期我們已經(jīng)證實(shí)，針康法可以促進(jìn)缺血半暗區(qū)VEGF蛋白表達(dá)，促進(jìn)腦缺血后微血管再生[13]。本研究顯示，腦缺血后，腦組織通過上調(diào)缺血半暗區(qū)Flt-1、Flk-1蛋白表達(dá)，參與調(diào)節(jié)VEGF介導(dǎo)的微血管重建、神經(jīng)再生和神經(jīng)元存活過程。雖然Flt-1、Flk-1蛋白表達(dá)在時間分布上高度一致，但Flk-1表達(dá)強(qiáng)度高于Flt-1，這可能與Flk-1是VEGF促內(nèi)皮細(xì)胞有絲分化、血管新生等功能的主要調(diào)節(jié)者，而Flt-1側(cè)重于損傷區(qū)微循環(huán)重建，促進(jìn)病理性血管發(fā)生與管腔成形

過程有關(guān)[3,24-25]。針刺、康復(fù)治療介入后，F(xiàn)lt-1、Flk-1表達(dá)明顯上調(diào)，促進(jìn)、維持VEGF促血管新生、神經(jīng)元存活和神經(jīng)營養(yǎng)再生過程[13-14]；而針康法治療后，F(xiàn)lt-1、Flk-1蛋白表達(dá)水平始終高于單一針刺或康復(fù)治療，且14 d時仍有較高表達(dá)。

綜上所述，針康法治療可進(jìn)一步改善腦缺血大鼠神經(jīng)行為，可能與其持續(xù)促進(jìn)缺血半暗區(qū)皮層Flt-1、Flk-1蛋白表達(dá)，正向調(diào)控VEGF促血管新生、神經(jīng)元存活和神經(jīng)營養(yǎng)再生過程，促進(jìn)缺血區(qū)微血管重建，加快神經(jīng)功能恢復(fù)有關(guān)。

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Effects of Acupuncture-rehabilitation Therapy on Neurological Function and Expression of Vascular Endothelial Growth Factor Receptors,Flt-1 and Flk-1,after Focal Cerebral Ischemia in Rats

YE Tao1,TANG Qiang2,ZHU Lu-wen2,CHEN Hui-jie2,WU Xiao-jun1,LI Hong-yu1,TIAN Yuan1
1.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150040,China;2.the Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150001,China

TANG Qiang.E-mail:tangqiang1963@163.com

Objective To explore the effect of acupuncture-rehabilitation therapy on neurological function and expression of Flt-1 and Flk-1,members of vascular endothelial growth factor receptors,after permanent focal cerebral ischemia in rats.Methods Ninety male Sprague-Dawley rats were divided into five groups,namely sham group,model group,acupuncture group,rehabilitation group and acupuncture-rehabilitation group,and each group was further divided into 3-day,7-day and 14-day subgroups,equally.Their middle cerebral arteries were occluded except those of sham group.The sham and model groups accepted no treatment,while the acupuncture group accepted cluster needling of scalp acupuncture,the rehabilitation group accepted treadmill training,and the acupuncture-rehabilitation group accepted both acupuncture and treadmill training.They were assessed with modified Neurologic Severity Score(mNSS)3,7 and 14 days after modeling,while the expression of Flt-1 and Flk-1 were determined with Western blotting.Results The mNSS score reduced in all the treatment groups(P＜0.05)compared with that of the model group at every time point,and was the least in the acupuncture-rehabilitation group(P＜0.05)7 and 14 days after modeling among the treatment groups.Meanwhile,the expression of Flt-1 and Flk-1 protein increased in all the treatment groups(P＜0.05),and was the most in the acupuncture-rehabilitation group(P＜0.05).Conclusion Acupuncture-rehabilitation therapy can promote the neurological function recovery in rat with permanent focal cerebral ischemia,which may be associated with the continuous inducement of Flt-1,Flk-1 protein expression in ischemic penumbra cortex.

cerebral ischemia;acupuncture-rehabilitation therapy;neurological function;vascular endothelial growth factor receptors; Flt-1;Flk-1;rats

R743.3

A

1006-9771(2017)05-0520-05

2017-01-25

2017-02-21)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.05.006

1.國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81273818;No.81473762)；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)領(lǐng)軍人才計劃項(xiàng)目(No.2012RCL02)。

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱市150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市150001。作者簡介：葉濤(1989-)，男，漢族，福建漳平市人，博士研究生，主要研究方向：腦卒中中醫(yī)康復(fù)基礎(chǔ)與臨床研究。通訊作者：唐強(qiáng)(1963-)，男，漢族，四川大竹縣人，博士，教授，主要研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)疾病中醫(yī)康復(fù)基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail:tangqiang1963@163.com。[本文著錄格式]葉濤，唐強(qiáng)，朱路文，等.針康法對腦缺血大鼠神經(jīng)功能和缺血半暗區(qū)皮層血管內(nèi)皮生長因子受體表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(5):520-524.

CITED AS:Ye T,Tang Q,Zhu LW,et al.Effects of acupuncture-rehabilitation therapy on neurological function and expression of vascular endothelial growth factor receptors,Flt-1 and Flk-1,after focal cerebral ischemia in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017, 23(5):520-524.