脂多糖對大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞Ski蛋白表達(dá)的影響①

趙 鑫，郭永強(qiáng)，王 明，陳鐵戈，伍亞民，張海鴻

·基礎(chǔ)研究·

脂多糖對大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞Ski蛋白表達(dá)的影響①

趙 鑫1,2，郭永強(qiáng)1,2，王 明1,2，陳鐵戈1,2，伍亞民3，張海鴻1

目的探討內(nèi)毒素脂多糖對大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞ski蛋白表達(dá)規(guī)律及胞定位的影響。方法新生3 d內(nèi)Sprague-Dawley大鼠，取大腦皮質(zhì)分離星形膠質(zhì)細(xì)胞，體外培養(yǎng)。采用0 μg/ml、0.001 μg/ml、0.01 μg/ml、0.1 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml脂多糖誘導(dǎo)6 h；采用0.1 μg/ml脂多糖誘導(dǎo)0 d、2 d、4 d、6 d、8 d。Western blotting法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞中ski蛋白的表達(dá)，間接免疫熒光雙標(biāo)法檢測ski在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的定位。結(jié)果0.1 μg/ml脂多糖誘導(dǎo)下，ski蛋白表達(dá)最高(F=46.656,P＜0.001)。0.1 μg/ ml脂多糖誘導(dǎo)4 d時(shí)最高，6 d時(shí)逐漸降低。在無脂多糖誘導(dǎo)及脂多糖誘導(dǎo)6 d時(shí)，ski蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核；脂多糖誘導(dǎo)2 d、4 d時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)ski表達(dá)。結(jié)論脂多糖可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞ski蛋白表達(dá)，可能參與炎癥反應(yīng)。

ski蛋白；脂多糖；炎癥；星形膠質(zhì)細(xì)胞；大鼠

ski作為進(jìn)化保守蛋白，最早被發(fā)現(xiàn)存在于Sloan-Kettering病毒基因組中，有特異的結(jié)構(gòu)功能[1]。近年來，關(guān)于ski在不同系統(tǒng)或組織中的作用及機(jī)制研究較多。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，ski在脊髓損傷、肝臟再生、多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、血管平滑肌的增殖及創(chuàng)口愈合等領(lǐng)域發(fā)揮重要的調(diào)控作用[2]。

星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)中重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，是脊髓損傷后炎癥因子釋放的主要來源，在CNS病變時(shí)被活化而發(fā)揮損傷和修復(fù)雙重作用[3-5]。在炎癥、損傷的免疫應(yīng)激反應(yīng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生明顯的活化，并合成和分泌一系列細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)[6-8]。ski在成纖維細(xì)胞中，可以降低炎癥細(xì)胞因子的水平，發(fā)揮抗炎作用[9]。本研究觀察脂多糖致炎作用下[10]，星形膠質(zhì)細(xì)胞中ski蛋白的表達(dá)規(guī)律及定位特征。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑

3日齡內(nèi)Sprague-Dawley大鼠，購于甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。

DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶：GIBCO公司。胎牛血清(FBS)：PAN-BIOTECH GMBH公司。脂多糖、TritionX-100、SDS、小鼠抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)多克隆抗體(G3893)：SIGMA公司。RIPA裂解液和BCA蛋白定量檢測試劑盒：碧云天公司。ski(H-329，sc-9140)：SANTA CRUZ公司。小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體：PROTEINTECH公司。山羊抗小鼠lgG、FITC標(biāo)記山羊抗兔lgG：SOLARBIO公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔或抗小鼠lgG：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。山羊封閉血清、PVDF膜(0.45 μm)：SOLARBIO公司。ECL試劑盒：MILLOPORE公司。

1.2 方法

1.2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的提取、純化及體外培養(yǎng)

大鼠75%酒精浸泡，-20℃冰箱冷凍麻醉5 min。無菌快速取出雙側(cè)大腦皮質(zhì)，放入DMEM/F12液中，漂洗2遍。眼科尖鑷仔細(xì)剝離腦膜，置盛有胰酶的皿器中，剪碎腦皮質(zhì)，用吸管輕柔吹打至組織塊消散。置37℃溫箱充分消化3 min。移至15 ml離心管中，加完全培養(yǎng)液(含12%FBS的DMEM/F12)3 ml，1500 r/min離心8 min。棄上清液，再加入完全培養(yǎng)基4 ml，制成細(xì)胞懸液。移至培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育。每3天換液，培養(yǎng)6～8 d，待細(xì)胞融合貼滿瓶壁，封口后置37℃恒溫旋轉(zhuǎn)搖床210 r/min離心，除去懸浮細(xì)胞和貼壁不牢的細(xì)胞，6 h后取出，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定

采用GFAP多克隆抗體對純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色(詳見1.4)。熒光顯微鏡高倍視野(200×)下隨機(jī)選取5個視野計(jì)數(shù)，GFAP陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)96%以上，符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.2.3 細(xì)胞分組及培養(yǎng)

將處于對數(shù)生長期的星形膠質(zhì)細(xì)胞分為7組，分別加入0 μg/ml、0.001 μg/ml、0.01 μg/ml、0.1 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml脂多糖培養(yǎng)6 h。將處于對數(shù)生長期的星形膠質(zhì)細(xì)胞再次分為5組，加入0.1 μg/ml脂多糖培養(yǎng)0 d、2 d、4 d、6 d、8 d。各組均設(shè)3個皿。

1.3 Western blotting

收集各組細(xì)胞提取蛋白。用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2遍，RIPA裂解液裂解30 min，細(xì)胞刮匙刮下細(xì)胞，4℃、14000 r/min離心15 min，收集上清液，加入蛋白上樣液30 μl(上清液的1/3)，煮沸3 min。BCA試劑盒測定總蛋白濃度，-80℃冰箱保存待用。

提取的蛋白質(zhì)行10%SDS-PAGE電泳，濃縮膠90 V，分離膠120 V；電轉(zhuǎn)至甲醇浸透的PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST(含10 mmol/L Tris-HCI、150 mmol/L NaCI、0.5%Tween 20，pH= 7.5)洗滌10 min，共3遍；加兔抗大鼠ski多克隆抗體(1∶100)、小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(1∶5000)，4℃冰箱過夜；TBST洗膜10 min，共3遍；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或抗小鼠lgG(1∶5000)，室溫下2 h；TBST洗膜10 min，共3遍；滴加ECL發(fā)光液，GE凝膠成像系統(tǒng)測量各目的條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin蛋白灰度值之比。

1.4 免疫熒光染色

將原代細(xì)胞接種到蓋玻片上，貼壁后加0.1 μg/ml脂多糖0 d、2 d、4 d、6 d、8 d，PBS洗2遍，多聚甲醛固定30 min，PBS洗2遍，TritionX-100通透20 min，PBS洗2遍。滴加山羊封閉血清，37℃封閉30 min；吸凈封閉液，勿洗，加入小鼠抗大鼠GFAP多克隆抗體(1∶300)、兔抗大鼠ski多克隆抗體(1∶100)。玻片置于濕盒中，4℃冰箱過夜。PBS洗2遍，避光加山羊抗小鼠lgG(1∶300)、FITC標(biāo)記山羊抗兔lgG(1∶300)，37℃溫箱避光孵育90 min。PBS洗2遍，避光下加DAPI，室溫孵育20 min；PBS洗2遍。甘油封片。熒光顯微鏡下觀察。陰性對照用PBS代替一抗。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行處理。每組數(shù)據(jù)來自3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，以(xˉ±s)表示，采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及純度鑒定

倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞傳代培養(yǎng)12 h后基本貼壁生長，可見細(xì)胞突起較多，且胞突之間有交叉連接，胞體呈星形(圖1)。活化的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，如胞體肥大，胞突增粗、形狀不規(guī)則等。

免疫熒光化學(xué)染色后，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞核呈圓形或橢圓形。GFAP陽性細(xì)胞(圖2)占總細(xì)胞數(shù)的百分比平均值96%(n=5)。

2.2 不同濃度脂多糖下ski蛋白表達(dá)

與0 μg/ml脂多糖組相比，不同濃度脂多糖均誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)ski蛋白，當(dāng)濃度為0.1 μg/ml時(shí)，ski蛋白表達(dá)最高(P＜0.001)。見圖3。

2.3 脂多糖誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞ski蛋白表達(dá)的時(shí)相變化

0.1 μg/ml脂多糖誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞ski的表達(dá)具有時(shí)間依賴性，4 d時(shí)達(dá)到高峰(P＜0.001)，6 d時(shí)降低，但仍高于0 d組。見圖4。

圖1 星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)(倒置顯微鏡,200×)

圖2 GFAP陽性細(xì)胞(免疫熒光染色,200×)

圖3 不同濃度脂多糖下星形膠質(zhì)細(xì)胞ski蛋白表達(dá)

圖4 脂多糖誘導(dǎo)不同時(shí)間星形膠質(zhì)細(xì)胞ski蛋白表達(dá)

2.4 ski在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的定位

0 d組ski蛋白呈低表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞核，胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)較少。0.1 μg/ml脂多糖誘導(dǎo)2 d后，胞核內(nèi)ski蛋白表達(dá)增高，胞質(zhì)內(nèi)ski蛋白增加不明顯；誘導(dǎo)4 d后，細(xì)胞突起明顯增粗，細(xì)胞形態(tài)由星形轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮紊踔灵L桿狀，體積增大，且ski蛋白在胞核與胞質(zhì)中表達(dá)均增加；誘導(dǎo)6 d后，ski蛋白在胞質(zhì)與胞核中的表達(dá)又逐漸降低，且胞質(zhì)降低更多。見圖5～圖9。

圖5 脂多糖誘導(dǎo)0 d時(shí)ski在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)(免疫熒光染色，400×)

圖6 脂多糖誘導(dǎo)2 d時(shí)ski在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)(免疫熒光染色，400×)

圖7 脂多糖誘導(dǎo)4 d時(shí)ski在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)(免疫熒光染色，400×)

圖8 脂多糖誘導(dǎo)6 d時(shí)ski在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)(免疫熒光染色，400×)

圖9 脂多糖誘導(dǎo)8 d時(shí)ski在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)(免疫熒光染色，400×)

3 討論

脊髓損傷可分為原發(fā)性和繼發(fā)性[11]。其中繼發(fā)性損傷是在原發(fā)性損傷基礎(chǔ)上，通過一系列病理生理反應(yīng)，如炎癥、氧化應(yīng)激、神經(jīng)毒素釋放等，致使損傷區(qū)域發(fā)生自發(fā)性破壞性病變，進(jìn)一步加重脊髓損傷程度，擴(kuò)大損傷區(qū)域[12-13]。

炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性脊髓損傷的重要因素[14]，是星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生、膠質(zhì)瘢痕形成、細(xì)胞壞死及失神經(jīng)功能進(jìn)行性發(fā)展的重要機(jī)制[15]。脂多糖作為Gram陰性菌細(xì)胞壁的主要組分，可觸發(fā)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)，是公認(rèn)的致炎劑[16-18]。脂多糖可以與Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)結(jié)合發(fā)揮其致炎作用，星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上存在TLR4[18]。本研究采用脂多糖誘導(dǎo)，體外模擬炎癥反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞。

本研究結(jié)果顯示，脂多糖誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞ski蛋白表達(dá)具有濃度依賴性，在0.001～0.1 μg/ml濃度下，ski蛋白表達(dá)濃度依賴性上升；更高濃度下，ski蛋白表達(dá)濃度依賴性下降。同時(shí)，脂多糖誘導(dǎo)ski蛋白表達(dá)具有時(shí)間依賴性：在0.1 μg/ml脂多糖誘導(dǎo)下，ski在4 d時(shí)達(dá)到峰值。

星形膠質(zhì)細(xì)胞對脂多糖及脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞因子免疫應(yīng)答過程中，發(fā)生明顯活化，并通過炎癥放大和形成膠質(zhì)瘢痕參與脊髓損傷及神經(jīng)退行性變等過程[19-21]。研究顯示[9]，ski在成纖維細(xì)胞中可以通過降低炎癥細(xì)胞因子水平來發(fā)揮抗炎作用。另有研究顯示[22]，ski對轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)通路起負(fù)性調(diào)控作用；而TGF-β通路廣泛調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)、神經(jīng)退行性變等病理生理過程[23]。

本研究顯示，在正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中，ski主要表達(dá)于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)較少；脂多糖誘導(dǎo)2 d時(shí)，ski蛋白表達(dá)上調(diào)，且胞質(zhì)中也開始表達(dá)增多；在脂多糖誘導(dǎo)時(shí)間延長至6 d時(shí)，胞質(zhì)中ski蛋白表達(dá)又逐漸降低。蛋白質(zhì)的功能通常與其亞細(xì)胞定位相關(guān)，通過炎癥刺激前后ski蛋白亞定位的變化，我們推測，ski在炎癥反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞活化過程中起重要調(diào)控作用。

在星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程中，ski蛋白表達(dá)上調(diào)，結(jié)合本課題組前期研究[24]，ski在脊髓損傷后的表達(dá)規(guī)律與GFAP表達(dá)規(guī)律高度一致，而GFAP作為星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白[25]，其表達(dá)程度可反映星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度[26]，提示ski參與星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)活化過程。

綜上所述，ski在炎癥反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，推測ski可作為炎性反應(yīng)蛋白參與星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)過程。

深入研究ski在星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程中的作用，將為治療神經(jīng)炎癥尋找新的干預(yù)靶點(diǎn)。ski在星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程過表達(dá)的相關(guān)機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

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Effect of Lipopolysaccharide on Ski Expression in Rats'Astrocytes

ZHAO Xin1,2,GUO Yong-qiang1,2,WANG Ming1,2,CHEN Tie-ge1,2,WU Ya-min3,ZHANG Hai-hong1
1.Department of Orthopedics,the Second Clinical Medical College of Lanzhou University,Lanzhou,Gansu 730030,China;2.Key Laboratory of Orthopedics of Gansu Province,Lanzhou,Gansu 730030,China;3.State Key Laboratory of Trauma,Burns and Combined Injury,the Third Department of Research Institute of Surgery,Daping Hospital, Third Military University,Chongqing 400042,China

ZHANG Hai-hong.E-mail:zhanghaihong1968@sina.com

Objective To explore how and where ski expresses under lipopolysaccharide(LPS)in rats'astrocytes.Methods Astrocytes were obtained from cerebral cortex of a newborn(within 3 days)Sprague-Dawley rat and cultured in vitro.Astrocytes were cultured with LPS in concentration of 0 μg/ml,0.001 μg/ml,0.01 μg/ml,0.1 μg/ml,1 μg/ml,10 μg/ml and 100 μg/ml for six hours;and cultured with LPS in concentration of 0.1 μg/ml for 0 day,2 days,4 days,6 days and 8 days.The level of ski was determined with Western blotting,and the location of ski was detected with indirect immunofluorescent staining.Results The expression of ski was induced by LPS,especially in the concentration of 0.1 μg/ml.The expression of ski induced with 0.1 μg/ml LPS peaked at 4 days of inducement and then decreased.Ski was mainly observed in nuclear in the normal astrocytes and the astrocytes induced with 0.1 μg/ml LPS for 6 days.However,it was observed in cytoplasm 2 and 4 days of inducement.Conclusion LPS could induce the expression of ski in rats'astrocytes,which may participate in inflammation.

ski;lipopolysaccharide;inflammation;astrocyte;rats

R364.5

A

1006-9771(2017)05-0514-06

2017-02-13

2017-03-13)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.05.005

[本文著錄格式]趙鑫，郭永強(qiáng)，王明，等.脂多糖對大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞ski蛋白表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23 (5):514-519.

CITED AS:Zhao X,Guo YQ,Wang M,et al.Effect of lipopolysaccharide on ski expression in rats'astrocytes[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(5):514-519.

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30772299)。

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅蘭州市730030；2.甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州市730030；3.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所三室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市400042。作者簡介：趙鑫(1991-)，男，漢族，山東濰坊市人，碩士研究生，主要研究方向：脊柱脊髓損傷。通訊作者：張海鴻，主任醫(yī)師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：脊柱外科。E-mail:zhanghaihong1968@sina.com。