茶樹菇菌種固體培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

繆 靜 孫 磊 李維煥 程顯好*

（1魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264025；2魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東煙臺(tái)264025）

茶樹菇（Agrocybe cylindracea），又稱茶薪菇，是一種生長于亞熱帶地區(qū)的土生木腐菌，其蓋肥柄脆，營養(yǎng)極其豐富，蛋白質(zhì)含量高達(dá)19.55%，且具備人體必需的8種氨基酸，并且有豐富的B族維生素和鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、鋅等營養(yǎng)元素。研究表明茶樹菇具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力、抗腫瘤、降血脂等作用，因此又具有較高的藥用價(jià)值，是一種極具開發(fā)潛力的珍稀食藥用菌[1]。

菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，目前行業(yè)中大多以PDA培養(yǎng)基作為菌種擴(kuò)繁的主要培養(yǎng)基，但不同種類的菌種有其各自適宜的生長環(huán)境。筆者對茶樹菇菌種的固體培養(yǎng)條件進(jìn)行了初步的探索，以菌落直徑法[2-5]和菌絲干重法[6-7]為主要評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化了培養(yǎng)基、溫度、pH等培養(yǎng)條件。研究為茶樹菇菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料①供試菌株：茶樹菇LA006，由魯東大學(xué)菌物科學(xué)技術(shù)研究院菌種室保存。②培養(yǎng)基：GPY固體培養(yǎng)基（L） 葡萄糖20 g，蛋白胨6 g，酵母膏10 g，瓊脂10 g，pH 6.0。

PDA固體培養(yǎng)基（L） 馬鈴薯200 g（煮汁），葡萄糖20 g，瓊脂10 g，pH 6.0。

GPC固體培養(yǎng)基（L） 葡萄糖20 g，蛋白胨6 g，玉米漿10 g，瓊脂10 g，pH 6.0。

麥芽汁固體培養(yǎng)基（L） 每升麥芽汁（固形物5.0%）中加入瓊脂10 g，pH 6.0。

胡蘿卜固體培養(yǎng)基（L） 胡蘿卜200 g（煮汁），葡萄糖20 g，瓊脂10 g，pH 6.0。

麩皮固體培養(yǎng)基（L） 麩皮30 g（煮汁），葡萄糖20 g，K2HPO43 g，MgSO41.5 g，瓊脂10 g，pH 6.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 無菌條件下，將保存的茶樹菇菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，25℃避光培養(yǎng)5～7 d，備用。將活化后的斜面菌種接種于平板的正中央，25℃避光培養(yǎng)9～10 d，備用。

1.2.2 培養(yǎng)基和pH篩選 培養(yǎng)基見1.1。設(shè)置pH分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0六個(gè)梯度。培養(yǎng)溫度為25℃，每個(gè)梯度做三個(gè)平行樣。分別用菌落直徑法和菌絲干重法測定各處理?xiàng)l件下菌絲生長情況。

1.2.3 溫度篩選 培養(yǎng)溫度分別設(shè)置19℃、22℃、25℃、28℃、31℃五個(gè)梯度，在pH6.0條件下，于GPY培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。每個(gè)溫度梯度做三個(gè)平行樣。用菌落直徑法和生物量法分別測定不同溫度條件下菌絲的生長狀況，并進(jìn)行比較。

1.3 測定方法

1.3.1 菌落直徑測定法 無菌條件下，將活化后平板培養(yǎng)的菌絲用5 mm打孔器沿著外周打孔，取生長最旺盛的平板菌落邊緣菌絲塊，在平板上鋪一層滅菌玻璃紙，然后將菌塊接到六種已鋪好玻璃紙的培養(yǎng)基正中央，定期測量菌落直徑大小，每個(gè)平板分別用直尺沿平板底部相互垂直的兩個(gè)方向測量，取平均值。

1.3.2 菌絲生物量測定法 打孔器取種接種方法同1.3.1。定期進(jìn)行測量。每次取每種培養(yǎng)基的3個(gè)平板進(jìn)行測量，將鋪在培養(yǎng)基上的玻璃紙揭下來，將菌絲仔細(xì)刮下，置于干燥箱中60℃烘干至恒重，用電子天平稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基及pH對菌絲生長的影響比較培養(yǎng)至第11天時(shí)，不同培養(yǎng)基及pH下的菌絲生長量，結(jié)果見表1、2。

以菌落直徑法測定結(jié)果（表1）可以看出，茶樹菇菌絲在六種培養(yǎng)基上都能生長，且生長相對較快；總體上，麥芽汁培養(yǎng)基上菌絲生長速度最快，PDA培養(yǎng)基上菌絲生長速度是相對較慢。

由表1可知，麥芽汁培養(yǎng)基茶樹菇菌絲生長速度與其他幾種培養(yǎng)基條件下菌絲生長速度差異顯著；麩皮培養(yǎng)基的菌絲的生長速度僅次于麥芽汁培養(yǎng)基菌絲的生長速度，且與其他幾種培養(yǎng)基差異極顯著。

由表2可以看出，GPY培養(yǎng)基上茶樹菇菌絲的生物量明顯高于其他幾種培養(yǎng)基上菌絲的生物量；菌絲在不同培養(yǎng)基上生物量的積累量總體表現(xiàn)為GPY＞GPC＞麩皮＞PDA＞胡蘿卜＞麥芽汁。

同時(shí)，GPY培養(yǎng)基條件下菌絲的生物量與其他幾種培養(yǎng)基條件下菌絲的生物量達(dá)到極顯著的差異。

不同pH對茶樹菇菌絲生長的影響（表1）總體上，pH6.5-pH7條件下菌絲生長速度相對較快，說明這一pH范圍內(nèi)適合菌絲的生長；同樣pH6.5麥芽汁培養(yǎng)基，菌絲生長速度最快，因此，應(yīng)選擇這一條件作為菌絲生長的最適培養(yǎng)條件；不同培養(yǎng)基上菌絲的生長速度大致表現(xiàn)為麥芽汁＞麩皮＞GPY＞GPC＞胡蘿卜＞PDA；在麥芽汁培養(yǎng)基上，不同pH條件下菌絲的生長速度總體表現(xiàn)為pH6.5＞pH5.5＞pH7＞pH6＞pH5＞pH4.5，隨pH升高，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

對不同pH條件下菌絲生長（菌落直徑）進(jìn)行差異分析，結(jié)果表明，pH6-pH7條件下，菌絲生長速度與其他幾種pH條件菌絲生長速度達(dá)到顯著差異，因此這一pH范圍都可作為菌絲的適合生長pH條件；而pH4.5菌絲生長狀況與其他pH條件下菌絲生長狀況達(dá)到顯著差異，菌絲生長速度慢。因此，最不適合作為菌絲培養(yǎng)的pH條件。結(jié)合表1中麥芽汁中菌絲生長狀況可知，應(yīng)選pH6.5作為菌絲生長的最適生長pH。

由表2可知，菌絲生物量最高為GPY培養(yǎng)基，pH6培養(yǎng)條件?？傮w上，同一培養(yǎng)基菌絲的生物量pH低高于pH高。

表1 p H對菌絲生長（菌落直徑）的影響 單位：cm

表2 p H對菌絲生物量的影響 單位：mg

通過對不同培養(yǎng)基和不同pH條件下菌絲生物量的兩因素方差分析顯示，不同pH下菌絲生物量差異不顯著（P=0.134），所以，pH對菌絲生物量的積累影響較?。粡谋?可知，培養(yǎng)基GPY、pH6時(shí)菌絲生物量最高，為試驗(yàn)最適菌絲培養(yǎng)條件。

2.2 溫度對菌絲生長的影響由表3可知，培養(yǎng)溫度28℃時(shí)，菌絲生長速度最快，因此為菌絲培養(yǎng)最適宜的溫度；菌絲的生長速度隨溫度的升高有先上升后下降的趨勢。

根據(jù)顯著性分析可知，在各個(gè)溫度條件下菌絲生長速度差異都達(dá)到顯著水平，說明，菌絲的生長速度受溫度的影響較大。

由表3可知，在培養(yǎng)溫度28℃時(shí)具有最大的菌絲生物量；溫度低于19℃以下，菌絲生長緩慢，受到嚴(yán)重抑制；隨溫度的升高，菌絲干重狀況呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

根據(jù)顯著性分析可知，19℃條件下菌絲生長生物量積累少，且與其它培養(yǎng)溫度差異顯著，因此，不適合作為菌絲培養(yǎng)的溫度。28℃為菌絲生長的最適溫度條件。

表3 培養(yǎng)溫度對菌落直徑和菌絲生物量的影響

3 小結(jié)與討論

以兩種菌絲生長測定方法考察優(yōu)化茶樹菇菌種斜面培養(yǎng)基，其結(jié)果在培養(yǎng)溫度方面差異較小。菌落直徑法選擇的結(jié)果，麥芽汁培養(yǎng)基pH6.5條件下，菌絲生長速度最快。菌絲干重法選擇的結(jié)果，GPY固體培養(yǎng)基pH6條件下，菌絲生物量最高。結(jié)合表1、2可知，麥芽汁培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌絲生長速度最快，但其生物量卻很低，可以推測，在這種培養(yǎng)基條件下菌絲徒長，品質(zhì)低。GPY固體培養(yǎng)基中菌絲生長速度雖不及麥芽汁培養(yǎng)基，但其生物量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于麥芽汁培養(yǎng)基，說明此條件下，菌絲生長茂盛、分支多質(zhì)量好，適合作為菌種使用。因此，綜合考慮，建議選擇GPY固體培養(yǎng)基為最適培養(yǎng)基。

綜上所述，茶樹菇菌種最適固體培養(yǎng)條件為28℃、GPY培養(yǎng)基、pH6。