人胃癌裸鼠移植瘤建立的研究慨況

張嫄怡 綜述 李春鳴 審校

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，貴州 遵義 563099)

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人胃癌裸鼠移植瘤建立的研究慨況

張嫄怡 綜述 李春鳴 審校

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，貴州 遵義 563099)

胃癌； 裸鼠； 移植癌模型

胃癌是我國(guó)乃至全球常見(jiàn)的消化道腫瘤，也是全世界癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。為了更好地研究胃癌的發(fā)病學(xué)機(jī)制和防治，臨床前模型有著重要的作用。然而，自發(fā)或者誘發(fā)的鼠源性腫瘤模型與人瘤的生物學(xué)差別較大，因此在1969年Rygaard第一次成功地將人結(jié)腸癌移植入裸鼠體內(nèi)也為胃癌的動(dòng)物模型開(kāi)創(chuàng)了新的研究方向。裸鼠移植瘤模型的操作簡(jiǎn)便易行，可重復(fù)性高并且與人類腫瘤生物學(xué)行為相近，在腫瘤的基因治療、化療和中醫(yī)中藥治療及藥效等研究中應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)就胃癌裸鼠移植瘤建立的研究概況做一綜述。

1 人胃癌裸鼠移植的建立

1.1 裸鼠的選擇 裸鼠包括裸小鼠和裸大鼠。裸小鼠是一種無(wú)胸腺，無(wú)被毛的突變種小鼠，“nu”表示其基因符號(hào)。裸大鼠的一般特征與裸小鼠相似，但頭部、軀干和四肢有少量的毛，基因符號(hào)用“rnu”來(lái)表示。由于兩者都具有T細(xì)胞免疫缺陷，不會(huì)排斥來(lái)自異種的組織移植，因此成為人癌異種移植的良好接受體。

裸大鼠常選用rnu/rnu，4～5周齡，體質(zhì)量55～70 g，雌雄兼用。裸大鼠體型大于裸小鼠、產(chǎn)瘤量大、壽命長(zhǎng)，在血液學(xué)和血清生化分析實(shí)驗(yàn)中能提供足夠的血液樣本。另外裸大鼠體型大易進(jìn)行外科手術(shù)，為胃癌瘤周淋巴管的分離、研究癌組織血供提供了方便。裸小鼠常選用BALB/C(nu/nu)，鼠齡4～6周齡為佳，體質(zhì)量18～20 g，雌雄兼用。裸小鼠易抓取，沒(méi)有被毛所以容易觀察皮下的移植瘤，實(shí)驗(yàn)所需經(jīng)費(fèi)較少。裸鼠必須飼養(yǎng)在SPF環(huán)境中，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)也需要在超凈臺(tái)中進(jìn)行。

1.2 瘤源 一種是胃癌細(xì)胞株，常選用的包括BGC-823(胃低分化腺癌)、SGC-7901(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性胃腺癌)、MGC-803(胃低分化黏液腺癌)、AGS(胃中分化腺癌)、MKN-45(胃低分化腺癌)、MKN-28(胃中分化管狀腺癌)、HGC-27(胃未分化癌)。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于胃癌裸鼠移植瘤建立的實(shí)驗(yàn)中多采用SGC-7901和BGC-823，這兩種細(xì)胞株均易培養(yǎng)。這兩株細(xì)胞成瘤率均達(dá)到100%，無(wú)自發(fā)消退的現(xiàn)象，都可以很好的反應(yīng)人低分化胃癌的病理變化。

另一種是使用胃癌患者新鮮的腫瘤組織(PDTT)來(lái)建立裸鼠移植瘤的模型。此種個(gè)體化的腫瘤模型與患者的腫瘤在組織病理學(xué)特征上有著高度一致性[2]，能為不同的胃癌患者選用最有效的個(gè)體化治療藥物提供理想的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。近年來(lái)PDTT模型也越來(lái)越多的用于臨床前靶向療法的研究，如K.Jin等[2]利用PDTT模型來(lái)驗(yàn)證新型抗VEGF靶向藥物(FP3或貝伐單抗)的療效，研究表明該模型對(duì)兩種藥物均敏感且雙重靶向治療優(yōu)于單藥治療。

2 人胃癌裸鼠移植瘤建立的方法

2.1 人胃癌皮下種植法 常用的有兩種方法：一種是用直接將新鮮人腫瘤組織剪成2 mm×2 mm×3 mm[2]或研磨成懸液后接種于裸鼠的皮下。另一種是培養(yǎng)胃癌細(xì)胞系進(jìn)行接種，此種方法必須保證細(xì)胞數(shù)量在106～107，活力要≥95%。一般將腫瘤細(xì)胞懸浮于PBS、無(wú)血清的培養(yǎng)基或生理鹽水中，某些難以成瘤的胃癌細(xì)胞可以與matrigl 1∶1混合提高成瘤率。皮下接種法在各種研究中應(yīng)用廣泛。如Z.H.Ma等[3]采用皮下接種法研究了125I粒子的植入對(duì)裸鼠人胃癌細(xì)胞NCI-N87移植瘤，發(fā)現(xiàn)125I通過(guò)導(dǎo)致NCI-N87胃癌細(xì)胞的凋亡和降低細(xì)胞的有絲分裂而使移植瘤生長(zhǎng)受限。王萍玲等[4]等利用裸鼠皮下建瘤發(fā)現(xiàn)H-ras的小干擾RNA可下調(diào)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)。

但是由于有皮下結(jié)締組織包裹的限制、腫瘤細(xì)胞所處微環(huán)境的改變，所以移植瘤生長(zhǎng)局限，不發(fā)生其他器官和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移[5]。因此，想要研究胃癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制和抗轉(zhuǎn)移的治療，建立人胃癌裸鼠轉(zhuǎn)移癌就有了重要的意義。

2.2 人胃癌原位移植法

2.2.1 胃癌細(xì)胞懸液接種法 傳統(tǒng)的方法:將培養(yǎng)好的細(xì)胞制成懸液注射入裸鼠胃壁大彎側(cè)近胃竇處。此種模型成瘤周期較長(zhǎng)、成瘤率和轉(zhuǎn)移率比組織塊法低。主要是因?yàn)槲赴┘?xì)胞系被胰酶處理后，腫瘤原有的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、抗原成分被破壞。結(jié)果影響腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。改進(jìn)方法：首先將培養(yǎng)基(1 mL)與鼠尾膠原溶液(1 mL)1∶1等比例混合，再將胃癌細(xì)胞重懸于配制好的溶液中，最后把腫瘤細(xì)胞/膠原復(fù)合物注射入胃大彎近胃竇處漿膜下。胃癌細(xì)胞/膠原復(fù)合物能在局部形成工程化的胃癌組織，可以防止細(xì)胞溢出，且細(xì)胞呈現(xiàn)出三維立體式生長(zhǎng)，細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞外基質(zhì)及組織的結(jié)構(gòu)等微環(huán)境與人體胃癌組織相似。膠原孔道還能為瘤組織的微血管提供孔道[6]。

2.2.2 組織塊法 有研究[7]表明胃癌組織塊移植成瘤率高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移廣泛，肝臟轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高。組織塊法能使腫瘤完全表達(dá)其惡性特性，類似于臨床患者，因此也是目前最理想的模型。

胃腫瘤組織塊移植處理的方法有：(1)首先將胃癌細(xì)胞接種于裸鼠皮下，待腫瘤長(zhǎng)出后再進(jìn)行裸鼠間傳代，后將瘤塊取出縫合于裸鼠胃壁大彎側(cè)[7]。(2)在方法(1)的基礎(chǔ)上，待原位移植瘤生長(zhǎng)一個(gè)月后再把原位瘤取出切成2 mm×1 mm×1 mm的瘤塊荷包縫扎于胃漿膜損傷處[8]。(3)直接把胃癌患者新鮮的腫瘤組織和(或)轉(zhuǎn)移瘤組織縫合于裸鼠胃壁[9]，此種方法需要嚴(yán)格無(wú)菌采集新鮮胃癌組織并馬上放置在含有抗生素的培養(yǎng)液里，而且要盡可能快的進(jìn)行移植，否則癌組織容易失去活性或者壞死。

縫合的操作方法包括：(1)縫掛法：剪開(kāi)約2 mm胃壁漿膜層后直接將1～2枚2 mm×1 mm×1 mm大小的瘤塊縫掛于切口處即可。這種處理的缺點(diǎn)是癌組織塊有可能脫落、腫瘤向胃腔外生長(zhǎng)、與腹膜粘連。但是此法操作相對(duì)簡(jiǎn)便。(2)胃囊法:在胃大彎處縫黏膜囊包埋胃癌組織，早期就使癌組織接觸到正常的胃黏膜，不會(huì)脫落造成轉(zhuǎn)移假陽(yáng)性。(3)顯微外科法：在放大顯微鏡下，將大約1 mm×1 mm×1 mm的瘤小塊固定于胃竇小彎側(cè)2 mm長(zhǎng)的切口內(nèi)[10]。由于在臨床上大部分胃癌發(fā)生在胃竇部，所以顯微外科法能很好的模擬胃癌的生長(zhǎng)特點(diǎn)。但是顯微外科難度較大未得到大范圍適用。(4)“膠水”粘貼法：用1ML的無(wú)菌針頭刺破胃小彎處胃漿肌層，用無(wú)齒鑷向內(nèi)推形成一個(gè)類似小口袋的凹陷，將瘤塊用生物膠粘貼于凹陷處[10]。最近幾年來(lái)，原位移植從以前“縫”改進(jìn)到“粘貼”的流行主要是因?yàn)樾阅芎?、成本低、操作時(shí)間短和裸鼠術(shù)后恢復(fù)好，為胃癌原位移植研究提供了方便。生物膠可選用OB膠或者FS膠。(5)“纖維蛋白原-凝血酶”法：將瘤塊切成大約1 mm×1 mm×1 mm泡在放置在冰上的纖維蛋白原溶液里，用1ML無(wú)菌針頭刺破裸鼠胃大彎近胃竇處的胃壁漿肌層，植入3～4塊瘤塊，滴上10 μL凝血酶在瘤組織表面，凝血酶和纖維蛋白原會(huì)發(fā)生反應(yīng)，把所形成的膠狀物粘合到胃壁破損處即可[11]。“纖維蛋白原-凝血酶”復(fù)合物能有效的止血，能被機(jī)體吸收而不影響腫瘤的生長(zhǎng)。這一模型彌補(bǔ)了OB膠不可吸收的缺點(diǎn)。

胃癌預(yù)后差主要在于許多患者初次就診時(shí)就有局部或遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移，裸鼠的原位移植方式模擬了人胃癌生物學(xué)機(jī)制，更有利于研究。如Y.Li等[12]用原位移植的方法研究轉(zhuǎn)染了ZNF139-siRNA對(duì)人胃癌SGC-7901的影響，用熒光雙向差異凝膠電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)ZNF139可能通過(guò)上調(diào)ANXA5的表達(dá)促進(jìn)胃癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，抑制ANXA1的表達(dá)而促進(jìn)胃轉(zhuǎn)移。

2.3 腹腔注射轉(zhuǎn)移瘤模型 消毒裸鼠腹部，將胃癌細(xì)胞懸液于右下腹正中線處注射入裸鼠腹腔。此法可以用來(lái)模擬晚期胃癌患者腹腔轉(zhuǎn)移的情況，因造模簡(jiǎn)單常用于評(píng)估各種干預(yù)手段對(duì)腹腔轉(zhuǎn)移的胃癌細(xì)胞和病灶的效應(yīng)。南蛇藤可能通過(guò)NF-κB/Snail信號(hào)通路調(diào)控HSP27的表達(dá)，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞在裸鼠腹腔中的轉(zhuǎn)移。

2.4 尾靜脈注射轉(zhuǎn)移瘤模型 固定好裸鼠，拉直其尾部，將細(xì)胞懸液注射到裸鼠尾靜脈內(nèi)。此種方法雖不能模擬人胃癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的過(guò)程，但能造成遠(yuǎn)處器官的血行轉(zhuǎn)移，可以用來(lái)研究某種抑癌基因或癌基因?qū)β闶笪赴┺D(zhuǎn)移瘤的影響。如C.Zhou等[13]轉(zhuǎn)染shRNA沉默人胃癌AGS和SGC-7901細(xì)胞中的腫瘤轉(zhuǎn)移基因MAT2，發(fā)現(xiàn)其在裸鼠尾靜脈模型中裸鼠的胃癌肺轉(zhuǎn)移比只轉(zhuǎn)染了shRNA的空白組明顯減小。還發(fā)現(xiàn)MAT2的表達(dá)與癌組織內(nèi)的SP1因子呈正相關(guān)。

2.5 脾內(nèi)注射肝轉(zhuǎn)移模型 消毒裸鼠腹部，切開(kāi)左側(cè)腹部，將備好的胃癌細(xì)胞懸液注入脾臟下極包膜下，復(fù)位脾臟，縫合切口關(guān)腹。脾內(nèi)注射的胃癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)脾內(nèi)的巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的篩選后，能轉(zhuǎn)移到裸鼠肝臟的胃癌細(xì)胞都是具有高度轉(zhuǎn)移潛能的。近年來(lái)此種造模法不常用。

3 裸鼠移植瘤的評(píng)價(jià)手段

3.1 剖腹探查 裸鼠移植瘤若建立成功，要觀察其生長(zhǎng)情況，一般方法是腫瘤形成后處死裸鼠，剖腹取出瘤組織觀察。觀察內(nèi)容包括腫瘤體積、質(zhì)量的測(cè)量、觀察組織形態(tài)、周圍組織的改變和腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。但是剖腹探查必須處死裸鼠，不能實(shí)時(shí)對(duì)裸鼠進(jìn)行觀察所以觀察情況和收集的信息十分有限。

3.2 活體成像技術(shù) 活體光學(xué)成像常采用生物發(fā)光和熒光發(fā)光。前者熒光素酶基因可用來(lái)標(biāo)記細(xì)胞或DNA。而熒光發(fā)光中用(GFP、RFP及DiR等)等熒光基團(tuán)來(lái)標(biāo)記?？蓪⒈磉_(dá)GFP或RFP的質(zhì)粒與目的基因一起轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞，但需要分選出穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞，也可以把熒光染料注射到裸鼠的尾靜脈或腹腔靜脈。活體成像能廣泛應(yīng)用胃癌的基因治療、移植瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)中[14]。如樸春梅[15]等利用生物發(fā)光成像技術(shù)確定癌細(xì)胞的肝轉(zhuǎn)移，再用近紅外熒光探針簡(jiǎn)單、快速地觀察血管新生情況。M.Yang[16]等研究發(fā)現(xiàn)用轉(zhuǎn)染了GFP熒光蛋白的胃癌細(xì)胞注射到RFP轉(zhuǎn)基因裸鼠的皮下后癌組織能表達(dá)GFP的綠色熒光，而腫瘤脈管系統(tǒng)能表達(dá)RFP的紅色熒光，說(shuō)明癌組織保持著良好的生存能力，若是腫瘤只有少許RFP熒光殘留則說(shuō)明瘤細(xì)胞有壞死。這樣應(yīng)用雙重標(biāo)記的裸鼠又為腫瘤組織微環(huán)境的研究提供了新的可能。

3.3 核素成像 將示蹤劑導(dǎo)入裸鼠，可定位在靶器官，再用小動(dòng)物PET/SPECT顯像儀采集信息，能在顯示不同斷面圖的同時(shí)給出定量生理參數(shù)。放射性標(biāo)記物進(jìn)入體內(nèi)能聚集在特定組織和器官參與代謝，適合于各類抗腫瘤藥物的動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)研究。如K.H.Jun等[17]將溶瘤病毒GLV-1 h153轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞MKN-74進(jìn)行裸鼠成瘤，2 d后在裸鼠尾靜脈注射放射性核素99mTc，利用小動(dòng)物PET對(duì)腫瘤組織成像為觀察GLV-1 h153對(duì)胃癌細(xì)胞MKN-74的作用提供了非侵入性成像的工具。

3.4 MRI成像 MRI具備無(wú)創(chuàng)、空間高分辨率、多方位多參數(shù)成像的特征。而且所獲得的解剖信息不受組織深度的影響。Y.Chen[18]等在研究中成功制備了siRNA傳遞和MRI顯像功能的胃癌組織靶向納米載體，可以靶向性的識(shí)別胃癌SGC-7901，將siRNA靶向性的傳遞到SGC-7901細(xì)胞同時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)MRI分子影像學(xué)示蹤，為治療胃癌提供了新手段。

4 小 結(jié)

目前,裸鼠移植瘤技術(shù)比較成熟，建立周期短、成功率也高，能滿足胃癌生物學(xué)行為研究、藥物評(píng)價(jià)的需求。欲研究胃癌的整個(gè)發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程，尤其是機(jī)體對(duì)胃癌的免疫作用。今后應(yīng)在裸鼠建模的平臺(tái)上繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化。總而言之，裸鼠可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求的不同選用不同的造模方法，同時(shí)裸鼠活體腫瘤的實(shí)時(shí)監(jiān)控也廣泛應(yīng)用到監(jiān)控轉(zhuǎn)基因的表達(dá)、基因治療、病毒載體的傳送和胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中，與裸鼠的異種移植相輔相成。胃癌的發(fā)展是個(gè)多階段、多因素的過(guò)程。因此想要全面的評(píng)價(jià)胃癌裸鼠模型，理想的辦法是將模型與活體成像、尸體解剖、病理和分子生物學(xué)檢測(cè)等手段相結(jié)合綜合觀察。

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貴州省科技廳攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào)：CK-845)

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1000-744X(2016)03-0319-04

2015-11-04)