鋁離子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞突觸生長(zhǎng)的影響

王明明　梅潁　陽(yáng)小飛

摘要：為了探討金屬鋁離子在小鼠神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)分化中的影響，采用小鼠大腦皮層細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，在細(xì)胞生長(zhǎng)分化過(guò)程中加入濃度不同的金屬離子，等細(xì)胞生長(zhǎng)至14 d時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照，并利用ImageJ軟件和GraphPad Prism 5.01軟件對(duì)神經(jīng)細(xì)胞突觸的數(shù)目和大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明：在鋁離子濃度較低的情況下，不會(huì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的突觸數(shù)目和突觸大小造成影響；隨著鋁離子濃度的升高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷越大，直至神經(jīng)細(xì)胞全部死亡；而其影響主要表現(xiàn)在使突觸數(shù)量減少，而對(duì)突觸的大小并沒(méi)有顯著的影響。

關(guān)鍵詞：小鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞；神經(jīng)細(xì)胞分化；鋁離子；突觸形成

中圖分類(lèi)號(hào)：Q253

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：16749944（2017）8022903

1引言

自閉癥譜系障礙（ASD）和阿爾茲海默癥（AD）均是由突觸功能障礙或突觸病變引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。突觸形成和突觸功能的完善受到特定基因的調(diào)控，突觸功能障礙和突出病變與這些基因緊密相關(guān)。但是，基因外其他因素的影響同樣不容忽視。體內(nèi)金屬離子含量失衡就是其中一個(gè)很重要的因素[2，3]。過(guò)去，很多研究用以證明人體內(nèi)的各種金屬離子的重要性和毒性，這些研究發(fā)現(xiàn)，金屬離子對(duì)人體是否有害是有一個(gè)安全值的。當(dāng)?shù)陀诖税踩担械慕饘賹?duì)人體是無(wú)害的，甚至是不可缺少的；當(dāng)超過(guò)這個(gè)安全值，即便是人體必須的金屬元素，都會(huì)對(duì)人體造成傷害[4]。

隨著現(xiàn)在人們使用金屬制品的增多，人們對(duì)金屬離子特別是有毒金屬離子的攝入量也隨之增加，其在人體內(nèi)長(zhǎng)期蓄積，對(duì)機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能產(chǎn)生干擾，當(dāng)其濃度超過(guò)了安全值，便會(huì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成傷害。在對(duì)自閉癥和阿爾茲海默癥患者的頭發(fā)樣品鑒定中發(fā)現(xiàn)，Zn、Ca、Fe、Mg、Mn和Se明顯低于正常人；同時(shí)，Al、As、Cd、Hg和Pb的濃度偏高[5，6]。而且，癥狀的嚴(yán)重程度與體內(nèi)有毒金屬含量有很大關(guān)系[7]。

為了探究鋁離子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)分化特別是突觸形成的具體影響及其作用機(jī)制，利用體外培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞，在不同的時(shí)間向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入梯度濃度的AlCl3溶液，然后利用免疫熒光染色，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞突觸的數(shù)量和大小進(jìn)行記錄并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。試驗(yàn)結(jié)果表明：在金屬濃度比較低時(shí)，無(wú)論作用時(shí)間長(zhǎng)短，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞突觸形成均沒(méi)有影響；當(dāng)Al離子濃度高于200 μM后，離子濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)神經(jīng)突觸的傷害越大，直至神經(jīng)細(xì)胞全部死亡，而且金屬離子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響主要表現(xiàn)在對(duì)突觸數(shù)目的影響，而對(duì)突觸的大小并沒(méi)有顯著影響。

2材料與方法

2.1材料

小鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞。胎牛血清（FBS，生化試劑，Gibco公司）；B-27；運(yùn)鐵蛋白（Transferrin）；胰蛋白酶（Gibco公司）；葡萄糖（Glucose）；HEPES；鹽酸阿糖胞嘧啶（Ara-C）；多聚-L-賴(lài)氨酸；AlCl3。

2.2試劑與儀器

相差顯微鏡（奧林巴斯CKX41）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Fisher）；共聚焦顯微鏡（Nikon）。

2.3方法

2.3.1實(shí)驗(yàn)溶液配制

利用胎牛血清、DMEM等試劑配置實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞培養(yǎng)基及相關(guān)緩沖液。所有溶液均需調(diào)整滲透壓和pH值至適宜細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的值，并以適當(dāng)方式進(jìn)行除菌[8]。

2.3.2小鼠大腦皮層細(xì)胞培養(yǎng)

新生野生型小鼠，分離其大腦皮層與海馬細(xì)胞，用0.25% Trypsin-EDTA消化酶消化12 min，消化完成后用培養(yǎng)基終止消化，然后將大腦皮層細(xì)胞與海馬細(xì)胞吹打下來(lái)，加入鍍有多聚賴(lài)氨酸的玻片上進(jìn)行培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)第1、4、9 d進(jìn)行換液，同時(shí)向培養(yǎng)基中加入不同濃度的金屬離子溶液。第1 d為神經(jīng)元換無(wú)Ara-C的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，第4、9 d換含4 μM Ara-C 生長(zhǎng)培養(yǎng)基[8]。培養(yǎng)14d后進(jìn)行免疫熒光染色。

2.3.3細(xì)胞免疫熒光染色

用4%多聚甲醛（PFA）在4 ℃環(huán)境中固定12 min；用1x的PBS清洗1次之后，用0.2% TritonX-100對(duì)神經(jīng)細(xì)胞室溫通透5 min，然后用1x的PBS浸洗5 min；用5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉30 min；吸去BSA后，一抗室溫孵育2 h；然后用1x的PBS浸洗3次，每次5 min；加入熒光二抗，室溫孵育30 min，在加入熒光二抗之后，所有的操作應(yīng)注意避光；30 min后，用1x的PBS浸洗5次，每次5 min，最后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片。封片完成后，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.3.4數(shù)據(jù)處理

將所得圖片使用軟件Image J （National Institutes of Health）進(jìn)行分析：隨機(jī)選取神經(jīng)細(xì)胞的軸突，把直徑大于0.42 μm且小于12.6 μm的點(diǎn)視為突觸，并測(cè)量該段軸突的長(zhǎng)度。將所獲得的突觸的數(shù)量和大小用Graph pad Prism 5.01（Graph Pad Software，Inc）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行t檢驗(yàn)，并使用Adobe Illustrator CC （Adobe Corporation）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)圖繪制。

3結(jié)果

3.1第1d加入Al離子對(duì)小鼠神經(jīng)細(xì)胞突觸形成的影響

研究表明，在ASD和AD患者的病因主要是突觸功能障礙和突觸病變，而更深層次的原因是基因和基因?yàn)橐蛩氐墓餐绊?。在ASD和AD患者體內(nèi)，Al離子濃度明顯升高，且與患者的癥狀嚴(yán)重程度成正相關(guān)。為了探究Al離子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)分化特別是對(duì)突觸生長(zhǎng)的影響，我們選取小鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞，分別在培養(yǎng)的第1、4、9 d，向培養(yǎng)基中加入梯度濃度的AlCl3溶液，濃度梯度為：10 μM，100 μM，200 μM，300 μM，500 μM。在培養(yǎng)14 d以后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，然后利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，然后再對(duì)三次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

在細(xì)胞生長(zhǎng)第1 d加入AlCl3溶液，并培養(yǎng)14 d以后，10 μM，100 μM組別與對(duì)照組相比，無(wú)論單位長(zhǎng)度的突觸個(gè)數(shù)，還是突觸大小，并沒(méi)有明顯差異。在200 μM，300 μM組別中，與對(duì)照組相比，單位長(zhǎng)度的突觸個(gè)數(shù)明顯減少，但是突觸的大小并沒(méi)有明顯差異。在500 μM的組別中，神經(jīng)細(xì)胞已全部死亡。這說(shuō)明，當(dāng)Al離子濃度較低時(shí)，不會(huì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的突觸形成造成影響，而當(dāng)其濃度超過(guò)一定范圍，便會(huì)對(duì)突觸形成帶來(lái)危害，如果濃度過(guò)高，則會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡（圖1）。

3.2第4 d加入Al離子對(duì)小鼠神經(jīng)細(xì)胞突觸形成的影響

第4 d加入的AlCl3溶液濃度梯度為：10 μM，100 μM，200 μM，300 μM，500 μM，培養(yǎng)14 d之后，進(jìn)行免疫熒光染色，利用共聚焦顯微鏡成像，用Image J對(duì)圖像進(jìn)行分析，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，然后將3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其結(jié)果如圖2。

在第4 d加入AlCl3溶液后，10 μM，100 μM，200 μM，300 μM的組別無(wú)論單位長(zhǎng)度內(nèi)的突觸個(gè)數(shù)還是突觸的大小與對(duì)照組相比均沒(méi)有明顯差異，但500 μM的組與對(duì)照組相比，單位長(zhǎng)度的突觸個(gè)數(shù)有明顯差異，但突觸大小仍沒(méi)有明顯差異。這說(shuō)明，隨著作用時(shí)間縮短，同樣濃度的Al離子對(duì)突觸的形成造成的危害程度會(huì)相應(yīng)的降低，但是高濃度的Al仍然會(huì)對(duì)突觸造成傷害。

3.3第9 d加入Al離子對(duì)小鼠神經(jīng)細(xì)胞突觸形成的影響

第9 d加入的AlCl3溶液濃度梯度為：10 μM，100 μM，200 μM，300 μM，500 μM，培養(yǎng)14 d之后，進(jìn)行免疫熒光染色，利用共聚焦顯微鏡成像，用Image J對(duì)圖像進(jìn)行分析，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，然后將3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其結(jié)果如圖3。

結(jié)果顯示，在第9 d加入AlCl3溶液后，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，無(wú)論單位長(zhǎng)度的突觸數(shù)量還是突觸的大小，均沒(méi)有明顯差異。

由以上結(jié)果可以得出，當(dāng)AlCl3 濃度較低時(shí)，不會(huì)對(duì)小鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的突觸生長(zhǎng)造成影響，且與作用時(shí)間長(zhǎng)短無(wú)關(guān)；當(dāng)AlCl3的濃度超過(guò)200 μM時(shí)，如果作用時(shí)間較短，對(duì)突觸生長(zhǎng)并無(wú)明顯影響，如果作用時(shí)間較長(zhǎng)，便會(huì)對(duì)突觸的生長(zhǎng)造成危害；如果濃度過(guò)高，作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的話(huà)，甚至?xí)?dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。這說(shuō)明，當(dāng)作用時(shí)間過(guò)短時(shí)，在我們的濃度梯度內(nèi)，不會(huì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的突觸形成造成危害。不過(guò)，也有可能此時(shí)神經(jīng)突觸已經(jīng)形成，加之Al離子作用時(shí)間過(guò)短，無(wú)法對(duì)其造成影響。

4討論

由于本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象為神經(jīng)細(xì)胞，所以選取小鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，均為原代培養(yǎng)，所用小鼠為新生野生型小鼠。通過(guò)在小鼠神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中加入梯度濃度的AlCl3溶液，通過(guò)采集小鼠神經(jīng)細(xì)胞單位長(zhǎng)度突觸的數(shù)目和突觸的大小等數(shù)據(jù)，來(lái)研究不同濃度的鋁離子對(duì)小鼠神經(jīng)細(xì)胞突觸形成的影響。

對(duì)所采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)：當(dāng)Al離子濃度低于200 μM時(shí)，無(wú)論對(duì)小鼠神經(jīng)細(xì)胞作用時(shí)間長(zhǎng)短，均未對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的突觸個(gè)數(shù)和大小產(chǎn)生影響；當(dāng)Al離子濃度超過(guò)200 μM，Al離子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞突觸的形成的影響越大，單位長(zhǎng)度的突觸數(shù)量顯著減少，但突觸的大小并沒(méi)有顯著改變；當(dāng)Al離子濃度過(guò)高（達(dá)到或超過(guò)500 μM），作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的情況下，會(huì)直接導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞全部死亡。這說(shuō)明，Al離子在人體內(nèi)蓄積，特別是在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)蓄積的時(shí)候，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化是十分不利的。

另外，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，Al離子對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，而且可以通過(guò)多種方式對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成傷害：一方面，鋁離子不僅能夠非競(jìng)爭(zhēng)性抑制乙酰膽堿脂酶，產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，觸發(fā)β-折疊，促進(jìn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成，干擾神經(jīng)傳導(dǎo)和誘導(dǎo)細(xì)胞的氧化損傷而發(fā)揮直接的毒性作用[9，10]；另一方面，還能夠作用于小分子物質(zhì)，調(diào)節(jié)血清的金屬動(dòng)態(tài)平衡，促進(jìn)鐵介導(dǎo)的氧化反應(yīng)而間接發(fā)揮毒性作用[11]。

神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成與功能實(shí)現(xiàn)完全取決于神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化，而突觸聯(lián)結(jié)是神經(jīng)環(huán)路中不同神經(jīng)元之間信息傳遞的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，因此可以說(shuō)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化中重要的部分就是神經(jīng)突觸的形成。因此，研究神經(jīng)細(xì)胞突觸的形成及其影響因子是研究生物神經(jīng)系統(tǒng)的重要部分；同時(shí)對(duì)突觸功能障礙或突觸病變類(lèi)疾病的醫(yī)學(xué)探究和病理學(xué)研究也具有極大意義。

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