日糧添加苦蕎提取物對綿羊背最長肌抗氧化性能的影響

金亞倩，趙俊星，蘇 銳，辛?xí)员螅n曉強，張文佳，項斌偉，張建新*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷 030801; 2.山西省右玉縣畜牧局，山西右玉 037200）

日糧添加苦蕎提取物對綿羊背最長肌抗氧化性能的影響

金亞倩1，趙俊星1，蘇 銳1，辛?xí)员?，韓曉強1，張文佳2，項斌偉2，張建新1*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷 030801; 2.山西省右玉縣畜牧局，山西右玉 037200）

苦蕎含有多種有益健康的成分，其中苦蕎黃酮具有較強的抗氧化性。本試驗旨在研究日糧中添加苦蕎提取物對綿羊背最長?。↙D）抗氧化性的影響。試驗選取24只5月齡、體重（25±0.5）kg杜泊×小尾寒羊雜一代母羊，采用完全隨機設(shè)計平均分為4組（對照組、試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組、試驗Ⅲ組），分別飼喂含有不同苦蕎提取物添加量（0、1、5、20 g/kg）的日糧。試驗期80 d。試驗結(jié)束后，屠宰取樣，測定試驗羊LD組織抗氧化性能。結(jié)果表明：試驗Ⅰ組LD組織的總抗氧化能力（T-AOC）極顯著高于對照組（P＜0.01），試驗Ⅲ組谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性顯著升高（P＜0.05），丙二醛（MDA）含量顯著降低（P＜0.05）；與對照組相比，試驗Ⅱ組Cu-ZnSOD mRNA與蛋白表達量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），試驗Ⅰ組GPx4蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）。綜上可得，日糧中添加苦蕎提取物能夠改善綿羊LD抗氧化性能。

苦蕎提取物；羔羊；背最長??；抗氧化性

苦蕎，學(xué)名韃靼蕎麥，蓼科蕎麥屬，在我國栽培歷史悠久，分布廣泛，種植面積與產(chǎn)量居世界第一位。據(jù)報道，苦蕎擁有健康功效，包括降血糖、降血脂、降血壓、降膽固醇、抗腫瘤、抗疲勞等[1]，以苦蕎為原料開發(fā)的各種食品、保健品越來越受到人們的青睞。黃酮類化合物在苦蕎中的含量極為豐富，廣泛存在于苦蕎的莖、葉、花、籽粒等各個部位，是苦蕎發(fā)揮各種生物學(xué)功效的主要成分[2]。抗氧化作用是苦蕎黃酮擁有的生理活性之一。研究表明，苦蕎葉、苦蕎殼以及苦蕎麩皮等的提取物都有顯著的抗氧化能力[3]。Li等[4]研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎提取物能夠在體外細胞培養(yǎng)中發(fā)揮抗氧化作用。李富華等[5]研究證明，苦蕎麩皮黃酮具有一定程度的抗氧化性，且表現(xiàn)出了時效關(guān)系。目前對苦蕎黃酮抗氧化性能的研究主要集中于體外或模式生物上，而關(guān)于苦蕎黃酮與綿羊肌肉抗氧化性的關(guān)系尚未見報道。本試驗以杜泊×小尾寒羊雜一代母羊為對象，旨在研究日糧中添加苦蕎提取物對綿羊肌肉抗氧化性的影響，為苦蕎加工副產(chǎn)品在肉羊生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計及動物飼養(yǎng) 試驗選用體重（25±0.5）kg的杜泊×小尾寒羊雜一代母羊24只（試驗前均經(jīng)過嚴格檢疫），采用完全隨機試驗設(shè)計，將試驗羊隨機分為4組，每組6只，其中對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別飼喂在基礎(chǔ)日糧中添加1、5、20 g/kg苦蕎提取物（含40%黃酮）的試驗日糧。基礎(chǔ)日糧參照NRC（2007）綿羊營養(yǎng)需要設(shè)計配方。試驗日糧配方及營養(yǎng)成分如表1。

試驗于2015年5月至8月在山西省右玉縣宏宇牧業(yè)有限公司種羊養(yǎng)殖場進行。預(yù)試期為10 d，正試期為80 d。試驗開始前，試驗羊舍進行全面清掃消毒，并對所有試驗綿羊進行免疫注射羊痘、口蹄疫和小反芻獸疫疫苗。預(yù)試期間進行試驗羊的分組、編號及驅(qū)蟲工作。正試期內(nèi)，試驗羊每日分2次（08:00、18:00）飼喂，各組羊飼喂相對應(yīng)的日糧。所有試驗羊自由采食，自由飲水，準(zhǔn)確記錄每組羊每天的采食情況。

表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)成分表

1.2 試驗試劑及抗體 苦蕎提取物（苦蕎黃酮含量為40.18%）購自陜西森弗高科實業(yè)有限公司；總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化物酶（CAT）、丙二醛（MDA）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自TaKaRa公司；Goat-Cu/ZnSOD多克隆一抗（sc-8637）、Goat-Catalase多克隆一抗（sc-34281）、Rabbit-GPx4多克隆一抗（sc50497）購自Santa Cruz Biotechnology公司，β-Tubulin Antibody購自Cell Signaling Technology公司，Donkey Antigoat IgG-HRP（sc-2020）二抗和Donkey Antirabbit IgG-HRP（sc-2313）二抗購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.3 樣品的采集 在試驗結(jié)束當(dāng)天16:00，對所有試驗羊禁食、禁水16 h，并在次日08:00進行屠宰。屠宰后，迅速采集試驗羊只的背最長肌樣品，用錫紙包裹并標(biāo)記后放入液氮速凍，-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 背最長肌抗氧化能力測定 樣品預(yù)處理：取在-80℃保存的背最長肌樣品，在液氮中充分研磨至粉末，稱取組織粉末1 g左右，按1:9的比例加入冰冷生理鹽水，用組織勻漿儀勻漿5～10 min，制成10%的組織勻漿。將制好的勻漿4℃、3 500 r/min離心10 min，取上清進行下一步檢測。

背最長肌組織上清T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA水平等指標(biāo)測定按照南京建成提供的試劑盒說明書操作。

1.4.2 熒光定量PCR 背最長肌樣品在液氮中迅速研磨，按照Trizol Reagent試劑盒的操作說明提取組織總RNA，并合成cDNA。按TaKaRa公司的SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。擴增條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃ 退火延伸34 s，共45個循環(huán)；95℃ 15 s ；60℃ 1 min；95℃ 15 s。引物信息列于表2。

表2 各基因引物序列

1.4.3 Western blot分析 稱取0.1 g研磨好肌肉樣品，加入裂解液進行蛋白樣品的制備，經(jīng)勻漿、沸水浴、超聲波破碎、離心10 min后取上清，4℃保存?zhèn)溆谩Ｅ渲?0%分離膠與4%濃縮膠，進行SDSPAGE電泳。電壓100 V轉(zhuǎn)膜1～1.5 h，封閉1 h，一抗（1:1000）孵育4℃過夜，二抗室溫孵育1.5 h，曝光成像。

1.5 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用Excel 2013進行初步整理，然后運用SPSS 22.0進行單因素方差分析，并用Dunnett法分析比較各試驗組與對照組之間數(shù)據(jù)的差異顯著性，以P＜0.05和P＜0.01為差異顯著和極顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示。

2 結(jié) 果

2.1 日糧添加苦蕎提取物對綿羊背最長肌抗氧化能力的影響 從表3中可以看出，試驗Ⅰ組與對照組相比，綿羊背最長肌T-AOC極顯著提高（P＜0.01），試驗Ⅱ組與試驗Ⅲ組均較對照組有增加的趨勢?？嗍w提取物可降低試驗綿羊背最長肌中MDA含量，其中試驗Ⅲ組MDA含量顯著低于對照組（P＜0.05）。試驗Ⅲ組綿羊背最長肌中GSH-Px的活性顯著高于對照組（P＜0.05）。試驗組綿羊背最長肌中SOD及CAT活性較對照組均無顯著差異（P＞0.05）。

表 3 苦蕎提取物對綿羊背最長肌抗氧化性的影響

2.2 日糧添加苦蕎提取物對綿羊背最長肌Cu-ZnSOD、GPx4與CAT基因表達量的影響 如圖1所示，與對照組相比，日糧中添加苦蕎提取物提高了試驗Ⅱ組綿羊Cu-ZnSOD基因的表達量（P＜0.05），試驗Ⅰ組與試驗Ⅲ組同樣有升高的趨勢。GPx4與CAT基因mRNA相對表達量與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 日糧添加苦蕎提取物對綿羊背最長肌Cu-ZnSOD、GPx4與CAT蛋白表達量的影響 如圖2所示，苦蕎提取物可提高綿羊背最長肌中Cu-ZnSOD蛋白相對表達量，其中試驗Ⅱ組Cu-ZnSOD蛋白相對表達量最高，極顯著高于對照組（P＜0.01）。背最長肌中GPx4蛋白相對表達量也受到日糧中苦蕎提取物的影響，其中試驗Ⅰ組與對照組相比，GPx4蛋白的表達量顯著提高（P＜0.05），試驗Ⅱ組也表現(xiàn)出了同樣的趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）。添加苦蕎提取物后，CAT蛋白的相對表達量與對照組相比沒有顯著差異（P＞0.05）。

3 討 論

羊肉作為一種優(yōu)質(zhì)畜肉，具有肉質(zhì)鮮嫩、脂肪和膽固醇含量少等特點，有著較高的營養(yǎng)價值和很好的食療效果，加之其食用沒有宗教、文化的禁忌，因此越來越受到人們的青睞。

圖1 Cu-ZnSOD、GPx4、CAT基因mRNA相對表達量

動物經(jīng)屠宰后，肉質(zhì)通常會發(fā)生一系列變化。正常情況下，機體會不斷產(chǎn)生多種抗氧化物質(zhì)（如SOD、GSH-Px、CAT等抗氧化酶），不斷清除體內(nèi)過剩自由基，生物體自由基代謝處于一種平衡狀態(tài)，各組織細胞不會受到自由基的損害。畜禽在屠宰后，自由基代謝平衡被破壞，過量的自由基會攻擊肌肉細胞中的不飽和脂肪酸和蛋白質(zhì)。此時，機體已不再產(chǎn)生新的抗氧化物質(zhì)，主要依靠肌肉組織中已有的抗氧化酶防御自由基攻擊，保護肌肉細胞不被破壞，肌肉組織處于強烈的氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)變性、脂質(zhì)過氧化和酸敗[6]。在肉類的儲存過程中，脂質(zhì)的過氧化是影響肉品質(zhì)的一個重要因素，它可以導(dǎo)致肉質(zhì)顏色變差、滴水損失增加、有毒有害物質(zhì)積累，大大地降低了肉的食用性和商品價值[7]。多年以來，人們在肉產(chǎn)品加工與保存過程中常添加丁羥甲苯、特丁基對苯二酚等人工合成的抗氧化劑來延長肉產(chǎn)品貨架期[8]，但是，這些化學(xué)抗氧化劑具有一定毒副和致癌作用，嚴重影響到人類健康。有研究稱，在肉產(chǎn)品加工過程中添加一些天然抗氧化劑，如多酚提取物，可以有效提高產(chǎn)品抗氧化能力[9]。也有研究表明，在動物日糧中添加部分抗氧化劑可以使這種抗氧化能力隨循環(huán)系統(tǒng)分布于各組織，有利于動物健康，同時減緩宰后肉脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，較長時間保持肉的穩(wěn)定性[10]。

圖2 Cu-ZnSOD、GPx4、CAT蛋白相對表達量

隨著研究的深入，以含抗氧化活性成分的植物飼喂動物成為延長畜禽肉產(chǎn)品貨架期、提高其感官和食用品質(zhì)的有效途徑。陳志輝等[11]在肉雞飼料中添加女貞子原粉有效提高了雞肉抗氧化酶活性和總抗氧化水平，同時檢測到GPx4基因的相對表達量顯著提高。Qwele等[12]研究表明，以辣木樹葉（含多酚類化合物）代替部分粗飼料飼喂山羊可以顯著提高山羊肌肉中SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶的活性，肉色和不飽和脂肪酸的含量也有所改善。

苦蕎是一種藥食同源作物，其藥用價值主要體現(xiàn)在黃酮類化合物?？嗍w黃酮具有多樣、復(fù)雜的生物學(xué)活性[13]，其包含的主要生物類黃酮成分有槲皮素、蘆丁、葒草苷、異葒草苷、牡荊堿、異牡荊堿等，其中含量最多的是蘆丁（Rutin），達到苦蕎中總黃酮含量的70%～85%[14]。劉金玉[15]研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎蘆丁可以明顯抑制豬脂肪的氧化，且隨著蘆丁濃度的增加抑制效果會逐漸增強。此外，苦蕎蘆丁也表現(xiàn)出對·OH、O2-較強的清除能力。 Lee等[16]通過亞鐵還原能力實驗（FRAP）、DPPH自由基清除法和ABTS自由基清除法確定了苦蕎中黃酮類化合物的抗氧化能力，而且證實了蘆丁在苦蕎抗氧化過程中發(fā)揮著主要作用。

組織總抗氧化能力（T-AOC）是反映組織抗氧化水平最直觀的指標(biāo)；抗氧化酶活性對減輕組織氧化應(yīng)激，抵抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)具有重要意義，也是反映組織抗氧化能力的一個重要指標(biāo)。MDA作為氧化應(yīng)激反應(yīng)的終產(chǎn)物之一，其含量能夠有效反映組織遭受氧化應(yīng)激的程度。在本研究中，添加苦蕎提取物后綿羊背最長肌T-AOC顯著提高，GSHPx的活性升高，同時，肌肉中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著降低。這一結(jié)果說明，肌肉抗氧化水平在添加苦蕎提取物后有所提高，可能是苦蕎提取物中的黃酮類化合物起到了關(guān)鍵性作用，它的攝入在一定程度上增強了綿羊機體的抗氧化能力。

抗氧化酶活性的提高是否與其表達量增加有關(guān)，本試驗做了進一步研究。從抗氧化相關(guān)基因在背最長肌中的相對表達量來看，攝入苦蕎提取物后，5%添加組綿羊Cu-ZnSOD基因mRNA相對表達量顯著升高，且與Western blot得到的結(jié)果一致，這說明苦蕎提取物的攝入可能在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平同時影響了Cu-ZnSOD基因的表達。推測可能是因為蛋白的翻譯與表達開始于mRNA的轉(zhuǎn)錄，mRNA表達量的提高促進了蛋白表達量的升高，這樣的結(jié)果說明苦蕎提取物的攝入影響到了Cu-ZnSOD基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，進而促進了蛋白的合成。然而，GPx4基因的mRNA相對表達量各組間均無差異，但其在5%苦蕎提取物添加水平下蛋白的表達量卻顯著升高。這種mRNA表達量與其蛋白表達不一致的情況，可能是由于苦蕎黃酮對綿羊肌肉中GPx4基因的翻譯過程起到了促進的作用，但沒有對其轉(zhuǎn)錄水平造成影響，但具體的作用機制尚不清楚，需要進一步研究。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，綿羊日糧中添加苦蕎提取物后，可以明顯改善綿羊背最長肌的抗氧化能力，這將為苦蕎在畜牧生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。飼喂苦蕎提取物可能在一定程度上對綿羊的肉質(zhì)產(chǎn)生有利的影響，但需要進一步的試驗驗證。

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S826.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-05-108

2016-06-07；

2016-11-20

國家現(xiàn)代肉羊技術(shù)體系專項（CARS-39）

金亞倩（1990-），女，山西曲沃人，碩士，主要從事動物繁殖生物技術(shù)研究，E-mail：jinyq2009@163.com

* 通訊作者：張建新，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事飼料資源開發(fā)與利用研究，E-mail：ypzjx@126.com