肺泡灌洗液RNA恒溫擴(kuò)增實時檢測在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價值

吳 璇，毛曉輝，王 勃，王龍智，薛 瑜

西安市胸科醫(yī)院內(nèi)四科(西安710100)

肺泡灌洗液RNA恒溫擴(kuò)增實時檢測在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價值

吳 璇，毛曉輝，王 勃，王龍智，薛 瑜

西安市胸科醫(yī)院內(nèi)四科(西安710100)

目的：探討支氣管肺泡灌洗液(BALF)中結(jié)核分枝桿菌RNA恒溫擴(kuò)增實時檢測(TB-RNA)、TB-PCR及濃縮集菌法在肺結(jié)核診斷中的價值。方法：對160例疑似肺結(jié)核的初診住院患者行纖維支氣管鏡檢查，并以肺泡灌洗液送檢結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、TB-RNA、TB-PCR及濃縮集菌法找抗酸桿菌，以結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性為金標(biāo)準(zhǔn)，計算其他三種檢測方法的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及一致性。結(jié)果：以結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，濃縮集菌法、TB-PCR、TB-RNA三種檢測方法的敏感度分別是67.6%(46/68)、63.2%(43/68)、76.5%(52/68)；特異度分別是97.9%(46/47)、89.4%(42/47)、95.7%(45/47)；陽性預(yù)測值分別是97.9%(46/47)、89.6%(43/48)、96.3%(52/54)；陰性預(yù)測值分別是67.6%(46/68)、62.7%(42/67)、73.8%(45/67)；ROC曲線下面積分別是0.828、0.763、0.861；Kappa(K)值分別是0.613、0.494、0.690。結(jié)論：TB-RNA有較高的敏感度、特異度，與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果一致性高，是臨床診斷的可靠依據(jù)。

肺是結(jié)核病最好發(fā)的器官，也是傳染控制的重點，但是隨著臨床工作中不典型肺結(jié)核越來越多，結(jié)核病的診斷難度日益凸顯。細(xì)菌學(xué)檢查是診斷結(jié)核病的主要依據(jù)，但現(xiàn)有的實驗室檢查手段均存在一定弊端，并不能滿足臨床需要。痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)是診斷肺結(jié)核的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但陽性率偏低，培養(yǎng)周期長。TB-PCR是一種以核酸擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，此項技術(shù)已在臨床得到廣泛的應(yīng)用[1]。但由于其敏感性高，在技術(shù)操作中可能因標(biāo)本污染等因素呈現(xiàn)假陽性。

我們采用纖維支氣管鏡檢查，留取住院患者支氣管肺泡灌洗液，進(jìn)行TB-RNA檢測，并以結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性為金標(biāo)準(zhǔn)，對TB-RNA檢測結(jié)果進(jìn)行評估。

資料與方法

1 一般資料 收集西安市胸科醫(yī)院2015年4月至2015年6月所有疑似肺結(jié)核的初診住院患者160例，均行纖維支氣管鏡檢查并以肺泡灌洗液送檢結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、TB-RNA、TB-PCR及濃縮集菌法找抗酸桿菌，其中確診肺結(jié)核68例，臨床診斷肺結(jié)核45例，非肺結(jié)核患者47例。平均年齡47.3±11.7歲，其中男95例，平均年齡44.2±8.2歲，女65例，平均年齡39.6±5.4歲。全部符合肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。

2 研究方法

2.1 全麻下纖維支氣管鏡檢查收集肺泡灌洗液： 160例患者均在入院后1周內(nèi)行纖維支氣管鏡檢查，所有患者均簽署纖維支氣管鏡檢查知情同意書。

2.2 檢測方法：160份肺泡灌洗液標(biāo)本分別做結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、TB-RNA檢測、TB-PCR檢測、濃縮集菌法找抗酸桿菌。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)采用BACTE MGIT960 System快速全自動分枝桿菌培養(yǎng)、藥敏檢測系統(tǒng)對肺泡灌洗液進(jìn)行培養(yǎng)，以6～8周為培養(yǎng)周期，結(jié)束后讀取結(jié)果。TB-RNA檢測方法采用上海仁度生物科技有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測試劑盒(RNA恒溫擴(kuò)增)對肺泡灌洗液進(jìn)行檢測。要求防污染操作，留取灌洗液后半小時內(nèi)送檢。檢測結(jié)果以<40為陽性。TB-PCR檢測采用奧博生物集團(tuán)有限公司的晶芯分枝桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)對肺泡灌洗液進(jìn)行檢測，用ABI公司的7300Real-Time PCR System熒光PCR檢測系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進(jìn)行讀取分析。檢測結(jié)果以Ct值小于40為陽性。濃縮集菌法找抗酸桿菌檢測是對肺泡灌洗液進(jìn)行抗酸桿菌染色，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，以每100個視野抗酸桿菌≥3個為陽性。

2.3 記錄160例患者臨床資料：臨床資料包括姓名、年齡、性別、診斷結(jié)果、胸部CT以及肺泡灌洗液的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、TB-RNA、TB-PCR及濃縮集菌法找抗酸桿菌檢測結(jié)果，根據(jù)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)將160例患者分為確診肺結(jié)核組、臨床診斷肺結(jié)核組及非肺結(jié)核組。

3 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以百分比表示，以受試者工作特征(Receiver operation characteristic， ROC)曲線評價診斷價值。以結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性為金標(biāo)準(zhǔn)，計算TB-RNA、TB-PCR及濃縮集菌法找抗酸桿菌的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、一致性等。三個實驗的一致性采用一致性檢驗，用Kappa(K)值表示，K值>0.75表示一致性好；0.4

結(jié) 果

1 臨床資料 本研究共納入患者160例，確診肺結(jié)核患者68例，臨床診斷肺結(jié)核患者45例，非肺結(jié)核患者47例，非肺結(jié)核組包括肺炎患者23例，支氣管擴(kuò)張患者14例、肺部腫瘤患者10例。因臨床診斷肺結(jié)核組病例對本研究無意義，故剔除，將其余115例患者數(shù)據(jù)做統(tǒng)計學(xué)分析。

2 確診肺結(jié)核及非肺結(jié)核患者檢測結(jié)果 68例確診的肺結(jié)核患者三種檢測方法的結(jié)果顯示濃縮集菌法找抗酸桿菌陽性47例(69.1%)，TB-PCR陽性42例(61.7%)，TB-RNA陽性53例(78.0%)。47例非肺結(jié)核患者三種檢測方法的結(jié)果顯示濃縮集菌法找抗酸桿菌陽性0例(0%)，TB-PCR陽性4例(8.5%)，TB-RNA陽性1例(2.1%)。

3 三種方法結(jié)果比較 將確診肺結(jié)核組和非肺結(jié)核組歸為1組，以結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性作為陽性對照，分別對比肺泡灌洗液濃縮集菌法找抗酸桿菌、TB-PCR及TB-RNA的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、ROC曲線下面積及Kappa(K)值，檢測結(jié)果顯示：三種檢測方法的敏感度分別是67.6%(46/68),63.2%(43/68),76.5%(52/68)；特異度分別是97.9%(46/47),89.4%(42/47),95.7%(45/47)；陽性預(yù)測值分別是97.9%(46/47),89.6%(43/48),96.3%(52/54)；陰性預(yù)測值分別是67.6%(46/68),62.7%(42/67),73.8%(45/67)；ROC曲線下面積分別是0.828,0.763,0.861；Kappa(K)值分別是0.613，0.494,0.690。研究表明三種檢測方法中TB-RNA敏感度較好，陰性預(yù)測值最高，ROC曲線下面積最大，與痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性結(jié)果的一致性最高(見表1)。

表1 濃縮集菌抗酸桿菌、TB-PCR、TB-RNA與痰培養(yǎng)結(jié)果對比

注：敏感度=真陽性例數(shù)/(真阻性例數(shù)+假陰性例數(shù))；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))

討 論

RNA恒溫擴(kuò)增實時檢測技術(shù)原理是通過設(shè)計特異性的Mtb核糖體RNA擴(kuò)增引物及優(yōu)化探針(Optimalprobe,patent pending)技術(shù)，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶及極高轉(zhuǎn)錄活性的T7RNA多聚酶來同時實現(xiàn)核酸恒溫擴(kuò)增和儀器實時熒光檢測，能夠快速、直觀地反映樣本中Mtb的感染情況。其優(yōu)點是除了可以檢測是否存在結(jié)核分枝桿菌，還可以檢測是活菌還是死菌。因為結(jié)核分枝桿菌死亡后RNA降解，而DNA不降解，所以RNA陽性意味著檢出了活菌。另外，TB-RNA檢測技術(shù)還可以作為結(jié)核病是否活動及用藥后療效的檢測[3]。

本研究結(jié)果顯示TB-RNA檢測具有較高的敏感度(76.5%)、特異度(95.7%)、陽性預(yù)測值(96.3%)和陰性預(yù)測值(73.8%)，由此可見三種檢測方法中TB-RNA敏感度較好，陰性預(yù)測值最高，ROC曲線下面積最大，與痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性結(jié)果的一致性最高。此項研究結(jié)果與范琳等[4]的研究結(jié)果敏感度(81.8%)、特異度(96.9%)、陽性預(yù)測值(95.9%)和陰性預(yù)測值(84.9%)相似。與崔振玲等[5]在痰標(biāo)本中TB-RNA研究中的結(jié)果相似，但與960培養(yǎng)的一致性低于其結(jié)果(88%)。張娟、蔡杏珊等[6-7]的研究得出痰標(biāo)本TB-RNA檢測時間短，敏感度高，特異度和陽性率都較好，且可以區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的結(jié)論，與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的結(jié)果有較好的一致性。

從我們的研究發(fā)現(xiàn)：支氣管肺泡灌洗液的TB-RNA檢測技術(shù)敏感度及特異度高，可以直接檢測到標(biāo)本中的活菌，而結(jié)核分枝桿菌DNA片段存在于活和死亡的細(xì)菌中，所以TB-PCR檢測假陽性較多，對比體現(xiàn)了TB-RNA檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。另外，TB-RNA檢測技術(shù)從標(biāo)本留取到檢測結(jié)果讀出僅2h,較960培養(yǎng)速度快，且得到了與培養(yǎng)69%的符合率。本研究也發(fā)現(xiàn)：68例培養(yǎng)陽性的確診肺結(jié)核患者中，支氣管肺泡灌洗液的TB-RNA檢測有53例陽性，檢出率為78%，15例未檢出，說明出現(xiàn)了假陰性結(jié)果。且非肺結(jié)核患者組中出現(xiàn)1例假陽性。原因分析如下：①支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本放置時間過長，導(dǎo)致RNA降解，影響陽性檢出率；②病灶定位的準(zhǔn)確性欠佳，影響灌洗液里細(xì)菌的數(shù)目。

支氣管肺泡灌洗液TB-RNA檢測是對于纖維支氣管鏡下留取的灌洗液進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的定性檢測手段，但是纖維支氣管鏡檢查為一項介入檢查，存在一定程度風(fēng)險，尤其對于合并癥較多的老年患者及幼兒存在爭議，受到禁忌癥的限制，因此檢查前需嚴(yán)格篩選，評估患者情況，以保證安全性。本研究結(jié)果顯示與其余兩種方法對比，TB-RNA有較高的敏感度，與培養(yǎng)結(jié)果有較好的一致性。同時，操作步驟和條件簡單，能明顯縮短檢測周期[8]，可以作為早期臨床診斷可靠方法，為及時治療提供依據(jù)。

[1] 張祖平，李小月，李宗光，等．熒光定量PCR 和抗酸染色在聯(lián)合診斷結(jié)核病及其療效考核中的應(yīng)用[J]．安徽醫(yī)學(xué)，2010,31(11):1353-1355 ．

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局，中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司，中國疾病預(yù)防控制中心．中國結(jié)核病防治規(guī)劃實施工作指南(2008年版)[M]．北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2009：25-27．

[3] Pojllock N ,Westerling J, Sloutsky A. Specimen solution increases the diagnostic utility of the gen-probe mycobacterium tuberculosis direct test[J]. Am JClin Pathol,2006,126:142-147.

[4] 范 琳，王 鵬，楊 妍，等.RNA恒溫擴(kuò)增實時熒光檢測技術(shù)檢測支氣管肺泡灌洗液對涂陰肺結(jié)核的快速診斷價值[J].中國防癆雜志，2015,37(2):140-144.

[5] 崔振玲，沙 巍，黃曉辰，等.RNA恒溫擴(kuò)增技術(shù)快速檢測痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的研究[J].中華結(jié)核與呼吸雜志，2011,34(12)：894-897.

[6] 張 娟，孫炳奇，王 悅，等.RNA恒溫擴(kuò)增實時檢測技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的價值[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2013,29(17)：2893-2895.

[7] 蔡杏珊，馬品云，張院良，等.實時熒光核酸恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)在結(jié)核診斷中的臨床應(yīng)用[J].中國防癆雜志，2014,36(6)：458-461.

[8] 羅 賢，張臘紅，洪理泉，等.恒溫擴(kuò)增實時熒光檢測技術(shù)在肺結(jié)核患者診斷中的應(yīng)用[J].中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2015,29(2)：183-185.

(收稿：2016-08-10)

肺結(jié)核/診斷 支氣管肺泡灌洗液 細(xì)胞培養(yǎng) @TB-RNA

R521

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.05.024