熊果酸對荷肺癌裸小鼠移植瘤生長抑制及促凋亡作用研究

陳奎利，毛哲哲，胡彥峰，王慧玲，程 忠

河北省邯鄲市中心醫(yī)院(邯鄲 056001)

熊果酸對荷肺癌裸小鼠移植瘤生長抑制及促凋亡作用研究

陳奎利，毛哲哲，胡彥峰，王慧玲，程 忠

河北省邯鄲市中心醫(yī)院(邯鄲 056001)

目的： 研究熊果酸(Ursolic acid, UA)對荷肺癌裸小鼠移植瘤生長的影響并探討其機制。方法：通過右側(cè)腹股溝區(qū)皮下接種人非小細胞肺癌A549細胞的方法建立荷肺癌裸小鼠模型，分別腹腔注射給予不同劑量UA(5、10、20 mg/(kg·d))和順鉑(2 mg/(kg·d))進行干預治療，療程14d。觀察裸小鼠生存狀態(tài)和腫瘤特征；稱量瘤重并計算抑瘤率；HE染色法觀察腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，TUNEL染色法觀察腫瘤組織細胞凋亡狀況，IHC法檢測腫瘤組織中Caspase-3、Bax、bcl-2蛋白表達并進行半定量分析。結(jié)果：與模型組比較發(fā)現(xiàn)：經(jīng)UA治療14 d能夠明顯改善荷肺癌裸小鼠飲食狀況和精神狀態(tài)，瘤體減小、活動度和硬度降低；較模型組，UA治療組移植瘤組織呈現(xiàn)細胞皺縮、片狀壞死等病變，凋亡細胞數(shù)量顯著增多，瘤體重量顯著減輕、抑瘤率顯著升高；移植瘤組織中Caspase-3蛋白和Bax蛋白表達顯著升高、bcl-2蛋白表達顯著降低，Bax/bcl-2比值顯著升高；UA上述作用均具有一定的劑量依賴性。結(jié)論:UA具有抑制荷肺癌裸小鼠移植瘤生長的作用，作用機制可能與UA調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白(Caspase-3、Bax、bcl-2)表達而促進腫瘤細胞凋亡有關(guān)。

熊果酸(Ursolic acid, UA)又名烏索酸，是一種具有抗氧化、抗炎等多種藥理學作用的五環(huán)三萜類化合物[1-2]，近年研究發(fā)現(xiàn)UA對肝癌等細胞生長均具有一定的治療作用[3]，但UA對肺癌是否具有治療作用尚未見文獻報道。本實驗通過制備荷肺癌裸小鼠模型并給予UA進行治療，探討UA對荷肺癌裸小鼠移植瘤生長的影響及其機制。

材料與方法

1 動物與細胞 Balb/C裸小鼠(雄性，鼠齡4～6周齡，體質(zhì)量18～22 g)購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物許可證號：SCXK(滬)2012-0005；人非小細胞肺癌A549細胞株購自中科院上海細胞庫。

2 試驗藥物與試劑 熊果酸購自陜西慧科植物開發(fā)有限公司(純度≥98%)；注射用順鉑購自齊魯制藥(海南)有限公司；胰蛋白酶、MTT購自美國Sigma公司；TUNEL試劑盒購自南京建成生物研究所；Caspase-3、Bax、bcl-2單抗和SP免疫組化試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

3 荷肺癌裸小鼠模型的制備、分組與給藥 體外培養(yǎng)并取對數(shù)生長期人非小細胞肺癌A549細胞，用無菌PBS溶液制備濃度為5×107/ml細胞懸液，于右側(cè)腹股溝區(qū)皮下注射接種(0.2 ml)A549細胞懸液建立荷肺癌裸小鼠模型，7 d后接種部位出現(xiàn)直徑8～10 mm皮下結(jié)節(jié)即可認定為造模成功。取90只模型裸小鼠隨機分為模型組、UA(5、10、20 mg/(kg·d))組和順鉑(2 mg/(kg·d))組，各組均16只，腹腔注射給藥，療程14 d。

4 裸小鼠生存狀態(tài)、腫瘤特征的觀察及瘤體重量、抑瘤率的測定 治療完成后，分別觀察各組裸小鼠生存狀態(tài)(飲食狀況、精神狀態(tài)等)和瘤體特征(瘤體大小、活動度、硬度等)；采用頸椎脫臼方法處死動物、剝?nèi)∧[瘤組織并稱重，計算抑瘤率：抑瘤率(%)=(模型組瘤重-治療組瘤重)/模型組瘤重×100%。

5 腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變和細胞凋亡狀況觀察 將腫瘤組織置于4%多聚甲醛溶液中固定72h，然后依次進行石蠟包埋、切片、脫蠟水化、常規(guī)HE染色和復染，通過顯微鏡觀察腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。石蠟切片經(jīng)脫蠟水化處理后，按照TUNEL染色試劑盒操作方法步驟進行處理，通過顯微鏡觀察腫瘤組織細胞凋亡狀況；計算凋亡指數(shù)(Apoptosis Index, AI)：每張染色切片選取5各視野(各染色切片，選取視野部位保持一致)，分別計數(shù)各視野中細胞總數(shù)和凋亡細胞數(shù)，計算AI：AI(%)=(凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%。

6 凋亡相關(guān)蛋白表達的檢測 取制備好的石蠟切片，按照SP免疫組織化學試劑盒操作步驟，采用IHC法檢測移植瘤組織中凋亡相關(guān)的Caspase-3、Bax、bcl-2蛋白表達；半定量分析：每張染色切片選取5個視野(各染色切片，選取視野部位保持一致)，通過BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)測定各個視野平均光密度值(OD)，以O(shè)D值表示腫瘤組織Caspase-3、Bax、bcl-2蛋白表達密度；并根據(jù)OD值計算Bax/bcl-2表達比值。

7 統(tǒng)計學方法 運用統(tǒng)計學軟件SPSS 15.0進行數(shù)理統(tǒng)計分析，計量資料組間均數(shù)比較采用One-Way ANOVA分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 各組裸小鼠生存狀態(tài)及移植瘤生長特征 與模型組比較， UA各組和順鉑組荷肺癌裸小鼠精神狀態(tài)、飲食狀況均明顯改善，移植瘤組織瘤體較小、活動度和硬度均較低，其中UA 20 mg/(kg·d)組上述效果最為顯著。

2 各組裸小鼠移植瘤瘤體重量和抑瘤率 見表1。與模型組比較，UA(10、20 mg/(kg·d))組和順鉑組荷肺癌裸小鼠移植瘤重量顯著減輕(P<0.05)，抑瘤率顯著升高(P<0.01)；UA 20 mg/(kg·d)治療組瘤體重量和抑瘤率與順鉑組比較均無顯著性差異(P>0.05)。

表1 各組裸小鼠移植瘤瘤體重量和抑瘤率

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 各組裸小鼠移植瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的影響 見圖1。與模型組比較，UA各組和順鉑組荷肺癌裸小鼠移植瘤組織細胞呈現(xiàn)不同程度皺縮、數(shù)量減少、間隙增大以及片狀壞死等明顯的病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，以UA 20 mg/(kg·d)組效果最為顯著。

A：模型組；B：UA 5mg/(kg·d)組；C：UA 10mg/(kg·d)組；D：UA 20mg/(kg·d)組；E：順鉑2mg/(kg·d)組

4 各組裸小鼠移植瘤組織細胞凋亡狀況的影響見圖2及表2。與模型組比較，UA各組和順鉑組荷肺癌裸小鼠移植瘤組織細胞凋亡數(shù)量明顯增多，以UA 20mg/(kg·d)組最為顯著。計算并比較各組荷肺癌裸小鼠移植瘤細胞AI發(fā)現(xiàn)：與模型組比較，UA各組和順鉑組移植瘤細胞AI顯著升高(P<0.01)；與順鉑組比較，UA 20mg/(kg·d)組移植瘤細胞AI顯著升高(P<0.05)。

A：模型組；B：UA 5mg/(kg·d)組；C：UA 10mg/(kg·d)組；D：UA 20mg/(kg·d)組；E：順鉑2mg/(kg·d)組

組 別nAI(%)模型組162.64±1.08UA5mg/(kg·d)組1622.73±4.95**UA10mg/(kg·d)組1639.61±6.87**UA20mg/(kg·d)組1660.94±8.52**△順鉑2mg/(kg·d)組1645.73±6.19**

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與順鉑組比較，△P<0.05

5 各組裸小鼠移植瘤組織中Caspase-3蛋白表達 見圖3及表3。與模型組比較，UA各組和順鉑組荷肺癌裸小鼠移植瘤組織Caspase-3蛋白表達量顯著升高，UA 20 mg/(kg·d)組最為顯著。半定量分析：與模型組比較，UA各組和順鉑組裸小鼠移植瘤Caspase-3表達OD值顯著升高(P<0.05)；與順鉑組比較，UA 20 mg/(kg·d)組Caspase-3表達OD值顯著升高(P<0.05)。

A：模型組；B：UA 5mg/(kg·d)組；C：UA 10mg/(kg·d)組；D：UA 20mg/(kg·d)組；E：順鉑2mg/(kg·d)組

6 各組裸小鼠移植瘤組織bcl-2蛋白和Bax蛋白表達 見圖4，5及表3。

A：模型組；B：UA 5mg/(kg·d)組；C：UA 10mg/(kg·d)組；D：UA 20mg/(kg·d)組；E：順鉑2mg/(kg·d)組

A：模型組；B：UA 5mg/(kg·d)組；C：UA 10mg/(kg·d)組；D：UA 20mg/(kg·d)組；E：順鉑2mg/(kg·d)組

與模型組比較，UA各組和順鉑組荷肺癌裸小鼠移植瘤組織中Bax蛋白表達量顯著降低、bcl-2蛋白表達量顯著降低，以UA 20 mg/(kg·d)組最為顯著。進行半定量分析：與模型組比較，UA(10、20 mg/(kg·d))組和順鉑組裸小鼠移植瘤組織Bax蛋白表達OD值顯著升高且bcl-2蛋白表達OD值顯著降低(P<0.05)；UA 20 mg/(kg·d)組bcl-2和Bax表達OD值與順鉑組比較均無顯著性差異(P>0.05)。計算Bax/bcl-2表達比值并進行統(tǒng)計分析：與模型組比較，UA各組和順鉑組Bax/bcl-2表達比值顯著升高(P<0.05)；與順鉑組比較，UA 20 mg/(kg·d)組Bax/bcl-2表達比值顯著升高(P<0.05)。

表3 各組裸小鼠移植瘤組織中Caspase-3、Bax、bcl-2表達OD值及Bax/bcl-2表達比值

注：與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01；與順鉑組比較，△P<0.05

討 論

我國肺癌發(fā)生率和致死率據(jù)惡性腫瘤之首[4]，目前臨床上對肺癌的治療方案主要有外科手術(shù)、放療、化療以及分子靶向治療等[5]。但超過80%的肺癌患者確診時就已發(fā)展為中晚期，已失去手術(shù)機會，只能采取放化療，而放化療并發(fā)癥較多，身體較差的晚期肺癌患者難以承受。近年來，中草藥及其提取物以毒副作用小的特點，成為肺癌治療研究的熱點。

熊果酸(Ursolic Acid, UA)是一種具有多種生物學活性的五環(huán)三萜類化合物[1-5]，近年來熊果酸抗腫瘤活性逐漸得到醫(yī)藥研究工作者的關(guān)注，崔兵兵等[3]研究發(fā)現(xiàn)：UA能夠誘導細胞凋亡而表現(xiàn)出對肝癌SMMC-7721細胞生長的抑制作用；UA對卵巢癌、宮頸癌等婦科腫瘤細胞生長具有抑制作用[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)UA干預治療能夠明顯改善荷肺癌裸小鼠精神狀態(tài)、飲食狀況等一般生存狀態(tài)，并影響移植瘤組織大小、硬度和活動度；能夠顯著降低瘤體重量、提高抑瘤率，能夠誘導荷肺癌裸小鼠移植瘤細胞凋亡和移植瘤組織壞死；提示UA可能通過誘導腫瘤細胞凋亡而對荷肺癌裸小鼠移植瘤生長起到抑制作用。

Caspase-3蛋白和Bcl-2蛋白家族(bcl-2、Bax)在細胞凋亡過程中發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用。Caspase-3能夠激活各種凋亡刺激因子而參與細胞凋亡的啟動及整個凋亡過程的調(diào)節(jié)[7-8]；bcl-2可直接與凋亡刺激因子結(jié)合而抑制Caspase-3的激活、抑制Bax的細胞毒性作用、改善細胞內(nèi)鈣濃度，從而表現(xiàn)出抑制細胞凋亡的作用[8]；Bax也屬于Bcl-2基因家族，能夠誘導線粒體滲透性改變而釋放細胞色素C、激活促凋亡蛋白Caspase-9，而起到促細胞凋亡作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)：Bax能夠與bcl-2形成異二聚體而抑制bcl-2活性，因此Bax/bcl-2比值更加能夠體現(xiàn)Bcl-2基因家族對細胞凋亡的調(diào)控作用[9]。

總之，UA可能通過誘導腫瘤細胞凋亡而對荷肺癌裸小鼠移植瘤生長起到抑制作用，作用機制可能與UA能夠調(diào)節(jié)Caspase-3、bcl-2、Bax蛋白表達有關(guān)。

[1] 郝冉冉,王晨靜,仲偉珍,等.熊果酸對ox-LDL誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化損傷的保護作用[J].中藥藥理與臨床，2014,30(4):29-32.

[2] 王 翔,閻 昭,王 旭,等.熊果酸納米脂質(zhì)體的鎮(zhèn)痛作用和抗炎活性[J].山東醫(yī)藥, 2013,53(29):31-35.

[3] 崔兵兵,程麗芳,侯立靜,等.熊果酸抑制人肝癌SMMC-7721細胞生長及凋亡的實驗研究[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(18):181-184.

[4] 王德欽,郭新軍.晚期肺癌264例生存質(zhì)量調(diào)查及影響因素分析[J].陜西醫(yī)學雜志, 2013, 42(1):109-111.

[5] 周宏灝,劉 潔.抗腫瘤藥物的基因?qū)蛐詡€體化治療[J].腫瘤藥學, 2011,1(1):6-11.

[6] 王麗琴.熊果酸對人上皮性卵巢癌SKOV3細胞增殖和凋亡的影響[J].安徽醫(yī)藥,2016, 20(4):647.

[7] 張建榮,柏江鋒,潘 強,等.復方桂枝茯苓丸對腦缺血再灌注損傷大鼠Caspase-3 TGF-β1的影響[J].陜西中醫(yī),2013,34(8):1087-1089.

[8] 雷懷成,朱方成,魏 來.大鼠馬錢子堿中毒肝細胞Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的研究[J].陜西醫(yī)學雜志,2013,42(3):278-288.

[9] Saeedi-Borujeni MJ,Hami J， Haghir H,etal. Evaluation of Bax and bcl-2 Proteins expression in the rat hippocampus due to childhood febrile seizure[J]. Iran J Child Neurol,2016,10(1):53-60.

(收稿：2016-07-20)

The effects of Ursolic acid on growth inhibition and apoptosis of transplanted lung cancer in nude mice

Chen Kuili, Mao Zhezhe, Hu Yanfeng, et al.

Handan Central Hospital of Hebei Province (Handan 056001)

Objective： To investigate the inhibitive effects and mechanism of Ursolic Acid (UA) on xenografts growth in lung cancer of nude mice. Methods ：The nude mice models bearing lung cancer were made by injecting inoculation human lung cell line A549 were treated with UA(5, 10, 20 mg/(kg·d)) and Cisplatin 2 mg/(kg·d) for 14d. The nude mice general states and tumor growth conditions were observed, the histopathological changes of tumor tissue was observed by HE staining; the tumor cells apoptosis was detected by TUNEL staining; the expression of Caspase-3, Bax,bcl-2 protein were detected by immunohistochemistry (IHC). Results：The nude mice bearing lung cancer were treated with UA for 14 d appeared food situation mental condition were improved, tumor was reduced, activity and hardness were poorer; necrosis presentation, tumor cell shrinkage and other pathological morphological changes appeared, the number of apoptotic cells in tumor tissue was significantly increased; the tumor weight of UA treated groups were significantly decreased and the inhibition rate were significantly increased; the expression of Bax and Caspase-3 were significantly increased, the expression of bcl-2 protein was significantly decreased, and the ratio of Bax/bcl-2 were significantly increased, all of the effects of UA above were dose-dependent with a certain. Conclusion：UA has inhibitive effects on xenografts growth in lung cancer of nude mice, which perhaps related to its effects of regulating the expression of apoptosis-related proteins (Caspase-3, Bax, bcl-2) to promoting tumor cell apoptosis.

Lung neoplasms/drug effective Arctostaphylos/therapeutic use Neoplasms metastasis Growth Animals,laboratory @Mice

肺腫瘤/藥物作用 熊果屬/治療應(yīng)用 腫瘤轉(zhuǎn)移 生長 動物，實驗 小鼠

R734.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.05.002