診斷超聲聯(lián)合微泡對(duì)兔VX2腫瘤的血流增強(qiáng)效應(yīng)

喬學(xué)研 陳重 益磋 高文宏 高順記 劉政

·實(shí)驗(yàn)研究·

診斷超聲聯(lián)合微泡對(duì)兔VX2腫瘤的血流增強(qiáng)效應(yīng)

喬學(xué)研 陳重 益磋 高文宏 高順記 劉政

目的探討不同機(jī)械指數(shù)（MI）的診斷超聲聯(lián)合微泡對(duì)兔VX2腫瘤的血流增強(qiáng)效應(yīng)。方法選取健康雄性新西蘭白兔40只，采用單側(cè)大腿內(nèi)側(cè)瘤組織塊接種法接種VX2腫瘤，造模成功后將其隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)1組（MI＝0.3）、實(shí)驗(yàn)2組（MI＝0.7）、實(shí)驗(yàn)3組（MI＝1.4）及對(duì)照組，每組各10只。抽取0.2ml“脂氟顯”用5.0ml生理鹽水稀釋后經(jīng)耳緣靜脈通道勻速推入，同時(shí)分別經(jīng)不同機(jī)械指數(shù)輻照腫瘤，對(duì)照組予以超聲假照，時(shí)間均為5min。儲(chǔ)存治療前后動(dòng)態(tài)造影圖像，并用造影分析軟件分析，記錄峰值強(qiáng)度（PI）和曲線下面積（AUC）。結(jié)果實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)3組治療前后PI比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.028、0.018），實(shí)驗(yàn)2組、對(duì)照組治療前后PI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.994、0.978）；實(shí)驗(yàn)3組治療前后AUC值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.009），實(shí)驗(yàn)1、2組及對(duì)照組治療前后AUC值比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.099、0.497、0.898）。結(jié)論低能量診斷超聲（MI＝0.3）聯(lián)合微泡可豐富兔VX2腫瘤血供，高能量診斷超聲（MI＝1.4）可減少血流灌注。

診斷超聲；微泡；血流增強(qiáng)效應(yīng)；VX2腫瘤，兔

近年低強(qiáng)度超聲聯(lián)合載藥微泡或普通微泡對(duì)腫瘤化療的增強(qiáng)作用已有較多研究［1］，但對(duì)超聲激勵(lì)微泡產(chǎn)生的腫瘤血管效應(yīng)變化卻少有研究。腫瘤血流灌注的豐富程度直接影響其化療效果［2－3］，其機(jī)制可能是腫瘤內(nèi)低灌注限制了化療藥物的運(yùn)輸，使藥物在腫瘤內(nèi)分布不均勻，不能達(dá)到有效的治療水平，并且低灌注直接導(dǎo)致乏氧，糖酵解增加使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境偏酸性，對(duì)一些化療藥物不敏感并使細(xì)胞在基因和蛋白質(zhì)水平發(fā)生改變，產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象［4］。前期研究［5-7］顯示，高聲壓（2.6～4.8MPa）治療超聲激勵(lì)微泡空化對(duì)動(dòng)物腫瘤微血管可以產(chǎn)生損毀效應(yīng)，并阻斷腫瘤循環(huán)，而低聲壓（1.0MPa）超聲卻可能刺激兔VX2腫瘤血流灌注增加［8］。為進(jìn)一步了解不同聲壓的低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡對(duì)腫瘤可能產(chǎn)生的血管效應(yīng)（即血流灌注變化效應(yīng)），本研究采用不同強(qiáng)度機(jī)械指數(shù)（mechanical index，MI）的診斷超聲聯(lián)合微泡刺激動(dòng)物腫瘤，旨在探討超聲強(qiáng)度與腫瘤局部血流灌注變化的關(guān)系。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康新西蘭白兔40只，雄性，體質(zhì)量2.0～2.5 kg；VX2腫瘤荷瘤兔1只，均由第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

二、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.儀器：使用飛依諾VINNO 70彩色多普勒超聲診斷儀，L-4高頻線陣探頭，頻率4～12MHz；配備微泡超聲空化調(diào)控功能（即Vflash功能），具有可變區(qū)域的弱聚焦式超聲發(fā)射功能。CX31光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯，日本）。

2.試劑：微泡造影劑為第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院超聲科研制的“脂氟顯”，核心氣體為全氟丙烷，微泡濃度（4～9）×109/m l，98%粒徑＜8μm，平均粒徑2μm。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.動(dòng)物模型制備：0.30ml/kg速眠新Ⅱ肌注VX2腫瘤荷瘤兔，耳緣靜脈注射2%戊巴比妥鈉（0.2m l/kg）維持麻醉，取仰臥位腹部備皮，無菌剝除腫瘤，剔除周邊結(jié)締組織，去中央壞死區(qū)，將新鮮魚肉樣腫瘤組織浸于無菌生理鹽水，分割為1mm3的小塊，接種于40只健康新西蘭白兔后肢內(nèi)側(cè)肌層內(nèi)，約25 d待腫瘤長(zhǎng)至1.0 cm左右時(shí)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.動(dòng)物分組：將40只荷瘤兔隨機(jī)分為4組，即實(shí)驗(yàn)1組（MI=0.3）、實(shí)驗(yàn)2組（MI=0.7）、實(shí)驗(yàn)3組（MI=1.4）及對(duì)照組（予以超聲假照），每組各10只。

3.低強(qiáng)度超聲治療：治療前行常規(guī)超聲檢查，測(cè)量腫瘤大小，觀察血流情況；然后行超聲造影檢查：團(tuán)注脂氟顯0.1m l，尾隨1.5m l生理鹽水沖管，數(shù)字化儲(chǔ)存超聲造影圖像。抽取“脂氟顯”0.2m l用5.0ml生理鹽水稀釋，5min內(nèi)經(jīng)耳緣靜脈通道勻速推入；同時(shí)應(yīng)用L-4探頭的Vflash模式進(jìn)行超聲治療，輻照時(shí)超聲探頭置于腫瘤體表處，將弱聚焦區(qū)聚焦于腫瘤區(qū)域，注意避免探頭對(duì)腫瘤產(chǎn)生壓迫。各組超聲頻率均為4M Hz，脈沖重復(fù)頻率20Hz，脈沖寬度18個(gè)周期，脈沖時(shí)間1.2 s，間歇時(shí)間5.0 s，總治療時(shí)間5min。對(duì)照組予以超聲假照，僅以探頭置于腫瘤表面，時(shí)間為5min。超聲治療結(jié)束后即刻行超聲造影檢查，“脂氟顯”劑量及注射方法同前。

4.病理學(xué)檢查：造影結(jié)束后30min取腫瘤邊緣?mèng)~肉樣組織，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察腫瘤組織結(jié)構(gòu)。

5.超聲造影影像數(shù)據(jù)分析：使用超聲儀器自帶的造影分析功能進(jìn)行圖像分析，得到治療前后兩次造影的時(shí)間-強(qiáng)度曲線，記錄峰值強(qiáng)度（PI）和曲線下面積（AUC）。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、造模結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)共納入40只荷瘤兔，實(shí)驗(yàn)1、2、3組及對(duì)照組移植瘤平均最大徑分別為（1.194±0.231）cm、（1.189±0.172）cm、（1.187±0.288）cm及（1.190±0.231）cm，各組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、超聲造影治療情況

超聲治療動(dòng)物共40只，無死亡及腫瘤破裂等情況出現(xiàn)。

治療前各組移植瘤的血流灌注情況均為動(dòng)脈相高灌注，部分腫瘤中心可見小部分區(qū)域的充盈缺損，所有腫瘤邊緣區(qū)域均血供豐富。視覺評(píng)價(jià)前后兩次造影情況：實(shí)驗(yàn)1組中，7只兔治療后腫瘤血供較治療前明顯增加，1只腫瘤血供較治療前減少，其余2只未見明顯變化；實(shí)驗(yàn)2組中，5只兔治療后腫瘤血供較治療前減少，3只腫瘤血供較治療前增加，其余2只未見明顯變化；實(shí)驗(yàn)3組中，7只兔治療后腫瘤血供較治療前減少，1只腫瘤血供較治療前增加，2只無明顯變化；對(duì)照組治療前后造影情況無明顯差異。見圖1。

各組治療前后超聲造影參數(shù)PI及AUC比較見表1。各組治療前腫瘤PI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)3組治療前后PI比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.028、0.018），實(shí)驗(yàn)2組、對(duì)照組治療前后PI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.994、0.978）；實(shí)驗(yàn)3組治療前后AUC值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009），實(shí)驗(yàn)1、2組及對(duì)照組治療前后AUC比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.099、0.497、0.898）。各組治療前后PI差值及AUC差值的比較見圖2，3。

圖1 各組治療前后常規(guī)超聲及超聲造影圖

表1 各組治療前后超聲造影參數(shù)PI及AUC比較（±s）

表1 各組治療前后超聲造影參數(shù)PI及AUC比較（±s）

PI：峰值強(qiáng)度；AUC：曲線下面積。

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圖2 各組治療前后PI差值比較

三、病理結(jié)果

光鏡下可見各組腫瘤組織中心無壞死或不同程度壞死，有活性的腫瘤組織排列成條索狀，細(xì)胞核大深染，表現(xiàn)出明顯的異形性。各組腫瘤病理表現(xiàn)相似，實(shí)驗(yàn)1～3組均未見組織水腫、微小血栓形成及新鮮出血。見圖4。

圖3 各組治療前后AUC差值比較

討論

圖4 各組超聲治療后病理圖（HE染色，圖A1、B1、C1、D1為放大200倍，圖A2、B2、C2、D2為放大400倍）

低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡治療產(chǎn)生的腫瘤整體血流灌注變化（即血管效應(yīng)）存在一定的規(guī)律性，但以往研究較少。而臨床上針對(duì)不同的腫瘤治療目的需要不同的血流灌注，如射頻消融肝癌需減少產(chǎn)生的熱沉效應(yīng)，因此需減少肝腫瘤的血流［7］；而多數(shù)以化療作為主要治療方法的腫瘤，則需豐富腫瘤血供，從而增強(qiáng)化療效果［9］。故探索不同超聲強(qiáng)度腫瘤整體血流灌注的變化顯得十分必要。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)1組雖然治療前后AUC比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但治療后AUC明顯增高，分析原因可能是由于樣本量偏少所致，結(jié)合治療后的PI及AUC與治療前的PI及AUC差值均數(shù)為正值，可知實(shí)驗(yàn)1組治療后腫瘤血流豐富；實(shí)驗(yàn)3組中，治療前后PI及AUC比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)合治療前后其差值均數(shù)為負(fù)值，可知實(shí)驗(yàn)3組治療后腫瘤血流減少；而實(shí)驗(yàn)2組治療后腫瘤血流表現(xiàn)為豐富、減少、無明顯變化三種狀態(tài)，介于實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)3組之間，表現(xiàn)為治療前后PI與AUC的差值均數(shù)接近于0，而標(biāo)準(zhǔn)差偏大，體現(xiàn)了PI與AUC的變化多樣；對(duì)照組治療前后則無明顯變化，差值的均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差均接近于0，這說明了血管效應(yīng)的變化具有一定的趨勢(shì)，即低MI可刺激腫瘤血供豐富，而高M(jìn)I則可阻斷腫瘤血供，中等能量的MI產(chǎn)生的血流變化介于兩者之間，這與微泡的使用及超聲發(fā)射能量的變化及其方式的相關(guān)參數(shù)有關(guān)，且由于個(gè)體差異的存在，實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果具有一定的隨機(jī)性。

此外，本實(shí)驗(yàn)病理結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組超聲治療后均未對(duì)腫瘤局部及其周邊組織產(chǎn)生明顯的病理變化，說明本實(shí)驗(yàn)使用的診斷超聲能量水平在治療時(shí)間內(nèi)未產(chǎn)生組織結(jié)構(gòu)改變，是安全的。但本研究?jī)H進(jìn)行了HE病理染色觀察，未進(jìn)行電鏡觀察和免疫組化等監(jiān)測(cè)，對(duì)血管內(nèi)皮的亞微結(jié)構(gòu)變化仍需進(jìn)一步觀察。推測(cè)分析超聲產(chǎn)生不同血流灌注變化的機(jī)制，低MI的診斷超聲聯(lián)合微泡產(chǎn)生的聲孔效應(yīng)可能刺激腫瘤微血管內(nèi)皮產(chǎn)生輕度損傷及無菌性炎癥反應(yīng)，進(jìn)而快速出現(xiàn)血管擴(kuò)張充血，增強(qiáng)血流灌注；而高M(jìn)I診斷超聲則使血管通透性明顯增高，血管內(nèi)皮或腫瘤組織產(chǎn)生暫時(shí)性水腫，壓迫血管腔變窄，產(chǎn)生血流灌注減少，此現(xiàn)象在本課題組前期血管毀損術(shù)實(shí)驗(yàn)［7］中已得到證實(shí)，但因本實(shí)驗(yàn)采用的診斷超聲與前期實(shí)驗(yàn)使用的治療超聲相比，其聲壓及占空比均較低，因此未能產(chǎn)生前期實(shí)驗(yàn)中明顯的組織變化。此外本實(shí)驗(yàn)采用的腫瘤模型為兔VX2皮下移植瘤模型，血供豐富，成瘤率高［10］，但其生物學(xué)行為仍與自發(fā)腫瘤有一定的區(qū)別，因此本實(shí)驗(yàn)中觀察到的血流灌注變化情況及其相應(yīng)參數(shù)仍需在自發(fā)腫瘤模型上進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步證明，低MI診斷超聲聯(lián)合微泡可以增強(qiáng)兔VX2的血流灌注，而高M(jìn)I的診斷超聲聯(lián)合微泡可以減少兔VX2的血流灌注，但均不會(huì)對(duì)組織產(chǎn)生明顯的結(jié)構(gòu)性變化。此規(guī)律可為臨床工作中多種腫瘤的治療提供可靠依據(jù)。

［1］Zhu F，Jiang Y，Luo F，et al.Effectiveness of localized ultrasoundtargeted microbubble destruction with doxorubicin liposomes in H22 mousehepatocellularcarcinomamodel［J］.JDrugTarget，2015，23（4）：323-334.

［2］周建華，鄭瑋，操隆輝，等.超聲造影定量分析組織血流灌注參數(shù)評(píng)價(jià)腫瘤化療療效［J］.中華醫(yī)學(xué)超聲雜志（電子版），2010，7（9）：3-6.

［3］Yu T，Li SL，Zhao JZ，et al.Ultrasound：a chemotherapy sensitizer［J］.TechnolCancerRes Treat，2006，5（1）：51-60.

［4］Ma DD，Lu HX，Xu LS，et al.Polyphyllin D exerts potent antitumour effects on Lewis cancer cells under hypoxic conditions［J］. JIntMed Res，2009，37（3）：631-640.

［5］高順記，李佩倞，趙洋，等.微泡增強(qiáng)的超聲空化阻斷腫瘤微循環(huán)的初步研究［J］.中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（2）：110-112.

［6］薛雯，張莉，李莎，等.超聲峰值負(fù)壓與腫瘤微循環(huán)阻斷程度的相關(guān)性研究［J］.中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)雜志，2014，30（4）：372-375.

［7］Liu Z，Gao S，Zhao Y，et al.Disruption of tumor neovasculature by microbubble enhanced ultrasound：a potentialnew physical therapy of anti－angiogenesis［J］.Ultrasound Med Biol，2012，38（2）：253－261.

［8］呂明德.腫瘤消融治療現(xiàn)狀與進(jìn)展［C］.中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)全國(guó)介入超聲及腫瘤消融學(xué)術(shù)會(huì)議，2011.

［9］Galmarini FC，Galmarini CM，Sarchi MI，et al.Heterogeneous distribution of tumor blood supply affects the response to chemotherapy in patients with head and neck cancer［J］.Microcirculation，2000，7（6 pt1）：405－410.

［10］魏強(qiáng)，方亮，楊繼金，等.兔肝臟、肌肉、皮下VX2腫瘤模型的建立和對(duì)比研究［J］.介入放射學(xué)雜志，2013，22（11）：931－935.

Vascular effectof rabbit VX2tumor induced by diagnostic ultrasound w ithm icrobubbles

QIAOXueyan，CHEN Zhong，YICuo，GaoWenhong，Gao Shunji，LIU Zheng
Departmentof Ultraso und，Xinqiao Hospital，Third MilitaryMedical University，Chongqing 400037，China

ObjectiveTo investigate the different vasculareffectof rabbit VX2tumor induced by differentmechanical index（MI）of diagnosticultrasound combinedwithmicrobubbles.MethodsForty rabbit s with VX2tumorwere treated bydiagnostic ultrasound with differentMI（0.3，0.7，1.4）with microbubbles asexperimentgroup（experimentgroup 1，2，3）and negative control withoutany treatment（controlgroup），each group included 10 rabbits.0.2mlmicrobubbles in 5.0mlnormalsalinewasused asa therapeutic dose，the treatment timewas 5min.The tumor blood perfusion was imaged with contrast－enhanced u ltrasound before and after treatmentwhich were analyzed by the contrast analysis software，the peak intensity（PI）and the area under curve（AUC）were obtained.ResultsThere were significant differences of PI before and after the treatment in experiment group 1 and experimentgroup 3（P＝0.028，0.018），and PIwere not statistically significant between experimentgroup 2 and control group before and after the treatment（P＝0.994，0.978）.The AUC w as significantly different before and after the treatment in the experimentgroup 3（P＝0.009），while there were no statistical significance of AUC before and after the treatment in experiment group 1，2 and control group（P＝0.099，0.497，0.898）.C onclusion Low－intensity diagnostic ultrasound（MI＝0.3）combined with microbubbles can enrich the blood perfusion of VX2tumor in rabbits，and high－intensity diagnostic ultrasound（MI＝1.4）can decrease the blood perfusion.

Diagnostic u ltrasound；Microbubble；Vasculareffect；VX2tumor，rabbit

R735.7；R445.1

A

2016-09-23）

國(guó)家自然科學(xué)基金科學(xué)儀器專項(xiàng)項(xiàng)目（81227004）

400037重慶市，第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院超聲科

劉政，Email：liuzhengs＠hotmail.com