養(yǎng)陰清肺湯對肺炎支原體肺炎作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

湯玉梅，任園園，吳振起

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，遼寧 沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032

肺炎支原體肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)是一種以發(fā)熱、劇烈干咳以及胃腸道癥狀等為主要臨床表現(xiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病[1]。MPP多歸屬于中醫(yī)的“咳嗽”、“肺炎喘嗽”等范疇，疾病前期外感風(fēng)邪,外邪由口鼻或皮毛而入，侵犯肺衛(wèi)，出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、鼻煽、痰鳴等證候，發(fā)為肺炎喘嗽；疾病后期多為氣陰兩虛證[2-3]。MPP 的臨床治療應(yīng)以清熱化痰、止咳平喘、益氣養(yǎng)陰為主。養(yǎng)陰清肺湯出自《重樓玉鑰》，盛麗先教授取養(yǎng)陰清肺湯滋陰涼潤之功，用于肺炎支原體感染后陰虛內(nèi)熱咳嗽[4]。養(yǎng)陰清肺湯成分十分復(fù)雜，其治療MPP 的作用機(jī)制尚未明確。因此，本研究擬利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探究養(yǎng)陰清肺湯主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、核心靶點(diǎn)及信號通路之間的關(guān)系，為進(jìn)一步闡述養(yǎng)陰清肺湯治療MPP的藥理機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 養(yǎng)陰清肺湯活性成分及靶點(diǎn) 將養(yǎng)陰清肺湯全方生地黃、麥冬、牡丹皮、白芍、薄荷、玄參、浙貝母、甘草分別輸入TCMSP、TCMID、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫檢索養(yǎng)陰清肺湯活性成分作用靶點(diǎn)，根據(jù)篩選閾值口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18 進(jìn)行篩選，并利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)將靶蛋白轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的靶基因。在GeneCards (https：//www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫以“Mycoplasma pneumoniae pneumonia”為檢索詞，搜索肺炎支原體肺炎靶基因，將肺炎支原體靶基因與養(yǎng)陰清肺湯活性成分靶基因輸入Venny2.1 軟件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，取得兩者交集靶基因作為養(yǎng)陰清肺湯治療肺炎支原體靶基因，將活性成分及其靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件，構(gòu)建活性成分-抗肺炎支原體靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 養(yǎng)陰清肺湯活性成分抗MPP 靶點(diǎn)相互作用研究 將篩選得到的活性成分-抗肺炎支原體靶點(diǎn)導(dǎo)入 STRING 平臺(https：//string-db.org/cgi/input.pl)構(gòu)建靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，低相互作用閾值為“medium confidence”，其他參數(shù)保持默認(rèn)值。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，利用“Network Analysis”功能計(jì)算蛋白節(jié)點(diǎn)的度值(Degree)和介數(shù)(Betweenness)2 個重要網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，選取Degree在平均值之上的靶蛋白作為養(yǎng)陰清肺湯治療肺炎支原體的關(guān)鍵靶標(biāo)。

1.3 養(yǎng)陰清肺湯活性成分抗MPP 靶點(diǎn)基因本體(GO)功能富集京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 將養(yǎng)陰清肺湯抗MPP 關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入Omicshare (https://www.omicshare.com/tools/)云平臺進(jìn)行GO功能富集分析；利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號通路分析，物種與背景設(shè)置均為“Homo sapiens”(智人)進(jìn)行操作(https：//david.ncifcrf.gov/)對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析。依據(jù)P＜0.001篩選養(yǎng)陰清肺湯抗MPP靶點(diǎn)富集的生物功能及信號通路，以闡明養(yǎng)陰清肺湯的活性成分對肺炎支原體肺炎靶點(diǎn)具有一定的生物功能，以及在相關(guān)信號通路中的起調(diào)控作用。

2 結(jié)果

圖1 活性成分-MPP靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 活性成分-MPP靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

編號YY1 YY2 YY3 YY4 YY5 YY6成分10-de-oxyeucommiol 6-O-sec-hydroxyaeginetoyl ajugol adenosine coniferin diincarvilone A ferulic acid methyl ester YY7 YY8 YY9 YY10 YY11 YY12 YY13 YY14 YY15 YY16 YY17 YY18靶點(diǎn)PTGER3、EPHX1 MMP9、MMP8、MAPK14 GAPDH、EGFR、PDCD4、MAPK1、HSPA1A TYMP、MMP8 MAPK14、MAPK1、TNF、PARP1、PTGS2、NR3C1、MAPK10、TK1、RET、TKT MMP9、EGFR、PARP1、PTGS2、RET、TLR4、CYP1A2、STAT3、IDO1、ALPL、ELANE、CYP3A4、CASP3、CYP1A1、BRAF、TLR9、F3 MAPK14、RET、NR3C1、ELANE、PTPN6、HMOX1、FABP5、EPHX1、PTGS2、STAT3 STAT3、VEGFA、CYP2D6、IL2 GSTM1、JUN、NOS2、ABCB1、IL1B、PDCD4、PTGS2 VEGFA NOS2、G6PD、TOP1、ATP12A、PTGER3、TNF、NR3C1、PTPN6、FABP5 PTGER3、TNF、NR3C1、PTPN6、FABP5、NOS2、G6PD、TOP1、ATP12A TYMP MMP9、EGFR、MAPK1、PARP1、TLR4、ALPL PTGS2 PTGS2、CASP3、JUN、TGFB1 ALPL、NOS2 ALPL YY19MAPK1、TNF、PTGS2、RET、BRAF、RXRA YY20TNF、PARP1、RET、ALPL、BRAF、F3、MMP8 YY21 YY22 YY23 YY24 YY25 YY26 YY27 YY28 YY29 YY30 YY31 YY32 YY33 YY34 YY35 YY36 YY37 YY38 YY39 YY40 guanosine rehmaglutin a rehmaglutin c rehmaglutin d rehmaionoside c rehmapicrogenin salidroside trans-p-hydroxy cinnamic acid methyl ester sugiol beta-sitosterol 2'-hydroxymethylophiopogonone a 5,7,2'-trihydroxy-6-methyl-3-(3',4'-methylene-dioxybenzyl)chromone 5,7-dihydroxy-6,8-dime thyl-3-(4'-hydroxy-3'-methoxybenzyl)chroman-4-one 5-hydroxy-7,8-dimethoxy-6-methyl-3-(3',4'-dihydroxybenzyl)chroman-4-one 6-aldehydo-isoophipogonone a 6-aldehydo-isoophipogonone b diosgenin isoophiopogonone a jasmololone methy-lophiopogonone b methyl beta-orcinol caroxylate methyl ophiopogonanone a methyl ophiopogonanone b n-(trans-p-coumaroyl)tyramine n-trans-feruloyltyramine n-[β-hydroxy-β-(4-hydroxyphenyl)]ethyl-4-hydroxy cinnamide ophiopogonanone b ophiopogonanone c ophiopogonanone e ophiopogonanone f ophiopogonone a ophiopogonone b ophiopogonone c orchinol YY41 YY42 YY43 stigmasterol-beta-d-glucoside paeoniflorin kaempferol YY44 YY45(+)-catechin quercetin ALPL、NOS2 ALPL、NOS2、ABCB1、CYP2C9 MAPK14、CYP3A4、IL2、CYP2C9 ALPL、NOS2 MMP9、MAPK14、EGFR、MAPK1、NR3C1、HMOX1、NOS2、IL6、MAP2K1 ALPL、NOS2、ABCB1 MMP9、MMP8 MMP8、MAPK1、PARP1、RET、BRAF、F3 PTGS2、BRAF、F3、RXRA、STAT6 MMP9、MMP8、MAPK14、EGFR、ELANE MMP8、EGFR、TNF、PTGS2、BRAF、TOP1、MAP2K1 MMP9、MMP8、EGFR、MAPK1、TYMP、ALPL、BRAF、VEGFA、TOP1、MAP2K1、HIF1A、TLR9 PTGS2、BRAF、JUN、ABCB1、RXRA PTGS2、ALPL、NOS2 MMP8、TNF、PARP1、BRAF MMP8、TNF、MAPK1、PARP1、BRAF ALPL ALPL、ABCB1、CYP2C9 ALPL、NOS2 MMP9、MAPK14、EGFR、PARP1、RET、STAT3、CYP3A4、BRAF、CYP2D6、IL2、CYP2C9、MAP2K1 STAT3、IL2 TNF、IL6、CD14、LBP TNF、PTGS2、CYP1A2、CYP3A4、CASP3、CYP1A1、HMOX1、GSTM1、JUN、NOS2、NOS3、ICAM1、SELE、GSTP1、SLPI PTGS2、RXRA PTGER3、MMP9、EGFR、MAPK1、TNF、PARP1、CYP1A2、CYP3A4、CASP3、CYP1A1、F3、HMOX1、VEGFA、IL2、GSTM1、JUN、NOS2、IL1B、TOP1、TGFB1、RXRA、IL6、HIF1A、NOS3、ICAM1、SELE、GSTP1、PLAU、IL10、TP53、ODC1、SOD1、MYC、CCL2、CXCL8、IFNG、PTEN、IL1A、CRP、CD40LG、PTGS2

續(xù)表1

續(xù)表1

2.1 養(yǎng)陰清肺湯活性成分抗MPP 靶點(diǎn)及其網(wǎng)狀圖 將TCMSP、Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫檢索得到的152 個活性成分對應(yīng)768 個活性成分靶基因與GeneCards 數(shù)據(jù)庫挖掘到的274 個肺炎支原體肺炎靶基因交集篩重，得到136個活性成分對應(yīng)的74個抗肺炎支原體肺炎的靶基因，見圖1。通過Cytoscape3.7.2軟件建立養(yǎng)陰清肺湯136 個活性成分對應(yīng)74 個靶標(biāo)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見表1、圖2。從方劑-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的總體特征分析發(fā)現(xiàn)，136 個活性成分中既存在一個化合物作用于多個蛋白靶點(diǎn)，同時也存在多個化合物與同一個蛋白靶點(diǎn)作用的現(xiàn)象，表明了養(yǎng)陰清肺湯治MPP的多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。連接靶標(biāo)最多的5 個化合物分別是槲皮素、阿魏酸甲酯、木犀草素、山奈酚、鳥苷；與化合物成分連接最多的前10個靶標(biāo)基因分別是PTGS2、NOS2、MAPK14、RXRA、TNF、EGFR、MAPK1、MMP9、PARP1、TOP1?；钚猿煞?抗肺炎支原體肺炎靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖共有211 個節(jié)點(diǎn)，682 條邊，每個活性成分均能作用于多個抗肺炎支原體肺炎靶點(diǎn)，體現(xiàn)了養(yǎng)陰清肺湯的多成分、多靶點(diǎn)作用。

2.2 養(yǎng)陰清肺湯活性成分抗MPP靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)分析 PPI網(wǎng)絡(luò)共74個節(jié)點(diǎn)，1 023條相互作用連線，平均degree27.65，平均betweenness為9.26×10-3，degree超過平均值的靶點(diǎn)共有35 個，主要包括IL6、TNF、PTGS2、IL10、IL1B、IL4、IL2、ICAM1、IFNG、CRP、NOS2、CD40LG、CXCL8、ELANE、STAT3、TLR4、CCL2、MAPK1、MAPK14、TGFB1、TLR9、FASLG、STAT6 免 疫 炎 癥 因 子 ，VEGFA、HMOX1、NOS3、NR3C1、CASP3 心 血 管 靶 點(diǎn) ，TP53、JUN、MYC、MMP9 癌基因及 EGFR、GAPDH 等，說明養(yǎng)陰清肺湯作用機(jī)制主要與其調(diào)節(jié)免疫炎癥、心血管生理、抑癌基因、細(xì)胞周期及凋亡等密切相關(guān)。結(jié)果見圖3、表2。

表2 關(guān)鍵靶點(diǎn)及其拓?fù)鋮?shù)

2.3 養(yǎng)陰清肺湯抗MPP靶點(diǎn)的GO功能富集 根據(jù)P＜0.001，共獲取442個GO條目，其中生物過程(biology process)占 408 個，分子功能(molecular function)占22個，細(xì)胞組成(cellular componet)占12個。其中生物過程涉及生物過程調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)過程、刺激反應(yīng)、代謝、細(xì)胞增殖、發(fā)育過程等；分子功能及細(xì)胞組成主要涉及催化活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活性、分子傳感器活性、抗氧化活性以及細(xì)胞器、細(xì)胞膜、突觸等。說明養(yǎng)陰清肺湯可能通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)以及調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、代謝等發(fā)揮抗MPP的作用，見圖4。

2.4 養(yǎng)陰清肺湯抗MPP 靶點(diǎn)的KEGG 通路 對篩選出的核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，共獲得 89 條富集通路，其中 P 值＜0.001 的前 30 條通路(圖5)與養(yǎng)陰清肺湯抗MPP 密切相關(guān)的有TNF 信號通路、T 細(xì)胞受體信號通路、PI3K-Akt 信號通路、Jak-STAT 信號通路、Toll 樣受體信號通路、MAPK 信號通路、NOD 樣受體信號通路等。結(jié)果表明，養(yǎng)陰清肺湯抗MPP 主要通過對免疫通路與炎癥通路的影響，進(jìn)而改善MPP 的臨床癥狀。

圖4 養(yǎng)陰清肺湯抗MPP靶點(diǎn)的GO功能富集

圖5 KEGG信號通路點(diǎn)狀圖

3 討論

養(yǎng)陰清肺湯出自清代著名醫(yī)家鄭梅澗所撰《重樓玉鑰》，由生地黃、麥冬、牡丹皮、白芍、薄荷、玄參、浙貝母、甘草八味藥組成。藥用生地甘苦而寒，既能滋腎水救肺燥，又能清熱涼血解疫毒，故重為君藥；麥冬養(yǎng)陰潤肺清熱，玄參清熱解毒散結(jié)，兩者共助生地養(yǎng)陰清熱解毒，為臣藥；白芍?jǐn)筷幒蜖I，丹皮涼血活血，貝母潤肺化痰，薄荷辛涼宣散，共為佐藥；生甘草清熱解毒，調(diào)和諸藥。多項(xiàng)研究表明，養(yǎng)陰清肺湯對MPP療效確切。李煒[5]研究發(fā)現(xiàn)以養(yǎng)陰清肺湯聯(lián)合孟魯司特鈉咀嚼片治療MPP致慢性咳嗽有助于緩解患兒的癥狀體征和減輕炎癥反應(yīng)。付慧玲[6]研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)陰清肺湯聯(lián)合阿奇霉素治療兒童肺炎支原體肺炎療效倍增。章紅[7]研究表明養(yǎng)陰清肺湯聯(lián)合阿奇霉素治療肺炎支原體肺炎可提高治愈率，縮短病程，減少副作用的發(fā)生，具有良好的治療作用。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，相對全面地探究了養(yǎng)陰清肺湯治MPP可能的分子機(jī)制。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，明確了養(yǎng)陰清肺湯136種成分74個MPP靶點(diǎn)，并根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩出35個關(guān)鍵靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)陰清肺湯的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要?dú)w屬于免疫炎癥、心血管生理、抑癌基因、細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白等。MP可刺激單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1、IL-2、IL-3，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12，IL-18 以及TNF-α等多種細(xì)胞因子，其中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等可能與MPP發(fā)病機(jī)制有關(guān)。GO生物過程主要包括生物過程調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)過程、刺激反應(yīng)、代謝、細(xì)胞增殖、發(fā)育過程等。MPP發(fā)病機(jī)制雖不明，但這與目前提出的免疫損傷、呼吸道上皮吸附作用、MP細(xì)胞毒素學(xué)說[8]機(jī)制相吻合，說明養(yǎng)陰清肺湯主要通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、代謝、細(xì)胞增殖等作用來治療MPP。

本研究通過KEGG富集分析表明與養(yǎng)陰清肺湯治療MPP相關(guān)通路主要涉及調(diào)節(jié)免疫功能、抑制炎癥等通路。免疫損傷是MPP重要的發(fā)病機(jī)制學(xué)說之一，MP的免疫損傷機(jī)制包括：體液免疫損傷、細(xì)胞免疫損傷、炎癥損傷、抗原免疫損傷和免疫抑制[9]。T細(xì)胞亞群相互協(xié)調(diào)作用的關(guān)鍵是維持T淋巴細(xì)胞亞群及Th1/Th2機(jī)體的免疫平衡，而肺支原體能直接刺激T、B淋巴細(xì)胞增殖，同時釋放TNF-α、IFN-γ、IL-1等細(xì)胞因子，引起Th1/Th2/Treg 免疫細(xì)胞亞群失衡，加重機(jī)體的免疫損傷[10]，養(yǎng)陰清肺湯可能作用于T細(xì)胞受體調(diào)節(jié)MPP患者免疫功能。腫瘤壞死因子(TNF)，又稱為TNF-α，它參與全身炎癥反應(yīng)，是組成急性期反應(yīng)的細(xì)胞因子之一。TNF-α主要由Th1分泌，能增強(qiáng)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等的免疫活性[11]。Toll樣受體(TLR)是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁，研究表明MPP患兒的TLR4水平較高[12]，且TLR2信號通路在肺組織對抗MP感染而產(chǎn)生的天然應(yīng)答中起關(guān)鍵作用[13]。NLRP3為NOD樣受體家族成員，研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體通路參與MPP發(fā)病過程，且與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。PI3K-Akt信號通路是具有酶活性的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)PI3K-Akt信號通路在肺部炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的負(fù)向調(diào)控作用[14]。p38是MAPK信號通路的關(guān)鍵因子，p38MAPK被激活后影響轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而調(diào)控炎癥反應(yīng)[15]，實(shí)驗(yàn)研究顯示MP感染后大鼠肺組織的p38MAPK蛋白表達(dá)升高[16]。JAK-STAT信號通路是介導(dǎo)炎癥介質(zhì)過度表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，實(shí)驗(yàn)表明肺部感染的發(fā)生機(jī)制與JAK2-STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化密切相關(guān)[17]。以上可知，養(yǎng)陰清肺湯調(diào)節(jié)MPP免疫反應(yīng)可能作用于T細(xì)胞受體、TNF、Toll樣受體、NOD樣受體等信號通路，此外養(yǎng)陰清肺湯還可能通過PI3K-Akt、MAPK 以及 JAK2-STAT3 等信號通路發(fā)揮抗炎的作用。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法獲取養(yǎng)陰清肺湯抗MPP的相關(guān)靶點(diǎn)以及通路，發(fā)現(xiàn)其可能主要通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)與炎癥系統(tǒng)來改善MPP 的臨床癥狀，但有待通過進(jìn)一步體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。