利用熒光定量PCR技術(shù)鑒別畜禽肉中豬源性成分

陸俊賢，唐修君，樊艷鳳，賈曉旭，葛慶聯(lián)，顧榮，王玨，高玉時

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，農(nóng)業(yè)部家禽品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，江蘇揚(yáng)州225125）

利用熒光定量PCR技術(shù)鑒別畜禽肉中豬源性成分

陸俊賢，唐修君，樊艷鳳，賈曉旭，葛慶聯(lián)，顧榮，王玨，高玉時*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，農(nóng)業(yè)部家禽品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，江蘇揚(yáng)州225125）

以豬特異性基因序列為靶位點設(shè)計特異性引物，以常見畜禽肉包括豬肉、羊肉、兔肉、牛肉、鴿肉、鵪鶉肉、雞肉、鴨肉、鵝肉等參考動物肌肉DNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，建立豬源性成分熒光定量PCR檢測方法；并將豬肉DNA模板濃度進(jìn)行8個梯度稀釋，檢測其靈敏度。結(jié)果顯示，該方法能夠有效對豬源性成分進(jìn)行快速檢測，具有較強(qiáng)的特異性，靈敏度較高，可快速準(zhǔn)確地鑒別畜禽肉中豬源性成分。

動物源性成分；熒光定量PCR；特異性基因；檢測

肉與肉制品摻雜摻假是目前我國食品質(zhì)量安全面臨的重要挑戰(zhàn)之一，不法商家為追逐經(jīng)濟(jì)利益對動物源性原料以次充好、以假亂真，嚴(yán)重危害消費者的健康和利益。然而，傳統(tǒng)的依靠感官與經(jīng)驗的肉類形態(tài)學(xué)鑒別手段已遠(yuǎn)不能滿足對肉制品摻假現(xiàn)象進(jìn)行控制與監(jiān)管的需要。因此，建立快速、準(zhǔn)確的檢測方法，對食品進(jìn)行動物源性成分鑒定、對加工肉制品質(zhì)量進(jìn)行把關(guān)，并有利于肉類產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

近年來，熒光定量PCR技術(shù)飛速發(fā)展為肉類成分檢測開辟了新的途徑，使得食品中肉類成分的定量分析與溯源成為可能[1-3]。在目標(biāo)基因選擇方面，目前應(yīng)用較多的是動物線粒體基因組DNA[4-6]。而有關(guān)動物特異性基因在畜禽肉動物源性成分鑒別方面的應(yīng)用鮮見相關(guān)報道。

動物特異性基因具有物種的特異性，有望成為肉類成分定性檢測的良好靶點[7]。本研究擬根據(jù)豬特異性基因的差異性位點，設(shè)計篩選特異性引物，建立基于動物特異性基因的熒光定量PCR技術(shù)的畜禽肉中豬源性成分快速鑒別方法。

1 材料與方法

1.1 材料

以市售合格的豬、羊、兔、牛、鴿、鵪鶉、雞、鴨以及鵝肉為試驗材料，各物種肉樣充分?jǐn)囁榛靹?，?0℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用試劑盒法離心柱式組織基因組DNA小量抽提試劑盒：北京天根生化科技有限公司；熒光染料預(yù)混液SYBR Green mix：AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 2500rxn：南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

提取的總DNA樣品溶于100 μL Tris－EDTA緩沖液中，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

經(jīng)測定DNA模板濃度分別為：豬157.67 ng/μL、羊206.52 ng/μL、兔178.7 ng/μL、牛141.46 ng/μL、鴿191.43 ng/μL、鵪鶉125.62 ng/μL、雞174.57 ng/μL、鴨198.24 ng/μL、鵝115.61 ng/μL。

1.2.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)豬特異性基因（ENSSSCT00000000833）序列，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計篩選特異性引物對，交于上海生工生物工程有限公司合成。取適量引物用高壓滅菌后的超純水溶解，配制成10 μmol/L的儲備液。引物序列、Tm值與擴(kuò)增片段大小具體見表1。

1.2.3 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

15 μL反應(yīng)體系：Master Mix（2×）：7.5 μL；Dye：0.3 μL；10 μmol/L上游引物和下游引物：各0.1 μL；DNA模板：1 μL；ddH2O：6 μL。

表1 引物序列、Tm值及PCR產(chǎn)物大小Table 1 Primer sequence，Tm value and the size of PCR product

反應(yīng)條件：50℃2 min，95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃1 min，40個循環(huán)。

1.2.4 特異性實驗

分別以豬肉、羊肉、兔肉、牛肉、鴿肉、鵪鶉肉、雞肉、鴨肉、鵝肉等動物肌肉DNA為模板，對所設(shè)計篩選的引物進(jìn)行特異性實驗。

Real－time PCR擴(kuò)增結(jié)束后，通過觀察各種動物模板DNA擴(kuò)增曲線及Ct值來判定其特異性。若無典型擴(kuò)增曲線且Ct值大于30，判定檢測體系無非特異性擴(kuò)增。反之則認(rèn)為檢測體系與其他物種具有交叉反應(yīng)。

1.2.5 靈敏度實驗

將豬肉DNA模板按梯度進(jìn)行稀釋，分別稀釋10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍，觀察該方法靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬特異性基因熒光定量PCR特異性檢測結(jié)果

以9種動物肌肉DNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增檢測，評價豬檢測體系的特異性，反應(yīng)按照已經(jīng)優(yōu)化的條件進(jìn)行，具體見圖1、表2。

圖1 豬引物擴(kuò)增曲線圖Fig.1 Amplification curve of pig primer

表2 不同動物DNA模板獲得的Ct值Table 2 The Ct value of different animal DNA template

結(jié)果顯示，所設(shè)計篩選的豬引物具有物種特異性。豬引物只有與豬DNA模板反應(yīng)才會有典型擴(kuò)增曲線，Ct值為22.78；其余反應(yīng)均無典型擴(kuò)增曲線，Ct值大于30或無，且無非特異性擴(kuò)增。

2.2 靈敏度檢測

將豬DNA模板按梯度稀釋，從DNA水平確認(rèn)方法的檢測下限，擴(kuò)增結(jié)果見圖2、表3。

可見，既有典型擴(kuò)增曲線，Ct值又小于30的，豬模板稀釋倍數(shù)達(dá)到102倍，即豬模板濃度為1.57ng/μL。

圖2 豬引物不同稀釋倍數(shù)擴(kuò)增曲線圖Fig.2 Different dilution ratio amplification curve of pig primer

表3 不同動物DNA模板不同稀釋倍數(shù)獲得的Ct值Table 3 The Ct value of different dilution ratio of different animals DNA templates

3 討論

熒光定量PCR技術(shù)是利用PCR反應(yīng)體系中熒光信號的變化對產(chǎn)物生成進(jìn)行實時監(jiān)測的技術(shù)，應(yīng)用最廣泛的主要包括利用雙熒光標(biāo)記探針的熒光基團(tuán)解離產(chǎn)生熒光強(qiáng)度變化的TaqMan法，以及利用染料分子插入雙鏈DNA產(chǎn)生熒光變化的SYBRGreen法，本試驗主要采用SYBRGreen法。熒光定量PCR技術(shù)在食品肉類成分鑒別方面的應(yīng)用，既提升了定性檢測的準(zhǔn)確性，又使得定量檢測成為可能[8-9]。Dooley等[10]基于線粒體細(xì)胞色素b基因，分別建立了牛肉、豬肉、羊肉、雞肉和火雞肉的實時熒光定量PCR檢測方法。王穎等[11]以豬線粒體12S rRNA基因序列為靶位點設(shè)計引物和探針，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，建立了豬源性成分檢測方法。

目前，國內(nèi)外利用核酸檢測為基礎(chǔ)的方法體系，對畜禽食品中肉類成分來源進(jìn)行鑒別與分析的技術(shù)已逐漸成熟，尤其是以線粒體編碼基因差異為基礎(chǔ)進(jìn)行的食品鑒定方法不斷出現(xiàn)[12-14]。Ghovvati等[15]基于線粒體12S rRNA和16S rRNA基因應(yīng)用多重PCR技術(shù)對反芻動物、家禽和豬進(jìn)行鑒別。何瑋玲等[16]基于動物線粒體細(xì)胞色素b基因的差異性位點，實現(xiàn)了4種肉類（豬肉、牛肉、羊肉和雞肉）的快速鑒別。陳冬等[17]基于牛線粒體12S rRNA基因，設(shè)計通用引物，成功鑒別混合鮮牛肉及制品中牛種來源。

動物特異性基因是各物種所特有，而基于該基因的畜禽肉中動物源性成分鑒別未見相關(guān)報道。本研究主要根據(jù)豬特異性基因序列的差異位點設(shè)計特異性引物，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增檢測，觀察擴(kuò)增曲線，對包括豬、羊、兔、牛、鴿、鵪鶉、雞、鴨、鵝等9種動物在內(nèi)的畜禽肉進(jìn)行動物源性鑒別，經(jīng)過多次重復(fù)試驗證明，所選定的引物對只有在豬模板DNA存在的情況下才會發(fā)生熒光PCR擴(kuò)增，建立了快速、準(zhǔn)確的畜禽肉中豬源性成分熒光PCR鑒別方法。研究結(jié)果為打擊市場肉制品摻假，保障人民生命安全，維護(hù)市場秩序提供了技術(shù)支撐。

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The Identification of Pig Origin Ingredients in Livestock and Poultry Meat Based on Fluorogenic Quantitative PCR

LU Jun-xian，TANG Xiu-jun，F(xiàn)AN Yan-feng，JIA Xiao-xu，GE Qing-lian，GU Rong，WANG Jue，GAO Yu-shi*
（Institute of Poultry，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Quality Inspection Center for Poultry Products，Ministry of Agriculture，Yangzhou 225125，Jiangsu，China）

In order to establish a fluorogenic quantitative PCR method，which could identify the components of pig origin，specific genes sequences of pig was used as target sites，and the specific primers were designed.The DNA of common livestock and poultry meat including mutton，pork，rabbit meat，beef，pigeon meat，quail meat，chicken，duck and goose were used as template.And the template was diluted in eight gradients，for detecting the sensitivity.The results showed that the established method could detect the pig origin effectively，which had a quite specificity and high sensitivity.The method could detect the pig origin in livestock and poultry meat quickly and accurately.

animal origin ingredients；fluorogenic quantitative PCR；specific genes；identification

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.026

2016-08-24

揚(yáng)州市社會發(fā)展前瞻性研究項目（YZ2014188）；揚(yáng)州市科技公共服務(wù)平臺建設(shè)（YZ2015162）；2016國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估項目（GJFP2016007）

陸俊賢（1972—），男（漢），副研究員，碩士，研究方向：家禽品種鑒定與品質(zhì)評價。

*通信作者：高玉時（1967—），研究員。