蜂花粉多糖和黃酮的聯(lián)合提取及含量測(cè)定

張翠香，羅永會(huì)，徐春萍，左紹遠(yuǎn)

（大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000）

蜂花粉多糖和黃酮的聯(lián)合提取及含量測(cè)定

張翠香，羅永會(huì)*，徐春萍，左紹遠(yuǎn)

（大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000）

以蜂花粉為原料，用石油醚回流脫去脂類和色素，再用80%乙醇80℃回流2次提取蜂花粉黃酮；濾渣用80℃水提3次后，醇沉后，并用sevag法脫蛋白。計(jì)算多糖和黃酮的提取率和純度，并對(duì)試驗(yàn)方法的重復(fù)性、精密度和穩(wěn)定性進(jìn)行考查。蜂花粉中黃酮的提取率為2.56%（RSD=1.722%，n=5），純度為82.3%（RSD=2.517%，n=5），多糖提取率為3.11%（RSD=2.826%，n=5），純度為91.6%（RSD=1.992%，n=5）；精密度試驗(yàn)RSD黃酮=1.760%，RSD多糖= 1.507%，穩(wěn)定性試驗(yàn)中顯色后的90 min內(nèi)穩(wěn)定性較好，RSD黃酮=2.947%，RSD多糖=2.632%。

蜂花粉；多糖；黃酮；聯(lián)合提取

蜂花粉（beepollen）為蜜蜂采集的雄蕊花藥的粉狀物質(zhì)，除含有豐富的營養(yǎng)成分外，蜂花粉還含有多糖類、活性肽、黃酮類、核苷類、甾體、醛類、苷類、不飽和脂肪酸及少量生物堿等多種生物活性物質(zhì)。被稱為“完全營養(yǎng)食品”。對(duì)人體具有多種保健功能，不僅能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，而且還可防止動(dòng)脈硬化、高血脂、高血壓、靜脈曲張等，是治療各種疾病的名貴藥材[1-3]。

多糖和黃酮都是蜂花粉的主要活性成分。研究表明蜂花粉多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)血糖、降血脂及抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種生物學(xué)活性[4-7]，同時(shí)，蜂花粉黃酮能夠抗氧化和降糖、降脂等生物活性也有所報(bào)道[7-10]。目前，蜂花粉中多糖和黃酮類化合物的研究主要集中在提取純化、含量測(cè)定及成分、生物活性等方面。也有很多關(guān)于蜂花粉中多糖和黃酮類物質(zhì)的提取研究的文獻(xiàn)。大多數(shù)研究都只集中在單一的蜂花粉多糖或黃酮類的提取工藝條件研究上[7-8]，其優(yōu)點(diǎn)是確定了多糖或黃酮類物質(zhì)的最佳提取工藝，能充分提取蜂花粉中的多糖或黃酮類物質(zhì)，獲取蜂花中更多的生物活性成分；缺點(diǎn)是單一提取，不能同時(shí)獲得其中生物活性成分，造成原料和試劑的浪費(fèi)，耗費(fèi)時(shí)間和能源，造成提取成本的增加等。本研究查閱大量相關(guān)文獻(xiàn)，參照蜂花粉多糖、黃酮單一提取的最佳工藝，采用聯(lián)合提取蜂花粉中的黃酮和多糖方法，能從蜂花粉中同時(shí)獲得蜂花粉重要生物活性物質(zhì)多糖和黃酮。方法簡(jiǎn)單易行，可為蜂花粉的進(jìn)一步開發(fā)和研究提供參考，節(jié)約時(shí)間和成本。

1 材料和儀器

1.1 試劑

蘆丁、石油醚（沸程60℃～90℃）、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、濃硫酸、葡萄糖、苯酚等：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.2 主要儀器

BT-224S型電子分析天平：德國賽多利斯儀器公司；HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；TDL－4A低速離心機(jī)：上海菲恰爾儀器有限公司；722E分光光度計(jì)：上海分析儀器有限公司；RA－6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DEF-200中藥粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司等。

2 方法[11-15]

2.1 蜂花粉多糖和黃酮的提取工藝

2.2 蜂花粉總黃酮的提取

稱取1 200 g蜂花粉，用10倍體積的石油醚（沸程30℃～60℃）水浴回流3.0 h，過濾2次，脫去蜂花粉中的脂類，以及色素，濾渣晾干備用。用10倍體積80%乙醇80℃回流2.0 h，過濾，重復(fù)2次，合并濾液，減壓濃縮回收乙醇，得蜂花粉黃酮浸膏。濾渣晾干即脫脂蜂花粉備用。

2.3 蜂花粉多糖的提取和純化

取2.2所得脫脂蜂花粉，用8倍體積蒸餾水，80℃振蕩水提過夜，過濾，濾液收集置4℃冰箱，濾渣用6倍體積蒸餾水80℃振蕩水提2次，每次6.0 h，過濾收集濾液。合并濾液減壓濃縮到適當(dāng)體積，加無水乙醇使終度達(dá)90%，置4℃冰箱過夜，離心收集粗多糖沉淀。沉定用蒸餾水溶解得粗多糖溶液，按多糖溶液和sevag脫蛋白液（氯仿∶正丁醇=4∶1）4∶1體積比混合劇烈攪拌30min離心，收集上清液，重復(fù)3次，上清液加無水乙醇使終濃度達(dá)90%，置4℃冰箱過夜，離心收集沉淀。沉淀分別用無水乙醇，丙酮，乙醚洗滌3次，真空干燥，得灰白色粉狀多糖。

2.4 蜂花粉黃酮的含量測(cè)定

2.4.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取120℃干燥恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品100.0 mg，用50%乙醇定容至100 mL，則蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為1.0 mg/mL，準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，置于10 mL刻度試管中，分別加50%乙醇至2.0 mL混勻，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL混勻，放置6 min，加10%的硝酸鋁溶液0.3 mL混勻，放置6 min后加5%的氫氧化鈉溶液2.0 mL，混勻，放置15 min加50%乙醇至10.0 mL混勻，以第1管為空白對(duì)照，于510 nm處測(cè)定吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.2 蜂花粉黃酮的含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取2.2所得蜂花粉黃酮浸膏100.0 mg，用50%乙醇定容至100 mL，取2.0 mL，按照2.4.1方法操作，于510 nm處讀取吸光度，代入線性回歸方程，求出樣品液中總黃酮濃度，計(jì)算蜂花粉黃酮樣品中總黃酮的含量（即總黃酮的純度）及總黃酮的提取率：

蜂花粉黃酮樣品中總黃酮的含量/%=C×V×N×10-6/ M×100

式中：C為樣品總黃酮濃度，μg/mL；V為待測(cè)樣品總體積，mL；M為所稱取蜂花粉黃酮的質(zhì)量，g；N為稀釋倍數(shù)，10-6，單位換算（1 g=106μg）。

總黃酮提取率/%=提取所得蜂花粉總黃酮的質(zhì)量/蜂花粉原料質(zhì)量×100

2.5 蜂花粉多糖的含量測(cè)定

2.5.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖100.0 mg，用蒸餾水定容至100 mL，再取該溶液10.0 mL用蒸餾水定容至100 mL，即得100 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取 0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，各以蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，然后加入5%苯酚水溶液1 mL，充分混合后再沿著試管壁緩慢滴入濃硫酸5 mL，迅速混合均勻后，室溫放置30 min，在波長490 nm處測(cè)定吸光度（A）。以葡萄糖濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5.2 蜂花粉多糖含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取2.3所得蜂花粉多糖100.0 mg，用蒸餾水定容至100 mL，取2.0 mL，按照2.5.1方法操作，于490 nm處讀取吸光度，代入線性回歸方程，求出樣品液中多糖濃度，計(jì)算蜂花粉中多糖樣品中多糖的含量（即多糖的純度）及多糖的提取率：

蜂花粉中多糖樣品中多糖含量/%=C×V×N×10-6/ M×100

式中：C為樣品多糖濃度，μg/mL；V為待測(cè)樣品總體積，mL；M為所稱取蜂花粉多糖質(zhì)量，g；N為稀釋倍數(shù)，10-6，單位換算（1 g=106μg）。

蜂花粉多糖提取率/%=提取所得蜂花粉多糖質(zhì)量/蜂花粉原料質(zhì)量×100

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取蜂花粉100.00 g，共5份，按2.2、2.3法提取蜂花粉中的黃酮和多糖，按2.4、2.5法測(cè)定蜂花粉中的多糖含量和黃酮含量，分別計(jì)算RSD。

2.6.2 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取100.00 mg蜂花粉黃酮浸膏（或多糖），用50%乙醇（多糖用蒸餾水）定容到100 mL，分別按2.4.1、2.5.1法操作，各平行做5份，讀取吸光，分別計(jì)算RSD。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別準(zhǔn)確吸取2.6.2所得待測(cè)液2.0 mL，按2.4.1、2.5.1法操作，分別放置于室溫0、15、30、60、90 min之后，讀取吸光度，分別計(jì)算RSD。

3 結(jié)果和分析

3.1 蜂花粉黃酮和多糖測(cè)定結(jié)果

3.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，求得回歸方程及標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1，蘆丁濃度在20 μg/mL～120 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)線（510 nm）Fig.1 Standard curves of rutin（510 nm）

3.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲

以葡萄糖濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，求得回歸方程及標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2，葡萄糖濃度在0～60 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（490 nm）Fig.2 Standard curve of glucose（490 nm）

3.1.3 蜂花粉多糖和黃酮的提取率及含量

蜂花粉1 200.00 g用石油醚脫脂2次后，用80%乙醇對(duì)其中黃酮進(jìn)行提取2次，沉渣再進(jìn)一步用水提醇法提取其中的多糖，然后用sevag法脫蛋白進(jìn)行純化蜂花粉多糖。試驗(yàn)得蜂花粉多糖37.32 g，黃酮浸膏30.72g。多糖提取率為（37.32 g÷1 200 g）×100%=3.11%，多糖樣品中多糖的含量（即純度）為91.6%，黃酮提取率為（30.72g÷1200g）×100%=2.56%，浸膏中黃酮的含量（即純度）為82.3%。蜂花粉中多糖含量為91.6%× 3.11%×100%=2.85%，黃酮的含量為82.3%×2.56%× 100%=2.11%。

3.2 方法學(xué)考察結(jié)果

3.2.1 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取蜂花粉100.00，共5份，嚴(yán)格按2.2、2.3法提取蜂花粉中的黃酮和多糖，按2.4、2.5法測(cè)定蜂花粉中的多糖含量和黃酮含量，并計(jì)算多糖提取率、多糖純度、黃酮提取率及黃酮純度的RSD，結(jié)果分別為2.826%、1.992%、1.772%和2.517%。表明本試驗(yàn)方法有較好的重復(fù)性，偶然誤差較小，測(cè)定方法可靠。結(jié)果見表1。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 1 Results in repeated test（n=5）

3.2.2精密度試驗(yàn)

結(jié)果表明，5份黃酮待測(cè)樣品，吸光度平均值A(chǔ)黃酮=0.428，RSD=1.760%，5份多糖待測(cè)樣品，平均值A(chǔ)多糖=0.469，RSD=1.507%，表明儀器精密度良好。結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 2 Results in Precision test（n=5）

3.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

結(jié)果表明，在90 min內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次，吸光度平均值A(chǔ)黃酮=0.428，RSD=2.947%，平均值A(chǔ)多糖= 0.469，RSD=2.632%，表明其在顯色后的90 min內(nèi)穩(wěn)定性較好。結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 3 Results in stability test（n=5）

3.3 結(jié)論

通過上述聯(lián)合提取的方法，用80%乙醇對(duì)蜂花粉黃酮進(jìn)行提取2次，再進(jìn)一步用水提醇法提取其中的多糖，然后用sevag法脫蛋白進(jìn)行純化蜂花粉多糖。此方法能同時(shí)獲取蜂花粉中的多糖和總黃酮。所得蜂花粉中黃酮的提取率為2.56%（RSD=1.722%，n=5），純度為82.3%（RSD=2.517%，n=5），多糖提取率為3.11%（RSD=2.826%，n=5），純度為91.6%（RSD=1.992%，n= 5）；精密度試驗(yàn)RSD黃酮=1.760%，RSD多糖=1.507%，穩(wěn)定性試驗(yàn)中顯色后的90 min內(nèi)穩(wěn)定性較好，RSD黃酮=2.947%，RSD多糖=2.632%。表明本試驗(yàn)方法具有較好的穩(wěn)定性、重復(fù)性及準(zhǔn)確度。因些，蜂花粉多糖和黃酮的聯(lián)合提取是可行的，方法簡(jiǎn)單易行，既能節(jié)約時(shí)間又節(jié)約成本，同時(shí)還有較好的提取率。

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Extraction and Content Determination of Bee Pollen Polysaccharide and Flavonoids

ZHANG Cui-xiang，LUO Yong-hui*，XU Chun-ping，ZUO Shao-yuan
（School of Basic Medical Sciences，Dali University，Dali 671000，Yunnan，China）

This experiment by bee pollen as raw material，using petroleum ether reflux lipid and pigment，with two 80℃80%ethanol reflux extraction bee flowers pink yellow ketone；with 80℃water residue after three times，after alcohol sink，by sevag method to take off the protein.Calculation of polysaccharides and flavones extraction yield and purity，and the experimental method of repeatability，precision and stability test.Bee pollen medium yellow ketone extraction yield of 2.56%（RSD=1.722%，n=5），the purity of 82.3%（RSD= 2.517%，n=5），the polysaccharide extraction rate was 3.11%（RSD=2.826%，n=5），the purity of 91.6%（RSD=1.992%，n=5）；Precision test RSD=1.760%of flavonoids，polysaccharide RSD=1.507%，stability test of color within 90 min after stability isbetter，flavonoidsRSD=2.947%，polysaccharide RSD=2.632%.

bee pollen；polysaccharide；flavonoids；combined extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.013

2016-09-06

張翠香（1979—），女（彝），實(shí)驗(yàn)師，本科，從事行政管理和植物多糖研究。

*通信作者：羅永會(huì)（1967—），女（白），高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，從事生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)和植物成份提取的研究。