• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    響應(yīng)面法優(yōu)化厚殼貽貝多糖提取工藝及抗腫瘤活性研究

    2017-05-18 03:10:04馬銘研吳惠芳章璐幸陳維
    食品研究與開發(fā) 2017年10期
    關(guān)鍵詞:貽貝液料胸腺

    馬銘研,吳惠芳,章璐幸,陳維

    (浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校,浙江寧波315000)

    響應(yīng)面法優(yōu)化厚殼貽貝多糖提取工藝及抗腫瘤活性研究

    馬銘研,吳惠芳,章璐幸*,陳維

    (浙江醫(yī)藥高等??茖W(xué)校,浙江寧波315000)

    以厚殼貽貝多糖提取率為響應(yīng)值,在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以液料比、酶解溫度、酶解時間和pH值為試驗因素,采用響應(yīng)面法建立數(shù)學(xué)模型,篩選最佳提取工藝條件;建立小鼠S180實體瘤模型,分為模型對照組、厚殼貽貝多糖實驗低、中、高劑量組、環(huán)磷酰胺對照組。測定小鼠腫瘤生長抑制率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。通過二次回歸模型響應(yīng)面分析,確定厚殼貽貝多糖的最佳提取工藝條件為液料比9.8 mL/g、酶解溫度46℃、酶解時間133 min和pH5.9,在此條件下厚殼貽貝多糖提取率為19.2%,與模擬方程得出的18.9%無顯著性差異;并且中、高劑量厚殼貽貝多糖對小鼠的腫瘤抑制率分別為36.8%和51.9%。得到酶解法提取厚殼貽貝多糖的最佳提取工藝并證實其免疫增強作用。

    厚殼貽貝多糖;響應(yīng)面;抗腫瘤;酶解法

    厚殼貽貝,俗稱“淡菜”,在浙江沿海廣泛分布,養(yǎng)殖技術(shù)成熟。我國古代對貽貝的藥用價值就有研究,《本草匯言》載:淡菜,補虛養(yǎng)腎之藥也[1]。而在現(xiàn)代研究中,也證實了貽貝提取物含有多種維生素和碘、鐵、鈣等物質(zhì),其中的有維生素B族和多種微量元素具有醫(yī)治口角炎、舌炎、眼疾和貧血,改善人體血液循環(huán)的功能。貽貝還可作為防治動脈粥樣硬化和高血壓的保健食品[2]。目前,關(guān)于厚殼貽貝多糖(Mytilus coruscus polysaccharides,MCP)提取的研究不多,而且沒有關(guān)于酶解法提取工藝優(yōu)化的相關(guān)研究。通過此試驗使用響應(yīng)面法優(yōu)化厚殼貽貝多糖提取工藝,并進(jìn)一步探究厚殼貽貝多糖是否有抑制腫瘤的作用,為厚殼貽貝合理開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與儀器

    1.1 動物及瘤株

    ICR小白鼠,雄性和雌性各25只,清潔級,體質(zhì)量18 g~22 g:由杭州醫(yī)學(xué)研究中心提供;S-180肉瘤細(xì)胞,參考文獻(xiàn)[3]方法培養(yǎng)。

    1.2 試劑與儀器

    正丁醇、乙醇、氯仿、氫氧化鈉(均為分析純)、胰蛋白酶(1 000 U):寧波奧博有限公司。

    可見分光光度計(722S):上海精密科學(xué)儀器有限公司;恒溫水浴鍋(HH-1,HH-2):上海精密科學(xué)儀器有限公司;電子天平(BS124S):北京北分天普儀器技術(shù)有限公司;離心機(LXJ-IIB):上海金鵬分析儀器有限公司。

    2 方法

    2.1 厚殼貽貝多糖的提取

    稱取100 g厚殼貽貝勻漿,經(jīng)酶法浸提、脫脂、去蛋白、離心、加乙醇得到厚殼貽貝多糖粗品,冷凍凍干得到厚殼貽貝多糖。

    2.2 多糖含量的測定

    多糖測定采用苯酚-硫酸法[4]。以葡萄糖(mg/mL)作為標(biāo)準(zhǔn)品制定標(biāo)準(zhǔn)曲線測定提取液中厚殼貽貝多糖的含量,待測樣品用純化水稀釋后,使得吸光度值在0.2~0.8的有效范圍內(nèi)。厚殼貽貝多糖提取率計算如下:Y/%=[(A×B)/1 000C]×100,式中:Y為多糖提取率,%;A為由回歸方程求得的多糖濃度,(mg/mL);B為多糖液體積,mL;C為厚殼貽貝質(zhì)量,g。

    2.3 多糖提取單因素試驗

    分別考察pH值(4.0、5.0、6.0、7.0)、液料比[5、10、15、20(mL/g)]、酶解溫度(30、40、50、60℃)和酶解時間(60、120、150、240 min)對厚殼貽貝多糖提取率的影響。

    2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

    依據(jù)單因素試驗得到的結(jié)果,選擇液料比、酶解溫度、酶解時間、pH值為變量,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計,進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗,利用Design Expert軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,因素水平設(shè)計見表1。

    表1 響應(yīng)面因素設(shè)計和水平Table 1 Independent variables and their levels used in the response surface design

    2.5 腫瘤模型的建立

    按移植性腫瘤研究法建立小鼠模型[5]。在無菌條件下,于生長狀況、體重相同的健康小鼠左后肢皮下接種S180腫瘤細(xì)胞液,每只0.2 mL,共50只,雌雄各半,建立荷瘤小鼠模型。

    2.6 分組及給藥

    接種24 h后,隨機分成模型組、環(huán)磷酰胺組(25 mL/kg)、厚殼貽貝多糖低、中、高劑量組(50、100、200 mL/kg),共5組:每組隨機挑選雌、雄小鼠各5只,對每只小鼠分別進(jìn)行稱重,做好標(biāo)記,并做好記錄,每日灌胃給藥,連續(xù)給藥一周。

    2.7 體內(nèi)抗腫瘤作用研究

    末次給藥24 h后稱其體質(zhì)量,計算體質(zhì)量增加值;頸椎脫臼處死小白鼠,摘取瘤塊、脾臟及胸腺并稱重,計算抑瘤率、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。公式如下:

    抑瘤率/%=(模型組瘤重-給藥組瘤重)/模型組瘤重×100;

    脾臟指數(shù)=小鼠脾重(mg)/小鼠的體質(zhì)量(g);

    胸腺指數(shù)=小鼠的胸腺重(mg)/小鼠的體質(zhì)量(g);

    3 結(jié)果

    3.1 單因素試驗

    各因素對多糖提取率的影響見圖1。

    圖1 各因素對多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction parameters on yield of MCP

    如圖1a所示,當(dāng)提取pH值達(dá)到6以上時,多糖提取率達(dá)到最大,隨著pH值的進(jìn)一步增加,多糖提取率呈下降趨勢,分析原因可能胰蛋白酶在弱酸性環(huán)境下分解蛋白的能力變?nèi)?,所以選擇pH4~6范圍提取厚殼貽貝多糖適宜;如圖1b所示,當(dāng)提取溫度上升到50℃時,多糖提取率最大,隨著溫度的升高,多糖提取率沒有增加,故選擇30℃~50℃為宜;如圖1c所示,當(dāng)酶解時間大于150 min后,多糖提取率有所下降,可能酶解時間過長,酶的活力下降,故選擇60 min~150 min為宜;如圖1d所示,多糖提取率隨著液料比的增加呈先增大后減小的趨勢,當(dāng)液料比為10時,多糖提取率達(dá)到最大,然后呈下降趨勢,考慮后續(xù)工藝處理及生產(chǎn)成本,故選5(mL/g)~20(mL/g)為宜。

    3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

    利用Design Expert軟件設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗,并對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,試驗方案見表2。

    表2 厚殼貽貝多糖提取率的響應(yīng)面試驗方案和結(jié)果Table 2 Box behnken design and the response values for extraction yield of MCP

    續(xù)表2 厚殼貽貝多糖提取率的響應(yīng)面試驗方案和結(jié)果Continue table 2 Box behnken design and the response values for extraction yield of MCP

    表2中各試驗條件對應(yīng)的真實值和預(yù)測值基本接近,使用Design Expert 8.0.6對表2試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析結(jié)果見表3。

    表3 方差分析的擬合二次多項式模型Table 3 The fitted quadratic polynomial model of ANOVA

    二次回歸方程的擬合得到自變量(X1、X2、X3和X4)與多糖提取率(Y)的二次多元回歸方程:

    由表3可知,模型的P<0.05,說明模型極顯著,X1、X2、和為顯著影響因素,說明對厚殼貽貝多糖提取影響較大,該回歸模型的總決定系數(shù)和調(diào)節(jié)決定系數(shù)均說明該方程擬合程度好,試驗誤差小,故該方程模型成立可用于酶解提取多糖的分析和預(yù)測。圖2為響應(yīng)值對應(yīng)各試驗因素所形成的響應(yīng)面剖面圖。

    圖2 各兩因素交互影響多糖提取率的響應(yīng)面剖面圖Fig.2 Contour plots showing the interaction between two test variables

    由圖2可看出各參數(shù)之間的相互作用,圖中曲線越接近橢圓則反映兩因素交互作用越強,曲線越陡峭,表明該因素對多糖提取效率的影響越大[6]。由回歸方程經(jīng)處理得到最佳提取條件為:液料比9.8(mL/g)、酶解溫度46℃、酶解時間133 min和pH5.9,在此條件下厚殼貽貝多糖提取率為19.2%,與模擬方程得出的18.9%,吻合良好。

    3.3 厚殼貽貝多糖對小鼠S180實體瘤生長的抑制作用

    厚殼貽貝多糖對小鼠S180實體瘤生長的抑制作用結(jié)果如表4。

    表4 厚殼貽貝多糖、CTX對小鼠體重、荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響Table 4 Effect of treatment with CTX or MCP in mice bearing S180 tumor on body weight,spleen index and thymus index

    厚殼貽貝多糖在低、中、高劑量時對S180肉瘤的抑制率分別為13.7%、36.8%、51.9%,其中中、高劑量時具有顯著性意義,P<0.05和P<0.01。值得關(guān)注的是,環(huán)磷酰胺在抑制腫瘤的同時,對小鼠的抑制明顯,體質(zhì)量顯著減少,P<0.01;而從小鼠體質(zhì)量變化結(jié)果得知,厚殼貽貝多糖實驗組小鼠體質(zhì)量均增加,并且高劑量組與模型組相比較有顯著差異。

    3.4 厚殼貽貝多糖和環(huán)磷酰胺分別對荷瘤小鼠免疫器官的影響

    如表4環(huán)磷酰胺可降低荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù),具有明顯的免疫抑制不良反應(yīng)。低劑量的厚殼貽貝多糖對小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)沒有明顯的影響,而中、高劑量的厚殼貽貝多糖可以顯著提高荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù),P<0.05和P<0.01,顯示出較強的體內(nèi)免疫促進(jìn)作用。說明厚殼貽貝多糖可以改善環(huán)磷酰胺對小鼠的免疫損傷。

    4 結(jié)論

    目前,厚殼貽貝多糖的提取主要以熱水堿提為主[7],多糖提取率較低,溫度過高也影響了多糖的活性,鐘城城等[8]使用聯(lián)合酶提取粗多糖具有較高的多糖提取率,證明酶解法提取多糖優(yōu)于傳統(tǒng)方法。本研究通過單因素和響應(yīng)面分析得到酶解提取厚殼貽貝多糖的最佳工藝,液料比9.8(mL/g)、酶解溫度46℃、酶解時間133 min和pH5.9,并進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤作用研究,中、高劑量厚殼貽貝多糖對小鼠的腫瘤抑制率分別達(dá)到36.8%和51.9%,之前的報道主要闡述厚殼貽貝多糖在體外對腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[9-12],本研究結(jié)果顯示,厚殼貽貝多糖在體內(nèi)也具有一定的抗腫瘤作用,為進(jìn)一步合理開發(fā)利用厚殼貽貝提供理論依據(jù)。

    [1]陳仁壽.淺議《本草匯言》的學(xué)術(shù)成就與不足[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(社會科學(xué)版),2003,4(3):169-171

    [2] 宋廣磊.貽貝的加工利用與開發(fā)[J].漁業(yè)現(xiàn)代化,2003,10(2):30-31

    [3]侯洪寶,高世勇,季宇彬,等.螺旋藻多糖對S180荷瘤小鼠腫瘤生長及紅細(xì)胞免疫功能的影響[J].中草藥,2009,23(4):14-18

    [4] 李粉玲,蔡漢權(quán),嚴(yán)贊開,等.酶法提取蘆根多糖的研究[J].食品工業(yè)科技,2009,30(4):155-159

    [5]徐淑云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學(xué)[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:1758-1762

    [6] Liu Y K,Yan E,Zhang Z Z,et al.Response surface optimization of microwave assisted extraction for HPLC fluorescence determination of puerarin and daidzein in Radix Pueraiae thomsonii[J].J Pharm Anal,2001,1(1):13-19

    [7]姚瀅.東海厚殼貽貝多糖的分離提純和免疫學(xué)活性研究[D].上海:第二軍醫(yī)大學(xué),2005:8-10

    [8]鐘城城,曲有樂,陳蔭,等.厚殼貽貝多糖的提取工藝優(yōu)化及體外生物活性研究[J].食品科學(xué),2014,35(10):107-114

    [9]徐紅麗,郭婷婷,郭一峰,等.貽貝水溶性多糖MP-I的分離純化及體外抗腫瘤活性研究[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2006,27(9):998-1001

    [10]杜挺挺,陳蔭,鐘城城,等.貽貝多糖的結(jié)構(gòu)修飾及其體外抗腫瘤活性測定.浙江海洋學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2014(4):354-357

    [11]易楊華,馬明華,李玲,等.具有增強免疫和抗腫瘤活性的厚殼貽貝多糖MF4:CN200410024958.0[P].2005-02-23

    [12]張建鵬,盧小鈴,劉小宇,等.貽貝多糖MP-I的抗腫瘤活性及其機制[J].上海醫(yī)學(xué),2015,38(1):893-897

    Optimization of Extraction of Mytilus coruscus Polysaccharide by Response Surface Method and Investigation on Antitumor Activity

    MA Ming-yan,WU Hui-fang,ZHANG Lu-xing*,CHEN Wei
    (Zhejiang Pharmaceutical College,Ningbo 315000,Zhejiang,China)

    Employing a three-level and four-variable Box-Behnken design and setting the Mytilus coruscus polysacchrides(MCP)extraction yield(%)as response value,the optimum enzymatic extraction conditions were as follows:extraction time was 133 min,extraction temperature was 46℃,extraction pH was 5.9,and ratio of liquid to fresh flesh was 9.8 mL/g.Under the optimized conditions,the predict extraction yield indicated from the RSM model was 18.9%,which showed compliance to the experimental yield(19.2%).The antitumor activity was investigated in mice.The tumor growth inhibitory rate,spleen index and thymus index were calculated.The tumor inhibition rates of medium and high dose MCP were 36.8%and 51.9%,respectively,which were significantly different with model group.Spleen index and thymus index significantly increased in medium and high dose MCP group.It was obviously that MCP could improve the immunity and inhibit the growth of tumor.

    Mytilus coruscus polysacchrides;response surface method;antitumor;enzyme extraction

    10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.007

    2016-11-21

    國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(21502172);浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校校級課題(201509)

    馬銘研(1980—),女(漢),講師,碩士,研究方向:天然產(chǎn)物開發(fā)。

    *通信作者:章璐幸(1985—),女(漢),實驗師,碩士,研究方向:藥物質(zhì)量與控制。

    猜你喜歡
    貽貝液料胸腺
    “貽貝之鄉(xiāng)”耕海忙
    兒童巨大胸腺增生誤診畸胎瘤1例
    貽貝、海虹、青口、淡菜……到底有何區(qū)別
    胸腺鱗癌一例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    新型多功能飲品復(fù)合調(diào)配分離瓶的研發(fā)
    科技視界(2018年22期)2018-10-08 01:41:38
    胸腔鏡胸腺切除術(shù)后不留置引流管的安全性分析
    全球貽貝產(chǎn)量減少導(dǎo)致貿(mào)易受挫
    基于Ⅲumina平臺的厚殼貽貝外套膜轉(zhuǎn)錄組從頭測序
    甲狀腺顯示胸腺樣分化的癌1例報道及文獻(xiàn)回顧
    混砂機液料流量的精確控制
    久热这里只有精品99| 久久久久久人妻| 老司机影院成人| 国产成人免费无遮挡视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 中国三级夫妇交换| 精品国产乱码久久久久久小说| 成人毛片60女人毛片免费| 免费观看在线日韩| 亚洲,欧美,日韩| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲国产av新网站| 国产精品福利在线免费观看| 一区二区三区精品91| 国产爱豆传媒在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 久热这里只有精品99| 欧美日韩亚洲高清精品| 性色avwww在线观看| av福利片在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 能在线免费看毛片的网站| 色视频在线一区二区三区| av在线观看视频网站免费| 91aial.com中文字幕在线观看| 精品人妻视频免费看| 久久99蜜桃精品久久| 欧美日韩综合久久久久久| 人妻 亚洲 视频| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲欧美精品专区久久| 亚洲性久久影院| 亚洲人与动物交配视频| av不卡在线播放| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 精品久久久久久久久亚洲| 欧美激情国产日韩精品一区| 在线观看一区二区三区激情| 国产伦精品一区二区三区视频9| 又爽又黄a免费视频| 高清欧美精品videossex| 夫妻午夜视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲欧美日韩东京热| av专区在线播放| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 午夜激情福利司机影院| 久久久久久久国产电影| av专区在线播放| 色综合色国产| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲av男天堂| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 99热6这里只有精品| 99久久人妻综合| 亚洲美女搞黄在线观看| 伊人久久国产一区二区| 丝袜脚勾引网站| 午夜免费鲁丝| 一级a做视频免费观看| 成人亚洲精品一区在线观看 | av国产免费在线观看| 永久网站在线| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久热这里只有精品99| 晚上一个人看的免费电影| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 夫妻午夜视频| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲一区二区三区欧美精品| 欧美最新免费一区二区三区| av视频免费观看在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 妹子高潮喷水视频| 简卡轻食公司| 国产在视频线精品| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产男女内射视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 只有这里有精品99| 我的老师免费观看完整版| 国产成人精品福利久久| 18+在线观看网站| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 亚洲国产毛片av蜜桃av| 最近的中文字幕免费完整| videossex国产| 18禁在线播放成人免费| 亚洲国产欧美在线一区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 22中文网久久字幕| 91精品一卡2卡3卡4卡| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| av免费观看日本| av.在线天堂| www.av在线官网国产| 国产av一区二区精品久久 | 国产精品一区二区三区四区免费观看| av专区在线播放| 日日啪夜夜爽| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 精品久久久精品久久久| 久久99热这里只频精品6学生| 一边亲一边摸免费视频| 在线观看三级黄色| 一级毛片 在线播放| 日本色播在线视频| 久久久亚洲精品成人影院| 日本免费在线观看一区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 黄色日韩在线| 免费av不卡在线播放| 国产av码专区亚洲av| 在线天堂最新版资源| 欧美激情国产日韩精品一区| 中文资源天堂在线| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产在线男女| 欧美人与善性xxx| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产探花极品一区二区| 熟女电影av网| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲成色77777| 全区人妻精品视频| 亚洲电影在线观看av| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 成人亚洲欧美一区二区av| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 免费av不卡在线播放| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产永久视频网站| 永久免费av网站大全| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲精品亚洲一区二区| 欧美精品一区二区大全| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| av在线观看视频网站免费| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲一区二区三区欧美精品| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 免费观看a级毛片全部| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲av日韩在线播放| 大话2 男鬼变身卡| 国产精品一区二区在线观看99| 国产成人精品福利久久| 熟妇人妻不卡中文字幕| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 丝瓜视频免费看黄片| 新久久久久国产一级毛片| 乱码一卡2卡4卡精品| videos熟女内射| 特大巨黑吊av在线直播| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲精品日本国产第一区| 老司机影院成人| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 一二三四中文在线观看免费高清| 美女内射精品一级片tv| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲国产色片| 亚洲人与动物交配视频| 久久精品久久久久久久性| 男人狂女人下面高潮的视频| 免费观看的影片在线观看| 婷婷色综合www| 大香蕉97超碰在线| 女性被躁到高潮视频| 秋霞在线观看毛片| 高清毛片免费看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 成人美女网站在线观看视频| 日韩成人伦理影院| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久久久久久久久人人人人人人| 两个人的视频大全免费| av在线观看视频网站免费| 少妇人妻一区二区三区视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 精品久久久久久久久av| 国产高清有码在线观看视频| av卡一久久| 精品人妻熟女av久视频| 极品教师在线视频| 99热网站在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 少妇人妻一区二区三区视频| 日本wwww免费看| xxx大片免费视频| 国产成人a∨麻豆精品| 春色校园在线视频观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲av不卡在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 午夜免费观看性视频| 亚洲性久久影院| 黄色配什么色好看| 两个人的视频大全免费| 日日啪夜夜撸| 欧美日韩视频精品一区| 在线观看一区二区三区| 七月丁香在线播放| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久99热这里只频精品6学生| 我要看黄色一级片免费的| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| a级毛色黄片| 国产 一区 欧美 日韩| 秋霞伦理黄片| 黄色一级大片看看| 午夜福利高清视频| 欧美bdsm另类| 少妇的逼好多水| 天美传媒精品一区二区| 成年人午夜在线观看视频| 水蜜桃什么品种好| 久久久久久人妻| 久久这里有精品视频免费| 九九爱精品视频在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产午夜精品一二区理论片| 五月开心婷婷网| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲av.av天堂| 多毛熟女@视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 一级毛片我不卡| 少妇 在线观看| 亚洲人成网站在线播| 夜夜爽夜夜爽视频| 熟女av电影| 黄色日韩在线| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 成人黄色视频免费在线看| 成人国产麻豆网| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产精品福利在线免费观看| 高清日韩中文字幕在线| av在线播放精品| 在线 av 中文字幕| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产人妻一区二区三区在| 香蕉精品网在线| 精品视频人人做人人爽| 免费看不卡的av| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产亚洲5aaaaa淫片| 爱豆传媒免费全集在线观看| 精品少妇久久久久久888优播| 色婷婷久久久亚洲欧美| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 欧美变态另类bdsm刘玥| 精品国产露脸久久av麻豆| 边亲边吃奶的免费视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 搡老乐熟女国产| 丝袜脚勾引网站| 国产日韩欧美亚洲二区| 伦理电影大哥的女人| 91久久精品电影网| 久久久成人免费电影| 青青草视频在线视频观看| 国产人妻一区二区三区在| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 成人亚洲精品一区在线观看 | 亚洲精品国产成人久久av| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产91av在线免费观看| 久久这里有精品视频免费| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 少妇人妻 视频| 国精品久久久久久国模美| 亚洲四区av| 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久久久久久久久久免费av| 午夜福利在线在线| 一边亲一边摸免费视频| 99久久精品国产国产毛片| av黄色大香蕉| 一个人看的www免费观看视频| 五月伊人婷婷丁香| 一级二级三级毛片免费看| 精品一区二区三区视频在线| 99久久人妻综合| 18+在线观看网站| 欧美精品一区二区大全| 最近最新中文字幕免费大全7| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 少妇精品久久久久久久| 亚洲中文av在线| 欧美精品一区二区免费开放| 欧美少妇被猛烈插入视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 丝瓜视频免费看黄片| 久久鲁丝午夜福利片| 男人舔奶头视频| 欧美精品国产亚洲| 最后的刺客免费高清国语| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 交换朋友夫妻互换小说| 国产男女内射视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 成人亚洲欧美一区二区av| 男女下面进入的视频免费午夜| 99九九线精品视频在线观看视频| 少妇熟女欧美另类| 人人妻人人看人人澡| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 性色avwww在线观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲av国产av综合av卡| 少妇的逼好多水| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产 一区 欧美 日韩| 午夜免费男女啪啪视频观看| 22中文网久久字幕| 夫妻午夜视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久久精品免费免费高清| 亚洲真实伦在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 久久久久精品性色| 一级毛片aaaaaa免费看小| 高清黄色对白视频在线免费看 | 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 精品久久久久久久末码| 国产在线一区二区三区精| 岛国毛片在线播放| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国精品久久久久久国模美| 晚上一个人看的免费电影| 九草在线视频观看| 国产精品av视频在线免费观看| 美女福利国产在线 | 18+在线观看网站| 国产黄色免费在线视频| 一级片'在线观看视频| 成年人午夜在线观看视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产精品三级大全| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 亚洲成人av在线免费| 日日撸夜夜添| 精品久久久精品久久久| 丝袜喷水一区| 免费观看av网站的网址| 久久久久视频综合| 一本一本综合久久| 日韩电影二区| 亚洲天堂av无毛| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 一级爰片在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品av视频在线免费观看| 2018国产大陆天天弄谢| 99久国产av精品国产电影| 精品一区二区三卡| 插逼视频在线观看| 亚洲精品,欧美精品| 最近中文字幕高清免费大全6| 一本一本综合久久| 久久久a久久爽久久v久久| 国产成人精品久久久久久| 亚洲欧洲日产国产| 久久人人爽人人片av| 十八禁网站网址无遮挡 | 精品人妻偷拍中文字幕| 国产亚洲最大av| 亚洲成人一二三区av| 成人免费观看视频高清| 亚洲综合色惰| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲三级黄色毛片| 男女边摸边吃奶| 一级毛片久久久久久久久女| 99热这里只有精品一区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 一级a做视频免费观看| 性色av一级| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲精品色激情综合| 51国产日韩欧美| 日韩国内少妇激情av| 少妇丰满av| 最近手机中文字幕大全| 国产欧美日韩精品一区二区| 日本与韩国留学比较| 久久6这里有精品| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产高清国产精品国产三级 | 1000部很黄的大片| 激情五月婷婷亚洲| 免费看av在线观看网站| 国产欧美亚洲国产| www.色视频.com| 老司机影院成人| 国产又色又爽无遮挡免| 欧美精品一区二区免费开放| 国产成人免费无遮挡视频| 精品亚洲成a人片在线观看 | 久久韩国三级中文字幕| 丝袜喷水一区| 在线观看av片永久免费下载| 国产高清国产精品国产三级 | 日韩一本色道免费dvd| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久久久久久国产电影| 国产av精品麻豆| 成人黄色视频免费在线看| 日本av手机在线免费观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 在线观看av片永久免费下载| 国产av国产精品国产| 国产免费又黄又爽又色| av在线观看视频网站免费| 国模一区二区三区四区视频| 成年女人在线观看亚洲视频| 久久久午夜欧美精品| 91精品国产国语对白视频| 国产色婷婷99| 深夜a级毛片| 能在线免费看毛片的网站| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲真实伦在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 国产欧美日韩精品一区二区| av国产免费在线观看| av不卡在线播放| 99国产精品免费福利视频| 亚洲精品乱久久久久久| 性色av一级| 亚洲电影在线观看av| 青青草视频在线视频观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 涩涩av久久男人的天堂| 网址你懂的国产日韩在线| 欧美另类一区| 欧美高清性xxxxhd video| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 一级二级三级毛片免费看| 精品亚洲成国产av| 一区二区三区精品91| 亚洲精品国产av成人精品| 色5月婷婷丁香| av又黄又爽大尺度在线免费看| 性色av一级| 国产熟女欧美一区二区| 成人影院久久| 精品亚洲成国产av| 国产黄频视频在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 国产伦理片在线播放av一区| xxx大片免费视频| 国产v大片淫在线免费观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久青草综合色| h视频一区二区三区| 视频区图区小说| 日韩 亚洲 欧美在线| 在线天堂最新版资源| av在线播放精品| kizo精华| 黑人高潮一二区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲av中文av极速乱| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 少妇的逼水好多| 日韩制服骚丝袜av| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 特大巨黑吊av在线直播| 国产高潮美女av| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 嘟嘟电影网在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲综合精品二区| 十八禁网站网址无遮挡 | 欧美精品国产亚洲| 久久久久久久国产电影| 亚洲一区二区三区欧美精品| 免费观看的影片在线观看| 大香蕉久久网| 搡老乐熟女国产| 日韩视频在线欧美| 草草在线视频免费看| 久久99热6这里只有精品| 国产永久视频网站| 精品久久久精品久久久| 亚洲欧美日韩东京热| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 男女边摸边吃奶| 婷婷色综合www| 成人免费观看视频高清| 18禁在线播放成人免费| 99热这里只有是精品50| 精品国产三级普通话版| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产免费福利视频在线观看| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲久久久国产精品| 免费av中文字幕在线| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 日韩伦理黄色片| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 精品久久久久久久末码| 国产黄片美女视频| 色视频在线一区二区三区| 久久久欧美国产精品| 有码 亚洲区| 一级爰片在线观看| 亚洲av男天堂| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日本av免费视频播放| 午夜激情福利司机影院| 国产免费一级a男人的天堂| 日韩欧美精品免费久久| 成人免费观看视频高清| 嫩草影院新地址| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产在线一区二区三区精| 亚洲天堂av无毛| 99热全是精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲精品国产av成人精品| 国产精品.久久久| 青青草视频在线视频观看| av视频免费观看在线观看| 777米奇影视久久| 伊人久久国产一区二区| av国产免费在线观看| 人妻系列 视频| 亚洲av中文av极速乱| 精品一区二区三区视频在线| 插逼视频在线观看| av卡一久久| 五月开心婷婷网| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产精品人妻久久久久久| 一边亲一边摸免费视频| 国产免费又黄又爽又色| 中国三级夫妇交换| 97在线人人人人妻| 男女免费视频国产| 高清不卡的av网站| 亚洲欧美日韩东京热| 在线观看美女被高潮喷水网站| 免费看不卡的av| 伦理电影免费视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 大片电影免费在线观看免费| 国产成人a区在线观看| 日韩大片免费观看网站| av在线app专区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲人成网站在线播| 日韩中字成人| 欧美极品一区二区三区四区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 美女主播在线视频| 久久久久久久国产电影| 国内揄拍国产精品人妻在线| 九九爱精品视频在线观看| 草草在线视频免费看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 少妇人妻久久综合中文| videos熟女内射| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产成人a区在线观看| 一级片'在线观看视频| 久久这里有精品视频免费| 成人特级av手机在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 偷拍熟女少妇极品色| 免费看光身美女| 美女福利国产在线 | 亚洲欧美成人综合另类久久久| 日本欧美视频一区| 欧美国产精品一级二级三级 | 伦理电影大哥的女人| 高清日韩中文字幕在线| 99久久精品一区二区三区| 一区二区三区四区激情视频| 高清午夜精品一区二区三区| 国产精品久久久久成人av| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲av综合色区一区| 日本午夜av视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产亚洲最大av| 精品酒店卫生间| 深爱激情五月婷婷|