橘小實(shí)蠅半胱氨酸蛋白酶基因克隆及表達(dá)模式*

楊文佳，許抗抗，王進(jìn)軍，李燦

(1. 貴陽(yáng)學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院//有害生物控制與資源利用貴州省高校特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550005；2. 西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院//昆蟲學(xué)及害蟲控制工程重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716)

橘小實(shí)蠅半胱氨酸蛋白酶基因克隆及表達(dá)模式*

楊文佳1,2，許抗抗1,2，王進(jìn)軍2，李燦1

(1. 貴陽(yáng)學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院//有害生物控制與資源利用貴州省高校特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550005；2. 西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院//昆蟲學(xué)及害蟲控制工程重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716)

為了深入了解半胱氨酸蛋白酶基因的作用和尋求害蟲防治新的分子靶標(biāo)，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，從橘小實(shí)蠅Bactroceradorsalis(Hendel)體內(nèi)克隆獲得半胱氨酸蛋白酶基因Bdcyp的cDNA全長(zhǎng)序列(GenBank登錄號(hào)：KU904503)，采用生物信息學(xué)軟件分析了Bdcyp編碼蛋白的特性，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)其在不同發(fā)育階段和不同組織的表達(dá)量。橘小實(shí)蠅Bdcyp的cDNA全長(zhǎng)為1 955 bp，開放閱讀框?yàn)? 653 bp，編碼551個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分別為62 900和6.11。Bdcyp具有半胱氨酸蛋白酶的典型特征，即信號(hào)肽、3個(gè)催化活性區(qū)域(Cys-His-Asn)以及2個(gè)保守的ERFNIN和GNFD特征基序。系統(tǒng)發(fā)育分析表明Bdcyp編碼的蛋白質(zhì)與橄欖實(shí)蠅半胱氨酸蛋白酶親緣關(guān)系最近。Bdcyp在三齡幼蟲、蛹和成蟲期均有表達(dá)，其在蛹中期的表達(dá)量最高；表達(dá)部位主要在幼蟲脂肪體，其次為氣管和表皮，而在中腸的表達(dá)量最低。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究Bdcyp基因功能提供了依據(jù)。

橘小實(shí)蠅；半胱氨酸蛋白酶；克??；序列分析；表達(dá)模式

半胱氨酸蛋白酶(cysteine proteinase，cyp)廣泛存在于微生物、植物和動(dòng)物等生物體內(nèi)，它主要在細(xì)胞內(nèi)和外蛋白降解中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[1-2]。半胱氨酸蛋白酶分為3個(gè)結(jié)構(gòu)家族：木瓜蛋白酶、ICE/CED3型蛋白酶類和天冬酰胺特異性內(nèi)肽酶家族，其中木瓜蛋白酶家族是最大的一個(gè)家族[1]。溶酶體半胱氨酸蛋白酶(Cathepsin，Cat)是木瓜蛋白酶家族的重要部分，目前已在人類和哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)11種。根據(jù)其分子特征和底物特異性，可分為Cat B、C、F、H、K、L、O、S、V、W和X型。Cat具有多種多樣的生物學(xué)功能，它不僅參與體內(nèi)蛋白質(zhì)的水解，還可以參與骨質(zhì)吸收、抗原呈遞、組織再生、腫瘤入侵和轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞凋亡等生理活動(dòng)[3-5]。

迄今為止，在昆蟲中發(fā)現(xiàn)B、L、D、O和T等多種類型的半胱氨酸蛋白酶，其中常見的為Cat B、L和D型。在昆蟲體內(nèi)，半胱氨酸蛋白酶的生理功能并不局限在溶酶體內(nèi)蛋白質(zhì)的降解[6-8]，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)它還參與了昆蟲的個(gè)體發(fā)育過(guò)程，可以調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞發(fā)生和早期胚胎發(fā)育[9-10]，并在昆蟲變態(tài)過(guò)程中組織的解體和重建起著重要作用[11-12]。此外，部分蛋白酶與昆蟲的長(zhǎng)期記憶和種群防御等緊密相關(guān)[13-14]。

橘小實(shí)蠅Bactroceradorsalis(Hendel)，隸屬雙翅目Diptera，實(shí)蠅科Tetriphitedae，由于極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和入侵?jǐn)U散能力，嚴(yán)重危害多種重要的水果和蔬菜，已成為重要的世界性農(nóng)業(yè)害蟲[15-16]。由于人們長(zhǎng)期、大量使用化學(xué)農(nóng)藥防治橘小實(shí)蠅，不可避免地導(dǎo)致其對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗性，防治難度不斷增加[17-18]。因此，探索新的靶標(biāo)、開發(fā)新型控制劑是發(fā)展橘小實(shí)蠅防治策略的當(dāng)務(wù)之急。以往研究表明半胱氨酸蛋白酶在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用，并考慮作為害蟲防治的靶蛋白[6, 19]。因此，本研究在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，利用RACE技術(shù)首次從橘小實(shí)蠅體內(nèi)克隆獲得Bdcysp的全長(zhǎng)基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)研究了其在不同發(fā)育階段和不同組織的時(shí)空表達(dá)特性，為進(jìn)一步揭示該基因的生理功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為其作為害蟲防治的潛在靶標(biāo)基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx與樣品收集

橘小實(shí)蠅于2007年采自福建省福州市，利用人工飼料在人工氣候箱內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)多代并建立種群。飼養(yǎng)條件為溫度(27±1) ℃、相對(duì)濕度(70 ±5)%、光周期14 L∶10D。分別收集不同日齡的橘小實(shí)蠅三齡幼蟲、蛹和新羽化成蟲；選取發(fā)育整齊的三齡第4天的幼蟲，通過(guò)解剖獲得表皮、氣管、中腸、脂肪體和馬氏管5個(gè)組織。將所有樣品經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，每組樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 主要試劑

TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；DNase、rTaq酶和PrimeScript?RT Reagent Kit購(gòu)自TaKaRa公司；SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit購(gòu)自Clontech公司；Gel Extraction Kit購(gòu)自O(shè)mega公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自北京全式金公司；pGEM-T Easy載體和GoTaq?qPCR Master Mix購(gòu)自Promega公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA的提取與第一鏈cDNA的合成 按照TRIzol試劑說(shuō)明書分別提取橘小實(shí)蠅不同發(fā)育階段和不同組織的總RNA，利用瓊脂糖電泳檢測(cè)總RNA的完整性，通過(guò)Nanodrop 2000核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)其濃度和純度，并利用DNase去除基因組DNA。取新羽化成蟲的RNA為模板，分別按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit和PrimeScript?RT Reagent Kit說(shuō)明書合成第一鏈cDNA，用于RACE擴(kuò)增和全長(zhǎng)驗(yàn)證PCR模板制備。所有樣品按照PrimeScript?RT Reagent Kit說(shuō)明書合成第一鏈cDNA，用于實(shí)時(shí)定量PCR模板制備。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)筆者之前測(cè)序完成的橘小實(shí)蠅脂肪體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)[20]，篩選半胱氨酸蛋白酶基因片段，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)相關(guān)引物(表1)用于Bdcyp基因的RACE和開放閱讀框擴(kuò)增，引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

表1 本研究中涉及的引物信息Table 1 Primers used in this study

1.3.3 基因克隆 以1.3.1合成的cDNA為模板，利用相應(yīng)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系，包含2.5 μL 10×PCR緩沖液，2.5 μL MgCl2(25 μmol/L)，2 μL dNTPs (10 nmol/L)，正/反向引物(10 μmol/L)各1 μL，2.0 μL cDNA模板，0.25 μL rTaq酶，ddH2O補(bǔ)足至25 μL，混勻，離心，放入PCR儀擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min，然后95 ℃ 變性30 s，55～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1～2 min，34個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)w=1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，將目的條帶切膠回收，按照Gel Extraction Mini Kit說(shuō)明書操作，然后將回收產(chǎn)物連接至pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，經(jīng)藍(lán)白篩選和PCR鑒定，將陽(yáng)性克隆送往北京六合華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4 序列分析 利用DNAMAN v6.0(Lynnon Biosoft)軟件完成測(cè)序結(jié)果的編輯和分析，推導(dǎo)的氨基酸采用NCBI站點(diǎn)的BLAST(http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST/)程序進(jìn)行同源性比較分析。利用ProtParam(http://web.expasy.org/)、SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和NetNGlys 1.0 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)分析編碼蛋白的理化性質(zhì)、信號(hào)肽和N-糖基化位點(diǎn)。利用Scanprosite(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)分析保守區(qū)域。利用MEGA5.04軟件中的鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[21]，各分支重復(fù)檢驗(yàn)次數(shù)均為1 000。

1.3.5Bdcyp表達(dá)模式分析 采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)橘小實(shí)蠅Bdcyp基因在不同發(fā)育階段和不同組織的相對(duì)表達(dá)量。使用在線軟件Primer 3.0(http://frodo.wi.mit.edu/)設(shè)計(jì)定量PCR引物，內(nèi)參基因采用橘小實(shí)蠅α-Tubulin(GenBank登錄號(hào)：GU269902)[22]，引物序列信息如表1。定量PCR反應(yīng)體系如下：10 μL GoTaq?qPCR Master Mix、1 μL cDNA、7 μL ddH2O和正/反向引物各1 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在CFX96TMReal-Time System 實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-Rad)中進(jìn)行，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火并延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；接著60～95 ℃的熔解曲線。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。利用2-△△CT方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量[23]，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件的單因素方差分析法(ANOVA)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 橘小實(shí)蠅Bdcyp基因cDNA的序列分析

采用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)，克隆獲得橘小實(shí)蠅半胱氨酸蛋白酶基因，命名為Bdcyp(GenBank登錄號(hào)：KU904503)，其cDNA序列全長(zhǎng)1 955 bp，包含5′端非編碼區(qū)142 bp和3′端非編碼區(qū)160 bp，開放閱讀框?yàn)? 653 bp，編碼551個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為62 900，理論等電點(diǎn)pI值為6.11。Bdcyp編碼的蛋白N末端具有20個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列，推測(cè)其可能為分泌型蛋白。根據(jù)NetNGlyc 1.0 server分析結(jié)果，Bdcyp可能存在3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別N102，N435和N447。Bdcyp具有昆蟲半胱氨酸蛋白酶基因家族特有的保守結(jié)構(gòu)域：催化三聯(lián)體(Cys356、His499、Asn519)、ERFNIN基序、GNFD基序以及結(jié)構(gòu)花樣G396C397D398G399G400簇(圖1)。

將Bdcyp編碼的氨基酸序列進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果表明，Bdcyp與同為雙翅目的橄欖實(shí)蠅Bactroceraoleae(GenBank登錄號(hào)：XP_014098451)半胱氨酸蛋白酶的同源性最高，為96%；與地中海實(shí)蠅Ceratitiscapitata(XP_004522056)、銅綠蠅Luciliacuprina(KNC23990)以及埃及伊蚊Aedesaegypti(ABE72972)的相似性分別為92%、87%和67%，進(jìn)一步表明克隆得到的是橘小實(shí)蠅半胱氨酸蛋白酶基因。

2.2 Bdcyp的系統(tǒng)發(fā)育分析

將Bdcyp編碼的氨基酸序列與GenBank登錄的其他昆蟲的半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并通過(guò)MEGA5.04軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，橘小實(shí)蠅Bdcyp與橄欖實(shí)蠅B.oleae半胱氨酸蛋白酶的親緣關(guān)系最近，且聚為一支(圖2)。各目的昆蟲均單獨(dú)成一支，與傳統(tǒng)上的分類關(guān)系一致，說(shuō)明昆蟲半胱氨酸蛋白酶在進(jìn)化上具有較好的保守性。

圖1 橘小實(shí)蠅Bdcyp基因的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列起始密碼子ATG和終止密碼子TAA加粗；*表示終止密碼子；下劃線為信號(hào)肽序列；雙下劃線為糖基化位點(diǎn)；催化三聯(lián)體用方框表示；黑色底紋的為保守結(jié)構(gòu)域(ERFNIN、GNFD和GCDGG)Fig.1 The cDNA and deduced amino acid sequence of Bdcyp in Bactrocera dorsalis The start codon is indicated with bold and the stop codon is indicated with bold and an asterisk. The predicated signal peptide is underlined. N-linked glycosylation is double underlined. Putative catalytic triad is boxed. Three conserved motifs of ERFNIN, GNFD and GCDGG are in white with blackground

圖2 橘小實(shí)蠅Bdcyp系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic relationships analysis of Bdcyp of B. dorsalis

圖3 橘小實(shí)蠅Bdcyp在不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)三齡幼蟲、蛹和成蟲的16個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量；3L1：三齡第1天幼蟲；P1：第1天蛹；A1：第1天成蟲；柱上不同字母代表顯著性差異(單因素方差，P < 0.05)Fig.3 Relative expression level of Bdcyp in different developmental stages of B. dorsalisExpression levels at 16 different time points in third-instar larvae, pupae and adults were detected by qPCR. Different letters above bars indicate significant difference at the 0.05 level (one-way ANOVA)

2.3Bdcyp在橘小實(shí)蠅不同發(fā)育階段的表達(dá)模式

采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)Bdcyp在橘小實(shí)蠅不同發(fā)育階段的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Bdcyp在橘小實(shí)蠅三齡幼蟲、蛹期和成蟲期均有表達(dá)(圖3)。從三齡幼蟲到成蟲的發(fā)育過(guò)程中，Bdcyp的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，蛹期第5天Bdcyp基因mRNA表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期(P< 0.05)，說(shuō)明Bdcyp可能主要在這一時(shí)期發(fā)揮作用。

2.4Bdcyp在橘小實(shí)蠅不同組織間的表達(dá)模式

采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)Bdcyp在橘小實(shí)蠅三齡第4天幼蟲5個(gè)不同組織的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Bdcyp在脂肪體的表達(dá)量顯著高于其他4個(gè)組織(P<0.05)，在表皮和氣管中表達(dá)次之，而在馬氏管和中腸的表達(dá)量較低(圖4)。

3 討 論

半胱氨酸蛋白酶參與昆蟲體內(nèi)的食物消化[6-8]、變態(tài)發(fā)育[9-12]、種群防御[13-14]等生理過(guò)程，在昆蟲生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。干擾半胱氨酸蛋白酶的生理功能，將會(huì)對(duì)目標(biāo)害蟲的活動(dòng)和發(fā)育造成直接影響，導(dǎo)致其生理機(jī)能受到嚴(yán)重阻礙而死亡。因此，深入研究昆蟲半胱氨酸蛋白酶將為開發(fā)新型殺蟲劑提供潛在靶標(biāo)。近年來(lái)昆蟲半胱氨酸蛋白酶的分子研究受到關(guān)注，包括埃及伊蚊A.aegypti[24]、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster[25]、刺舌蠅Glossinamorsitansmorsitans[26]、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera[19]、黃粉蟲Tenebriomolitor[27]、麥桿蠅Deliacoarctata[28]等多種昆蟲的半胱氨酸蛋白酶基因的結(jié)構(gòu)和功能得到了鑒定。本研究以重要的農(nóng)業(yè)害蟲橘小實(shí)蠅為研究對(duì)象，采用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆獲得Bdcyp基因的cDNA全長(zhǎng)。同源性比對(duì)分析結(jié)果表明，Bdcyp編碼的氨基酸序列與其他已知昆蟲的半胱氨酸蛋白酶具有較高的一致性，均在60%以上。Bdcyp具有半胱氨酸蛋白酶的典型特征，包括信號(hào)肽、催化三聯(lián)體以及兩個(gè)保守的ERFNIN和GNFD特征基序，說(shuō)明不同昆蟲的半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)高度保守。

在昆蟲中，半胱氨酸蛋白酶在不同發(fā)育階段的表達(dá)量存在很大的差異，說(shuō)明其在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用。棉鈴蟲Har-CL在幼蟲5～6齡蛻皮前表達(dá)量顯著升高，而后快速下降，然后在化蛹前再次升高，說(shuō)明Har-CL在幼蟲發(fā)育期間被嚴(yán)格調(diào)控[19]。甘藍(lán)地種蠅DeliaradicumDrCP1在整個(gè)發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，包括卵、幼蟲、蛹和成蟲，但在幼蟲-蛹轉(zhuǎn)化期的表達(dá)量明顯升高，說(shuō)明該基因可能與幼蟲變態(tài)化蛹有關(guān)[19]。另外，半胱氨酸蛋白酶在昆蟲胚胎時(shí)期、生殖過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[7,30]。本研究發(fā)現(xiàn)，Bdcyp在橘小實(shí)蠅不同發(fā)育階段均有表達(dá)，主要集中在蛹期高表達(dá)，而在其他時(shí)期的表達(dá)量較低?；诎腚装彼岬鞍酌冈谧儜B(tài)發(fā)育方面的重要作用，推測(cè)Bdcyp在蛹中期的高表達(dá)與這一時(shí)期的主要生命活動(dòng)密切相關(guān)。我們對(duì)橘小實(shí)蠅不同日齡的蛹進(jìn)行解剖觀察，發(fā)現(xiàn)化蛹后1～2 d其體內(nèi)組織出現(xiàn)溶離、解體的現(xiàn)象；化蛹后第5天成蟲形態(tài)初現(xiàn)，隨后蟲體上的覆蓋物消失并羽化為成蟲，而這一時(shí)期Bdcyp的表達(dá)量有明顯的提升，因此推測(cè)Bdcyp在蛹期的組織重建和羽化過(guò)程中起著重要作用。

生物體內(nèi)基因的表達(dá)規(guī)律與其所具有的功能有著密切的聯(lián)系，研究發(fā)現(xiàn)昆蟲半胱氨酸蛋白酶基因的表達(dá)具有組織特異性。已有多數(shù)研究表明，消化器官如腸道是半胱氨酸蛋白酶基因表達(dá)的主要場(chǎng)所，包括黑腹果蠅D.melanogaster[25]、刺舌蠅G.morsitansmorsitans[26]、豌豆蚜Acyrthosiphonpisum[8]，它們是重要的消化蛋白酶。Matsumoto等[7]發(fā)現(xiàn)玉米象鼻蟲Sitophiluszeamais半胱氨酸蛋白酶基因在生殖器官，如卵母細(xì)胞和滋養(yǎng)層中有較高的表達(dá)，推測(cè)其可能在胚胎發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。通過(guò)免疫組化技術(shù)對(duì)半胱氨酸蛋白酶在家蠶Bombyxmori卵中的分布進(jìn)行了定位分析，發(fā)現(xiàn)其與卵黃蛋白的降解相關(guān)[31]。此外，目前還發(fā)現(xiàn)的半胱氨酸蛋白酶的合成部位還有昆蟲的脂肪體以及血淋巴中的血細(xì)胞[24,32]。本研究發(fā)現(xiàn)Bdcyp在橘小實(shí)蠅的幼蟲脂肪體中表達(dá)量最高，而脂肪體在雙翅目蛻皮變態(tài)過(guò)程中發(fā)生解離，推測(cè)Bdcyp可能參與幼蟲組織的解離等。本研究?jī)H從mRNA水平上檢測(cè)了半胱氨酸蛋白酶基因在橘小實(shí)蠅體內(nèi)的表達(dá)情況，尚未涉及蛋白水平的表達(dá)及功能鑒定。根據(jù)本研究獲得的Bdcyp全長(zhǎng)基因結(jié)構(gòu)及在不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的表達(dá)量情況，推測(cè)該基因在組織重建和蛻皮變態(tài)中發(fā)揮著重要作用，下一步將研究該基因在橘小實(shí)蠅變態(tài)發(fā)育過(guò)程中的作用，為基于Bdcyp的分子靶標(biāo)的研發(fā)提供理論參考。

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Molecular cloning and expression profiling of a cysteine proteinase gene in the oriental fruit flyBactroceradorsalis(Hendel)

YANGWenjia1, 2,XUKangkang1, 2,WANGJinjun2,LICan1

(1. Key & Special Laboratory of Guizhou High College for Pest Control and Resource Utilization ∥ College of Biology and Engineering of Environment, Guiyang University, Guiyang 550005, China; 2. Key Laboratory of Entomology and Pest Control Engineering ∥ College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400716, China)

In order to better understand the roles of cysteine proteinase gene and develop a novel molecular target for insect pest control, we obtained the full-length cDNA sequence ofBdcyp(GenBank accession no. KU904503) from the oriental fruit fly,Bactroceradorsalis(Hende) by using RT-PCR and RACE methods. The deduced amino acid sequence analysis ofBdcypwas performed by using bioinformatics methods. The expression patterns ofBdcypin different stages and tissues were investigated using quantitative real-time PCR (qPCR). TheBdcypwas 1 955 bp in lenght, containing an open reading frame of 1 653 bp which encodes 551 amino acid residues with a predicated molecular weight of 62 900 and isoelectric point of 6.11. Bdcyp had typical features of cysteine proteinase, including signal peptide, three catalytic active regions (Cys-His-Asn), and two conserved motifs (ERFNIN and GNFD). Phylogenetic analysis showed that Bdcyp has the closest genetic relationship with the cysteine proteinase ofB.oleae.Bdcypwas constitutively expressed in the tested stages, including third-instar larvae, pupae and adults. The highest expression level was observed at the middle of pupal stage. Tissue-specific expression showed that the highest expression was in the fat body, followed by trachea and integument, and the expression in midgut was the lowest. The results provide the basis for further studying the function ofBdcyp.

Bactroceradorsalis; cysteine proteinase; cloning; sequence analysis; expression pattern

2016-04-22 基金項(xiàng)目：貴州省特色重點(diǎn)學(xué)科基金(ZDXK[2015]11)；貴陽(yáng)學(xué)院高層次人才科研啟動(dòng)費(fèi)(校人才2014003)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(XDJK2013A017)；貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)(黔科合人才[2016]4020)

楊文佳(1986年生)，男；研究方向：昆蟲分子生態(tài)學(xué)；E-mail: yangwenjia10@126.com

李燦(1979年生)，男；研究方向：昆蟲生態(tài)與害蟲綜合治理；E-mail：lican790108@163.com

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.01.021

Q78

A

0529-6579(2017)01-0131-07