豬傳染性胃腸炎核酸疫苗免疫小鼠后的血清抗體IgG檢測(cè)

劉霞

（四川省內(nèi)江市種豬場(chǎng)，四川內(nèi)江641007）

豬傳染性胃腸炎核酸疫苗免疫小鼠后的血清抗體IgG檢測(cè)

劉霞

（四川省內(nèi)江市種豬場(chǎng)，四川內(nèi)江641007）

本試驗(yàn)旨在對(duì)豬傳染性胃腸炎核酸疫苗（含有TGEV-S基因質(zhì)粒）開展免疫原性研究，為科學(xué)評(píng)價(jià)該TGE核酸疫苗的免疫效果提供依據(jù)。通過灌胃口服免疫TGE核酸疫苗誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫，定期采樣監(jiān)測(cè)其血清抗體產(chǎn)生規(guī)律，采用間接ELISA方法測(cè)定免疫小鼠血清抗體IgG的抗體效價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TGE核酸疫苗免疫小鼠后有效地激發(fā)了TGEV特異性抗體，首免后第二周開始就能檢測(cè)到血清抗體應(yīng)答，且該組抗體水平一直都與空載體組和PBS空白對(duì)照組之間呈極顯著差異（P＜0.01），表現(xiàn)出良好的免疫原性。

豬傳染性胃腸炎；核酸疫苗；血清抗體IgG；間接ELISA

豬傳染性胃腸炎（TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起的一種以仔豬嘔吐、腹瀉和高致死率為主要特征的急性、高度接觸性傳染病[1-2]，是造成仔豬早期死亡的重要疫病之一[3-4]。TGE被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）確定為B類傳染病，是我國(guó)法定檢疫的疫病。TGEV屬冠狀病毒科冠狀病毒屬，是單股正鏈RNA病毒，主要編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白：核蛋白（N），膜蛋白（M），纖突糖蛋白（S），小膜蛋白（sM）[5-6]。其中S蛋白對(duì)TGEV是非常重要的，是唯一能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的結(jié)構(gòu)蛋白，是基因工程研究的重點(diǎn)[7-8]。

目前研究表明，常規(guī)藥物對(duì)TGE的治療效果很不理想，疫苗接種是預(yù)防該病的有效方法[9-10]。針對(duì)TGEV腸道感染的特點(diǎn)，口服疫苗免疫是預(yù)防該病較為理想的途徑[5]。近年來，在TGEV口服疫苗方面的研究表明，以減毒沙門氏菌為載體攜帶DNA疫苗進(jìn)行口服免疫，被證實(shí)具有運(yùn)送效率高，方法簡(jiǎn)單，免疫效果較好，安全性高，能同時(shí)激發(fā)全身免疫和局部黏膜免疫等優(yōu)點(diǎn)，有著良好的應(yīng)用前景。

正是基于TGEV的S蛋白在決定宿主的親嗜性、致病性、血凝性方面起關(guān)鍵作用并且是唯一能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)的結(jié)構(gòu)蛋白，同時(shí)針對(duì)TGEV腸道感染和減毒沙門氏菌的特點(diǎn)，本試驗(yàn)選用了以減毒沙門氏菌為載體的含TGEV S基因的核酸疫苗，結(jié)合病原TGEV的感染途徑和發(fā)病機(jī)理，通過灌胃免疫昆明小鼠，采集血清，通過間接ELISA法檢測(cè)小鼠血清抗體IgG的產(chǎn)生規(guī)律，以驗(yàn)證該核酸疫苗的免疫效果，為科學(xué)評(píng)價(jià)該TGE核酸疫苗提供科學(xué)依據(jù)，也為以后在豬場(chǎng)投入使用該疫苗提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來源TGE核酸疫苗（含S基因的重組減毒沙門氏菌），空載體（不含S基因的重組減毒沙門氏菌），由本單位實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG酶標(biāo)二抗，購(gòu)自北京博奧森生物有限公司；TMB底物反應(yīng)液，購(gòu)自北京天根生物有限公司；卡那霉素（Kan），購(gòu)自美國(guó)AMERSCO公司；BSA等。

1.1.3 自配試劑PBS溶液：稱取NaCl 8 g/L、KCl 0.2 g/L、KH2PO40.2 g/L、Na2HPO412.03 g/L，然后用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2，115℃高壓下滅菌20min，室溫下保存。

PBST洗滌液：在PBS溶液中加入0.1%吐溫-20即得。

包被緩沖液：稱取Na2CO31.59g和NaHCO32.93g，定容至1000mL后置室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

反應(yīng)終止液（2mol/L H2SO4）：向60mL雙蒸水中緩慢加入10.8mL濃硫酸，注意邊滴加邊攪拌，定容至100mL后置室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡雌性昆明小鼠，購(gòu)自成都某生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 免疫小鼠分組將體重為20g左右的6周齡雌性昆明小鼠隨機(jī)分成3組（見表1），分別為TGE核酸疫苗組、空載體組、PBS對(duì)照組，每組16只小鼠。以每只小鼠1×109CFU/0.2mL灌胃免疫，免疫前禁食禁水4 h（使沙門氏菌得到充分免疫），免疫后1 h恢復(fù)正常飲食。一共免疫3次，每次間隔2周[11]。

表1 免疫小鼠分組

1.2.2 血清樣品制備各免疫組分別在免疫前和首免后的2、4、6周隨機(jī)捕殺4只昆明小鼠，摘眼采血[11]，血液置4℃下過夜以充分析出血清，然后4000 r/min離心5min收集血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 TGEV特異性血清抗體IgG的檢測(cè)取免疫前和首免后2、4、6周所采集的血清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)注意盡量減少血清的反復(fù)凍融，檢測(cè)的具體操作步驟如下：

（1）TGEV抗原包被：將表達(dá)純化的TGEV Sbc蛋白和包被緩沖液按終濃度10μg/100μL混勻，然后按100μL/孔加入到96孔酶標(biāo)板，4℃下包被過夜。

（2）BSA封閉：甩干包被緩沖液，按250μL/孔加入PBST洗滌液，然后置于振蕩器上振蕩3min，叩干。如此重復(fù)3次。再按100μL/孔加入封閉液（BSA），置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中封閉1h。

（3）加入待檢血清：甩干封閉液，按250μL/孔加入PBST洗滌液，然后置于振蕩器上振蕩3min，叩干。如此重復(fù)3次。按100μL/孔加入50倍稀釋的待檢血清，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中1h。

（4）加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠酶標(biāo)二抗：取出后按250μL/孔加入PBST洗滌液，然后置于振蕩器上振蕩3min，叩干。如此重復(fù)3次。按100μL/孔加入5000倍稀釋的酶標(biāo)二抗，然后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中1h。

（5）加入底物反應(yīng)液：取出后按250μL/孔加入PBST洗滌液，置于振蕩器上振蕩3min，叩干。如此重復(fù)3次。按100μL/孔加入底物反應(yīng)液（TMB），置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中避光顯色15min。

（6）加入終止反應(yīng)液：取出后按100μL/孔加入終止反應(yīng)液以終止反應(yīng)。

（7）讀數(shù)：終止反應(yīng)后，使用ELISA酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450nm下測(cè)定OD450值。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)所測(cè)得的OD450值進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SEM）表示。

表2 免疫小鼠抗TGEV血清IgG抗體的間接ELISA檢測(cè)結(jié)果

圖1 免疫小鼠抗TGEV血清IgG抗體的間接ELISA檢測(cè)

2 結(jié)果與分析

免疫小鼠血清特異性IgG抗體檢測(cè)結(jié)果見表2、圖1。由表2可得，免疫前各組血清特異性IgG抗體水平都較低，組間差異不顯著（P＞0.05）；免疫后第2周，TGEV核酸疫苗組（含S基因）的抗體OD450值分別比空載體組和PBS對(duì)照組高0.081和0.097，且TGEV核酸疫苗組（含S基因）與空載體組、PBS組之間差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），但空載體組和PBS組之間差異不顯著（P＞0.05），說明TGEV核酸疫苗組（含S基因）在小鼠體內(nèi)成功地釋放了所攜帶的TGEV S基因，激發(fā)小鼠機(jī)體產(chǎn)生特異性TEGV IgG血清抗體；免疫后第4周和第6周，TGEV核酸疫苗組（含S基因）的血清特異性IgG抗體水平與空載體組、PBS組的差異進(jìn)一步擴(kuò)大，均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），且空載體組和PBS組之間差異也極顯著（P＜0.01）。

圖1顯示，在整個(gè)試驗(yàn)過程中，隨著免疫次數(shù)的增加，TGEV核酸疫苗組（含S基因）的血清特異性抗體IgG水平持續(xù)上升，其中0～4周上升幅度較大，4～6周上升幅度較小；空載體組的血清抗體IgG水平在0～4周也有較大提高，但增幅明顯較TGE核酸疫苗組（含S基因）低，且三免后兩周略有下降；PBS組的血清特異性抗體IgG水平有升有降，但始終維持在較低的水平。

3 分析

核酸疫苗是20世紀(jì)90年代誕生的基因工程重組疫苗，因其制備工藝簡(jiǎn)單，能有效激發(fā)全面的免疫應(yīng)答，便于制備多價(jià)與多聯(lián)疫苗，使用安全而被廣泛應(yīng)用于多種疫病的疫苗研究中，并取得了良好的試驗(yàn)效果。豬傳染性胃腸炎（TGE）是由冠狀病毒科冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒引起的一種消化道傳染病，其中2周齡以內(nèi)的仔豬死亡率高達(dá)100%[12-14]。該病在我國(guó)許多地方豬場(chǎng)均有發(fā)生，近年來有擴(kuò)大流行的趨勢(shì)，也是世界各國(guó)引起仔豬早期死亡的重要疫病之一。目前的研究表明藥物對(duì)TGE的治療效果不明顯，對(duì)該病只能采取“疫苗預(yù)防為主，藥物治療為輔”的方針。因此，TGE核酸疫苗的研究與開發(fā)一直是近年來該病的研究重點(diǎn)。隨著對(duì)病原的深入研究，發(fā)現(xiàn)TGEV的S蛋白含有宿主細(xì)胞氨肽酶（pAPN）的識(shí)別位點(diǎn)，在病毒感染、發(fā)揮致病性和決定宿主細(xì)胞親嗜性等方面起關(guān)鍵作用，而且S蛋白攜帶的B淋巴細(xì)胞抗原決定簇，是唯一能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體與提供免疫保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)蛋白。因此S蛋白是TGE疫苗研究的重點(diǎn)。

本試驗(yàn)選擇了以減毒沙門氏菌作為載體的含TGEV-S基因的核酸疫苗，灌胃免疫昆明小鼠，在首免后第2周就能檢測(cè)到特異性血清抗體應(yīng)答，且該組抗體IgG水平一直都與空載體組和PBS空白對(duì)照組之間呈極顯著差異（P＜0.01），表現(xiàn)出良好的免疫原性，有效地激發(fā)了TGEV特異性血清抗體。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用灌胃免疫昆明小鼠并定期采集血清，通過間接ELISA方法摸清了血清特異性IgG抗體產(chǎn)生的規(guī)律。結(jié)果表明：TGE核酸疫苗成功地激發(fā)了小鼠機(jī)體內(nèi)的體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生了TGEV特異性抗體，表現(xiàn)出了良好的免疫原性，一定程度上說明該TGE核酸疫苗效果良好，可適當(dāng)在豬場(chǎng)投入使用。

[1]楊恒，曹三杰，黃小波，等.TGEV雙基因嵌合表達(dá)質(zhì)粒pVAX-S-N的構(gòu)建及體外表達(dá)[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，29（3）：254-257.

[2]曹軍平，朱愛萍，肖作煥，等.豬傳染性胃腸炎的診斷與防制[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2000（6）：29.

[3]冉智光，王玉春.豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學(xué)研究新進(jìn)展[J].天津畜牧獸醫(yī)，1998，15（4）：4-6.

[4]斯特勞B E.豬病學(xué)[M].趙德明，張中秋，沈建忠，譯.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2000.

[5]Krempl C，Schultze B，Laude H，et al.Point mutations in the S protein connect the sialic acid binding activity with the enteropathogenicity of transmissible gastroenteritis coronavirus[J].J Virol，1997，71（4）：3285-3287.

[6]Jimenez G，Correa L，Melgosa M P，et al.Critical epitopes in transmissible gastroenteritis virus neutralization[J].J Virol，1986，60（1）：131-139.

[7]姜騫.豬傳染性胃腸炎檢測(cè)試劑的研制及快速診斷方法的研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2003.

[8]楊樂樂.豬傳染性胃腸炎病毒S基因表達(dá)的研究及其原核表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性分析[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2005.

[9]任玲，李廣興，張宏偉.豬傳染性胃腸炎病毒S基因核酸疫苗免疫小鼠體液免疫功能變化的研究[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2007，26（5）：16-18.

[10]胡延春，鄭傳廷，王妍，等.現(xiàn)代科技對(duì)動(dòng)物疫病防控的推動(dòng)作用[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘，2009（6）：38-40.

[11]師東方，李一經(jīng)，唐麗杰，等.豬傳染性胃腸炎病毒核酸免疫昆明鼠的抗體應(yīng)答[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，2003，33（8）：31-34.

[12]Enjuanes L，Sune C，Gebauer F，et al.Antigen selection and presentation to protect against trans missible gastroenteritis coronavirus[J].Veterinary Micro Biology，1992，33（1-4）：249-262.

[13]Hooper B E，Haelterman E O.Concepts of the pathogenesis and passive immunity in transmissible gastroenteritis of swine[J].J Am Vet Med Assoc，1966，149：1580-1586.

[14]王樹成，趙祥平.豬傳染性胃腸炎病毒在組織細(xì)胞上增殖的研究[J].中國(guó)畜禽傳染病，1998，20（1）：21-22.

Detection of the Serum IgG Antibody in M ice A fter Being Immunized w ith TGE Nucleic Acid Vaccine

Liu Xia
（Pig Breeding Farm of Neijiang City，Sichuan Neijiang 641007，China）

In order to provide theoretical basis for scientific evaluation，this experiment was conducted to study the immunogenicity of the TGE nucleic acid vaccine，carring S gene of TGEV.To induce specific immunity，the female Kunming mice were orally immunized with the TGE nucleic acid vaccine.The samples of serum were collected every two weeks within 1～6 weeks after being immunized and detected for specific IgG antibody titer by the indirect ELISA.The results showed that TGE nucleic acid vaccine could induce high titer antibody，the specific IgG antibody was induced starting from the second week after the first immunization，the IgG antibody of TGE nucleic acid vaccine，carring S gene of TGEV in the experimental group was higher than that of the latter two control groups and distinguished significantly（P＜0.01），and showed good immunogenicity.

TGE；Nucleic acid vaccine；Serum IgG antibody；Indirect ELISA

S852.43

B

1001-8964（2017）05-0027-04

2017-03-01

劉霞（1986-），女,四川隆昌人，農(nóng)學(xué)學(xué)士，助理獸醫(yī)師，主要從事內(nèi)江豬保種相關(guān)工作。