河南省及周邊地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型分子流行病學(xué)調(diào)查

焦文強(qiáng)，王治方，王克領(lǐng)，白獻(xiàn)曉，郎利敏，李海利，朱文豪，張青嫻，徐引弟

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002)

河南省及周邊地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型分子流行病學(xué)調(diào)查

焦文強(qiáng)，王治方，王克領(lǐng)，白獻(xiàn)曉，郎利敏，李海利，朱文豪，張青嫻，徐引弟*

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002)

為了解河南及周邊地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)的分子流行病學(xué)情況，運(yùn)用PCR方法對(duì)2014—2015年采集到的河南及周邊地區(qū)山東、山西、河北、甘肅5省共158份病料進(jìn)行PCV2檢測(cè)，將PCR擴(kuò)增得到的PCV2 ORF2基因片段進(jìn)行測(cè)序，分析研究PCV2遺傳變異情況。結(jié)果顯示，158份樣品中，有69份樣品為PCV2陽(yáng)性，得到19株病毒的ORF2基因序列；將檢測(cè)到的PCV2 ORF2序列與國(guó)內(nèi)外分離株進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，核苷酸序列的同源性為89.9%～99.9%，其氨基酸序列同源性為88.0%～99.6%。綜上可知，河南及周邊地區(qū)PCV2流行廣泛，病毒變異頻繁。

豬圓環(huán)病毒2型； ORF2； 分子流行病學(xué)； 序列分析； 進(jìn)化分析

豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)是由豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)感染引起的，發(fā)生于5～12周齡的保育豬，臨床主要表現(xiàn)為呼吸困難、喘氣、皮膚蒼白以及進(jìn)行性消瘦[1]。自1991年P(guān)MWS被首次報(bào)道以來(lái)，歐洲、亞洲以及大洋洲等先后報(bào)道此病，其呈全球性分布[2-5]。2011年，郎洪武等[6]首次成功分離PCV2，證明我國(guó)存在PCV2感染情況。

豬圓環(huán)病毒 (porcine circovirus)是無(wú)囊膜的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒，根據(jù)血清型的不同，PCV可以分為PCV1和PCV2，其中，PCV1對(duì)豬無(wú)致病性，PCV2是引起PMWS的主要病原。PCV2基因組為小型的單鏈環(huán)狀DNA，大小約1.7 kb，包括3個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frames,ORFs)，其中，ORF2編碼病毒的核包膜蛋白Cap蛋白，Cap蛋白有較多的抗原表位，這些抗原表位在免疫壓力下發(fā)生突變，使得PCV2不斷變異進(jìn)化[7-9]。因此，研究ORF2的遺傳變異情況對(duì)于PCV2的防控有重要意義。

為了深入了解PCV2遺傳變異情況，本研究于2014—2015年共采集來(lái)自河南、河北、山西、山東、甘肅5省的158份樣品，通過(guò)PCR擴(kuò)增、測(cè)序，應(yīng)用DNA Star軟件比對(duì)ORF2的核苷酸及氨基酸序列的同源性，以期為PCV2的防控提供參考，為新型疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試樣品

2014—2015年期間采集來(lái)自河南、河北、山東、山西以及甘肅的樣品158份，包括肺臟、淋巴結(jié)等。將樣品進(jìn)行標(biāo)記后，-80 ℃保存。

1.2 主要菌株、試劑、載體

TaqDNA 聚合酶、pMD19-T Simple載體、DL2000 Marker均購(gòu)自寶生物(大連)生物有限公司；T4 DNA 連接酶購(gòu)自NEB公司；基因組DNA提取試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理以及DNA的提取 待檢病料經(jīng)過(guò)3次反復(fù)凍融，剪碎、研磨，加入1 mL PBS緩沖液，充分混合均勻后13 000 r/min離心10 min，取上清液，按照杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司DNA抽提試劑盒操作說(shuō)明提取基因組總DNA。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)及克隆 參考NCBI中收錄的PCV2 ORF2的序列，選取其基因組中保守的序列，采用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增完整的ORF2基因。引物序列為ORF2-F：5′-ATTTCCGATTTATACCAT-3′；ORF2-R：5′-GCTGAACAGCATCCA-3′。以1.3.1提取的DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR體系如下：DNA 5 μL，上、下游引物各1 μL，10×TaqBuffer 5 μL，dNTP 8 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，回收與預(yù)期大小相符的片段，連接pMD19-T Simple載體，4 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)15 h后挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽(yáng)性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.3.3 序列測(cè)定與分析 將測(cè)序結(jié)果使用DNA Star軟件包中的Edit Seq軟件進(jìn)行序列拼接、編輯，使用Meg Align軟件將本研究得到的序列與GenBank中收錄的序列進(jìn)行核苷酸和氨基酸的比對(duì)；應(yīng)用MEGA 5.0軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，采用Neighbor-Joining法生成系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV2 ORF2基因PCR檢測(cè)結(jié)果

158份樣品中，有69份樣品檢測(cè)為PCV2陽(yáng)性，陽(yáng)性率高達(dá)43.7%。從圖1可以看出，PCR擴(kuò)增PCV2 ORF2基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可以看到預(yù)期的728 bp大小的片段。

M.2000 Marker;1.檢測(cè)樣品

2.2 ORF2核苷酸序列同源性比對(duì)結(jié)果

序列分析結(jié)果顯示，從供試病料中共檢測(cè)到19株P(guān)CV2毒株的ORF2基因序列，這19株P(guān)CV2毒株之間的ORF2區(qū)域核苷酸同源性為90.0%～100%，與GenBank中收錄的PCV2的同源性為89.9%～99.9%(圖2)。

2.3 ORF2 氨基酸序列同源性比對(duì)結(jié)果

使用DNA Star軟件中的Edit Seq將檢測(cè)的19株P(guān)CV2 ORF2序列翻譯成氨基酸序列，使用DNA Star軟件中的Meg Align進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究檢測(cè)到的19株P(guān)CV2之間ORF2氨基酸序列同源性為88.4%～100%，與GenBank中收錄的PCV2的氨基酸序列同源性為88.0%～99.6%(圖3)。

2.4 ORF2抗原位點(diǎn)比對(duì)結(jié)果

使用DNA Star軟件中的 Meg Align對(duì)本研究檢測(cè)到的PCV2氨基酸序列與GenBank中收錄的PCV2氨基酸序列進(jìn)行抗原位點(diǎn)比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)的PCV2 Cap蛋白氨基酸變異位點(diǎn)主要集中在59—101 aa、134—169 aa和180—210 aa這3個(gè)區(qū)域(圖4)。

圖3 ORF2氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

2.5 基于ORF2構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

使用MEGA 5.0軟件進(jìn)行分析，采用Neighbor-Joining法將本研究得到的19株P(guān)CV2 ORF2序列與從GenBank下載的國(guó)內(nèi)外參考毒株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，本研究得到的19株序列中，有18株屬于PCV2b基因群，1株屬于PCV2a基因群；在18株P(guān)CV2b基因群中，有9株屬于PCV1a/1b亞型，9株屬于PCV1c亞型(圖5)。

3 結(jié)論與討論

自首次報(bào)道PCV2以來(lái)，眾多學(xué)者針對(duì)PCV2分子流行病學(xué)開(kāi)展了大量調(diào)查工作，國(guó)內(nèi)相關(guān)數(shù)據(jù)表明，PCV2在國(guó)內(nèi)流行情況很嚴(yán)峻，且流行情況呈現(xiàn)蔓延的趨勢(shì)[10-12]。為分析河南及周邊地區(qū)PCV2流行情況，筆者所在課題組相關(guān)工作人員于2014—2015年共收集158份疑似PCV2感染樣品，通過(guò)PCR方法檢測(cè)到69份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率高達(dá)43.7%，這表明在河南及周邊地區(qū)PCV2感染率很高，嚴(yán)重威脅了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

圖4 ORF2主要抗原位點(diǎn)比對(duì)結(jié)果

本研究檢測(cè)到的19株P(guān)CV2 ORF2序列中有18株為PCV2b，僅1株為PCV2a，表明PCV2b是目前河南及周邊的主要流行毒株，與前人研究結(jié)果一致[13-14]。根據(jù)PCV2 ORF2基因序列遺傳進(jìn)化分析結(jié)果，18株P(guān)CV2b 中9株為PCV1a/1b亞型，9株為PCV1c亞型。

有研究表明，2008年以前我國(guó)PCV2主要流行毒株為PCV1a/1b，PCV1c從無(wú)到有，日趨成為主要流行毒株，其起源以及是否會(huì)造成PCV2b毒力增強(qiáng)等均需要進(jìn)一步研究。 PCV2b能夠取代PCV2a成為流行毒株,主要是因?yàn)镻CV2b毒株在細(xì)胞間擴(kuò)散能力以及對(duì)宿主細(xì)胞的吸附能力均強(qiáng)于PCV2a[8]， 較PCV2a具有更高的致病性[15-16]。

Cap蛋白是PCV主要的免疫原性蛋白，由于處于疫苗的免疫壓力下可能會(huì)以突變的形式逃避免疫反應(yīng)，進(jìn)而Cap蛋白的抗原性、免疫原性等可能會(huì)受到影響[17]。Cap蛋白中P110和R191與病毒毒力直接相關(guān)，本研究檢測(cè)的樣品中，P110沒(méi)有發(fā)生突變，而第191位氨基酸發(fā)生了G-R的突變。本研究中，通過(guò)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Cap蛋白存在3個(gè)變異較為集中的區(qū)域，主要為59—101 aa、134—169 aa和180—210 aa，這與先前的研究一致[17]。值得注意的是，PCV1c日漸成為流行毒株，這需要引起足夠的重視。

圖5 基于ORF2構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

[1] Ellis J,Hassard L,Clark E.Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome[J].Can Vet J,1998,39(1):44-51.

[2] Allan G M,Mcneilly F,Kennedy S D,etal.Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe[J].J Vet Diagn Invest,1998,10(1):3-10.

[3] Choi C,Chae C.In-situ hybridization for the detection of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome[J].Comp Pathol,1999,121(3):265-270.

[4] Trujano M,Iglesias G,Segales J,etal.PCV-2 from emaciated pigs in Mexico[J].Vet Rec,2001,148(25):792.

[5] Wellenberg G J,Pesch S,Berndsen F W,etal.Isolation and characterization of porcine circovirus type 2 from pigs showing signs of post-weaning multisystemic wasting syndrome in the Netherlands[J].Vet Q,2000,22(3):167-172.

[6] 郎洪武,王力,張廣川,等.分離鑒定及豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合征的診斷[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，2001,31(3)：3-5.

[7] 梅林,邢海云,郭麗春,等.中國(guó)北方部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒Ⅱ型分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2011,24(1)：1-4.

[8] Li W,Wang X,Ma T,etal.Genetic analysis of porcine circovirus type 2 (PCV2) strains isolated between 2001 and 2009:Genotype PCV2b predominate in postweaning multisystemic wasting syndrome occurrence in eastern China[J].Virus Genes,2010,40(2):244-251.

[9] Wang F X,Guo X,Ge Z,etal.Genetic variation analysis of Chinese strains of porcine circovirus type 2[J].Virus Research,2009,145(1):151-156.

[10] 李超，魏建忠，凌英濟(jì)，等.安徽省豬圓環(huán)病毒2型感染的流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2010,22(4)：330-332.

[11] 吳媛，范紅結(jié)，李君榮，等.金華地區(qū)豬圓環(huán)病毒病病原流行病學(xué)調(diào)查[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2010,31(6)：79-82.

[12] 趙津，張小敏，周斌，等.2008—2010年華東地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型感染血清學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2010,18(6)：49-52.

[13] 李玲，李國(guó)新，周艷君，等.2008—2011年中國(guó)部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的分子流行病學(xué)調(diào)查 [J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2012,20(2)：1-10.

[14] 邵萌，呂亞輝，杜謙，等.2010—2012年陜西地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型分子流行病學(xué)調(diào)查[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,41(10)：19-26.

[15] Cheung A K,Lager K M,Kohutyuk O I,etal.Detection of two porcine circovirus type 2 genotypic groups in United States in herds[J].Arch Virol,152(5):1035-1044.

[16] Dupont K,Nielsen E O,Baekbo P,etal.Genomic analysis of PCV2 isolates from Danish archives and a current PMWS case-control study supports a shift in genotypes with time[J].Vet Microbiol,2008,128(1/2):56-64.

[17] Grenfell B T,Pybus O G,Gon J R,etal.Unifying the epidemiological and evolutionary dynamics of pathogens[J].Science,2004,303:327-332.

Molecular Epidemiological Investigation of Porcine Circovirus Type 2 in Henan and Nearby Provinces

JIAO Wenqiang,WANG Zhifang,WANG Keling,BAI Xianxiao,LANG Limin, LI Haili,ZHU Wenhao,ZHANG Qingxian,XU Yindi*

(Institute For Animal Husbandary and Veterinary Research,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

In order to investigate molecular epidemiology of porcine circovirus type 2(PCV2),a total of 158 samples including serum samples,lungs,lymph node were collected between 2014 and 2015 in Henan,Hebei,Shandong,Shanxi and Gansu provinces.All the 158 samples were subjected to PCR and the positive samples were sequenced to obtain the whole ORF2 gene.The results showed that 69 samples were PCV2 positive according to PCR,and 19 ORF2 genes were acquired.Sequence comparision showed that the nucleotide sequence homologies of ORF2 genes were up to 89.9%—99.9%,and the amino acid homologies were 88.0%—99.6%.The results indicated that the PCV2 was endemic in Henan province and provinces nearby,and PCV2 varied frequently.

porcine circovirus type 2(PCV2); ORF2; molecular epidemiology; sequence analysis; evolutionary analysis

2016-11-22

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目( 162102110050)

焦文強(qiáng)(1982-)，男，河南新鄉(xiāng)人，助理研究員，博士，主要從事分子病毒學(xué)方向研究工作。 E-mail:wenqiangjiao@163.com

*通訊作者：徐引弟(1974-)，女，河北稀水人，副研究員，博士，主要從事豬傳染病分子病毒學(xué)研究工作。 E-mail:645843634@qq.com

S855.3

A

1004-3268(2017)05-0125-05