不同降解菌對甲基毒死蜱及3,5,6-三氯-2-吡啶酚的降解能力比較

李曉樓

(四川職業(yè)技術(shù)學院 建筑與環(huán)境工程系，四川 遂寧 629000)

不同降解菌對甲基毒死蜱及3,5,6-三氯-2-吡啶酚的降解能力比較

李曉樓

(四川職業(yè)技術(shù)學院 建筑與環(huán)境工程系，四川 遂寧 629000)

為掌握微生物降解甲基毒死蜱的特性與機制，首先從土壤中分離不同的甲基毒死蜱降解菌，然后對其降解效率、降解過程中中間產(chǎn)物3,5,6-三氯-2-吡啶酚(TCP)的質(zhì)量濃度變化、對TCP與其他6種有機磷農(nóng)藥的降解能力以及磷酸酯酶活性進行了測試分析。結(jié)果表明，分離到2株能高效降解甲基毒死蜱的菌株，經(jīng)鑒定命名為地衣芽孢桿菌ZL-7與熒光假單胞菌ZHLXL-2，其降解甲基毒死蜱的5 d降解率分別為90.6%和99.4%；在菌株ZL-7降解甲基毒死蜱的過程中檢出了TCP，而在菌株ZHLXL-2的降解過程中未檢出。菌株ZHLXL-2能降解TCP，48 h降解率可達91.0%，而菌株ZL-7不能降解TCP。兩菌株都能降解6種供試的有機磷農(nóng)藥，但菌株ZL-7降解率更高，其10 d降解率在92.1%～99.8%，菌株ZHLXL-2的10 d降解率為89.2%～93.4%；同時菌株ZL-7的磷酸酯酶活性顯著高于菌株ZHLXL-2。分析表明，這2種菌株的磷酸酯酶活性與其降解有機磷農(nóng)藥的能力呈正相關(guān)性，而菌株ZHLXL-2因可有效降解中間物TCP，從而能更快地降解甲基毒死蜱。

地衣芽孢桿菌; 熒光假單胞菌; 有機磷農(nóng)藥；甲基毒死蜱; 3,5,6-三氯-2-吡啶酚; 降解

甲基毒死蜱(O,O-二甲基-O-3,5,6-三氯-2-吡啶基硫逐磷酸酯)是一種廣譜型有機磷殺蟲劑，它通過抑制乙酰膽堿酯酶的活性，干擾害蟲正常的神經(jīng)傳導，并導致害蟲死亡[1]。甲基毒死蜱在世界范圍內(nèi)作為商品殺蟲劑應用已有約40 a的歷史，1975年其被聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織認可，推薦作為儲糧害蟲防護劑使用，并作為防治衛(wèi)生害蟲的有機磷農(nóng)藥之一[2]。

甲基毒死蜱的大量應用可能導致其在農(nóng)作物中廣泛殘留，并不可避免地導致土壤及水體污染，這些均會對人類健康及生態(tài)環(huán)境造成潛在危害。因此，需要充分掌握甲基毒死蜱的殘留狀況及降解機制，并探索如何從污染的土壤、水體或農(nóng)作物中去除甲基毒死蜱等農(nóng)藥殘留。通常，具降解能力的微生物被認為在有機磷農(nóng)藥的環(huán)境分解及解毒中起重要作用[3]。目前也已經(jīng)分離了一些甲基毒死蜱的降解菌株，例如：Kim等[4]分離到一株能高效降解甲基毒死蜱的伯克霍爾德氏菌Burkholderiasp.KR100，它能將甲基毒死蜱完全降解，同時也能降解樂果、馬拉硫磷以及毒死蜱等多種有機磷農(nóng)藥；Abraham等[5]獲得的一株鞘氨醇桿菌Sphingobacteriumsp.JAS3也能有效降解甲基毒死蜱。微生物降解甲基毒死蜱的關(guān)鍵步驟是將其水解為3,5,6-三氯-2-吡啶酚(TCP)，但是降解中間物TCP在自然環(huán)境中的穩(wěn)定性較其母體更高，導致TCP較甲基毒死蜱更難降解，并且還會抑制某些磷酸酯鍵水解酶對甲基毒死蜱的分解，這一般是由于TCP 與酶發(fā)生某種程度的結(jié)合進而影響了酶活性[4,6]。另外，TCP也具有較大的毒性，且水溶性比甲基毒死蜱更高，導致其更容易污染水體和土壤，從而放大其危害[7]。在研究甲基毒死蜱生物降解特性的過程中發(fā)現(xiàn)，某些甲基毒死蜱降解菌僅能將其分解為TCP，而不能將TCP降解，這可能導致只是在名義上消除了甲基毒死蜱殘留。為此，從土壤中分離獲得不同的甲基毒死蜱降解菌地衣芽孢桿菌ZL-7與熒光假單胞菌ZHLXL-2，對比分析二者在甲基毒死蜱降解速率、TCP降解能力、磷酸酯酶活性以及有機磷農(nóng)藥降解能力等方面的參數(shù)，以期更完整地掌握微生物降解甲基毒死蜱的特點和機制，并為處理甲基毒死蜱及相關(guān)農(nóng)藥污染打下更堅實的基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

試劑：甲基毒死蜱(98%)與甲基毒死蜱標準品購自Sigma-Aldrich公司(美國)，TCP購自Dr.Ehrenstorfer公司(德國)，乙腈、丙酮購自Merck公司(德國)，所有化學試劑均為分析純或以上級別。

蛋白酶抑制劑混合物：0.3 mg/mL EDTA、35 μg/mL苯甲基磺酰氟(PMSF)、0.7 μg/mL抑肽素(pepstatin)、0.5 μg/mL亮肽素(leupeptin)。

培養(yǎng)基：(1)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉浸膏3 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 L，pH值7.0；(2)LB培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1 L，pH值7.0；(3)甲基毒死蜱降解菌分離培養(yǎng)基：K2HPO40.61 g、KH2PO40.39 g、KCl 0.25 g、MgSO4·7H2O 0.13 g、蒸餾水1 L、微量元素液1.0 mL(每升微量元素液含CaCl2·2H2O 1.0 mg、FeSO4·7H2O 40 mg、MnSO4·4H2O 40 mg、ZnSO4·7H2O 20 mg、CuSO4·5H2O 5 mg、NaCl 1.0 g)， pH值自然；甲基毒死蜱的添加量根據(jù)試驗需要確定。

儀器：島津UV-2550分光光度計(日本)、AgilentTM7890A氣相色譜儀(美國)、AgilentTM1200液相色譜儀(美國)、IKATM勻漿機 (德國)、Sigma 3K30離心機(德國)、華美QHZ-98B振蕩培養(yǎng)箱(中國太倉)、梅特勒S20K pH計(瑞士)、VCX130 Sonics超聲波細胞破碎儀(美國)、N-EVAP氮吹濃縮器(美國)、EscoTM超凈工作臺(新加坡)。

1.2 方法

1.2.1 甲基毒死蜱降解菌的分離與鑒定 用于降解菌分離的土壤樣品取自四川遂寧農(nóng)田(使用甲基毒死蜱3 a以上)。取土樣2.5 g接種于 100 mL甲基毒死蜱降解菌分離培養(yǎng)基(甲基毒死蜱質(zhì)量濃度為50 mg/L)中，30 ℃振蕩培養(yǎng)(120 r/min)，每隔1 d測定甲基毒死蜱殘留質(zhì)量濃度(測定方法參照文獻[2])。取3 d降解率[降解率=(1-殘余量/添加量)×100%]大于40%的培養(yǎng)液5 mL，轉(zhuǎn)接到含相同質(zhì)量濃度甲基毒死蜱的降解菌富集培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉湯)中，連續(xù)轉(zhuǎn)接5 次以上；再次驗證降解效果后，在甲基毒死蜱降解菌分離培養(yǎng)基平板上涂布富集培養(yǎng)液，30 ℃倒置培養(yǎng)，挑取生長旺盛的優(yōu)勢菌落在培養(yǎng)基平板上劃線，分離純化得到甲基毒死蜱降解菌的純培養(yǎng)。微生物生化分析參考《Bergey’s manual of determinative bacteriology》[8]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]；菌種鑒定采用BiologTM微生物鑒定系統(tǒng)和16S rDNA序列分析法。

1.2.2 降解菌ZL-7與ZHLXL-2接種體的準備 分離純化的甲基毒死蜱降解菌經(jīng)肉湯培養(yǎng)后，5 500 r/min離心8 min，收集菌體，用無菌水洗滌3遍并重懸至OD600=1.8，該懸浮液作為后續(xù)甲基毒死蜱及TCP降解試驗的接種體。

1.2.3 菌株ZL-7與ZHLXL-2降解甲基毒死蜱過程中TCP的測定 在甲基毒死蜱降解菌分離培養(yǎng)基(甲基毒死蜱質(zhì)量濃度為50 mg/L)中接入2%的ZHLXL-2 或ZL-7接種體，然后將其置入搖床中(120 r/min, 30 ℃)培養(yǎng)，每隔24 h取樣測試TCP質(zhì)量濃度，同時測定殘留甲基毒死蜱的質(zhì)量濃度。TCP的測定參照文獻方法[10]。

1.2.4 菌株ZL-7與ZHLXL-2對TCP的降解能力測定 在甲基毒死蜱降解菌分離培養(yǎng)基(其中的甲基毒死蜱用TCP代替，質(zhì)量濃度為50 mg/L)中接入2%的接種體，然后將其置入搖床中(120 r/min, 30 ℃)培養(yǎng)4 d以上，每隔12 h取樣測試TCP質(zhì)量濃度，用以評價不同菌株對TCP的降解能力。

1.2.5 菌株ZL-7與ZHLXL-2對另外6種有機磷農(nóng)藥的降解能力測定 取滅菌土壤(土壤取自四川省遂寧市拋荒耕地，未檢出甲基毒死蜱及另外6種供試有機磷農(nóng)藥， 121 ℃滅菌30 min)分成6組。第1組：在土壤中添加經(jīng)無菌處理的甲胺磷農(nóng)藥，使其含量為100 mg/kg，然后再接種菌株ZHLXL-2，接種量為每100 g土壤中添加10 mL接種體，并以未接種菌株ZHLXL-2的土樣作為對照，最后將其置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)期間土壤的持水量調(diào)節(jié)至40%，每間隔48 h取樣測定農(nóng)藥殘留的質(zhì)量濃度，連續(xù)測試14 d，以評價菌株ZHLXL-2對土壤中有機磷農(nóng)藥的降解效應。第2組至第6組中除試驗農(nóng)藥依次改變?yōu)榧装枇?、久效磷、甲基對硫磷、殺螟硫磷和水胺硫磷以外，其他均與第1組相同。按同樣方法測試菌株ZL-7對6種有機磷農(nóng)藥的降解能力。土壤中有機磷農(nóng)藥殘留的分析方法參照國標GB/T 14552—2003[11]。

1.2.6 菌株ZL-7與ZHLXL-2的磷酸酯酶活性測定 磷酸酯酶活性的測定參照Subhas等[12]和Bhadbhade等[13]的方法。取菌株ZHLXL-2培養(yǎng)液100 mL，加入0.75 mL蛋白酶抑制劑混合物，在0 ℃下10 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀并保留上清液(Ⅰ)；用50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液洗滌菌體2次，洗滌液合并到上清液(Ⅰ)，凍存以供測試胞外酶活性(需先冷凍干燥至近干，并定容至20 mL)。經(jīng)洗滌的菌體用Tris-HCl緩沖液定容到20 mL，并加入適量蛋白酶抑制劑，冰浴中超聲破碎細胞(功率200 W，破碎5 s，間隔4 s，共4 min)，然后10 000 r/min離心10 min，上清(Ⅱ)即為粗酶液(測定酶活時需定容至20 mL)。 將粗酶液18 000 r/min離心30 min，沉淀用20 mL Tris-HCl緩沖液重懸，用于測試膜結(jié)合酶活性，上清(Ⅲ)用Tris-HCl緩沖液重新定容至20 mL，用于測試胞內(nèi)酶活性。菌株ZL-7按同樣方法測試。

磷酸酯酶酶促反應體系(3 mL)為：2.8 mL甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(0.05 mol/L，pH值9.0)、0.19 mL酶液、10 μL對硝基苯磷酸二鈉鹽(4-NPP，40 mmol/L);37 ℃水浴1 h，取反應液0.5 mL于試管中，加入3.5 mL甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH值10.0)混勻，紫外分光光度計測定OD405，通過比色法測定溶液中對硝基苯酚的生成量。各組試驗均設置3個重復，對照組以等量蒸餾水替代酶液。酶活性單位(U)定義：在本試驗條件下，1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化對硝基苯磷酸二鈉生成1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 2株甲基毒死蜱降解菌株的鑒定及特性

從土壤中分離到2株能高效降解甲基毒死蜱的菌株，其降解50 mg/L甲基毒死蜱的5 d降解率分別為90.6%和99.4%，兩菌株分別被命名為ZL-7與ZHLXL-2。菌株ZL-7：直形或稍有彎曲的桿狀菌，大小為(0.6～0.8)μm×(1.8～3.0)μm，G+，能運動，中生芽孢或偏端生芽孢，兼性厭氧，在營養(yǎng)肉湯平板上形成不透明的粗糙型菌落。淀粉水解、接觸酶、明膠試驗及V.P.試驗均呈陽性，但吲哚試驗為陰性； 經(jīng)BiologTM微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。菌株ZHLXL-2：直形或微彎曲的桿菌，大小(0.6～0.7)μm×(2.0～2.5)μm，G-，能運動，無芽孢，好氧生活，在營養(yǎng)肉湯平板上形成濕潤的圓形菌落；接觸酶、氧化酶、明膠液化及V.P.試驗均呈陽性，而淀粉水解試驗和反硝化試驗呈陰性；經(jīng)BiologTM微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)。菌株ZHLXL-2與ZL-7通過PCR擴增獲得的16S rDNA序列長度分別為1 507 bp和1 506 bp，GenBank序列登記號分別為KY030783和KY030784，經(jīng)Blastn序列比對分析，結(jié)果顯示，菌株ZL-7與地衣芽孢桿菌的核苷酸序列同源性達99%以上，菌株ZHLXL-2與熒光假單胞菌的序列同源性大于99%。

2.2 菌株ZL-7與ZHLXL-2對甲基毒死蜱和TCP的降解效率

圖1表明，菌株ZL-7與ZHLXL-2都能有效地降解甲基毒死蜱，其3 d降解率分別達到了70.6%和91.6%。TCP是甲基毒死蜱降解過程中最重要的中間產(chǎn)物之一，主要由磷酸酯酶水解甲基毒死蜱產(chǎn)生。但是圖1所示的結(jié)果表明，僅在菌株ZL-7降解甲基毒死蜱的過程中檢測到了TCP，而在菌株ZHLXL-2降解甲基毒死蜱的過程中并未檢出TCP(對照組也未檢出)。在菌株ZL-7降解甲基毒死蜱的過程中，隨著甲基毒死蜱的逐漸降解，培養(yǎng)基中TCP的質(zhì)量濃度逐步升高，但3 d后TCP質(zhì)量濃度即不再顯著增長。若菌株ZL-7不能降解TCP，其TCP含量應隨甲基毒死蜱的降解持續(xù)增加，沒有持續(xù)增加可能是由于除了磷酸酯酶途徑外，還有其他方式參與到甲基毒死蜱的降解，且不產(chǎn)生TCP，例如，僅對甲基毒死蜱的O-甲基進行水解，或者是由于TCP與微生物代謝物發(fā)生化學反應生成其衍生物所致。

對照組及ZHLXL-2降解甲基毒死蜱過程中均未檢出TCP

圖2數(shù)據(jù)表明，菌株ZL-7不具備降解TCP的能力(與對照組無顯著差異，P>0.05)，菌株ZHLXL-2則表現(xiàn)出較強的TCP降解能力。菌株ZHLXL-2降解TCP的48 h降解率可達91.0%，降解速率顯著高于Abraham等[7]分離的蒼白桿菌JAS2和Anwar等[10]報道的短小芽孢桿菌C2A1。

圖2 不同菌株對TCP的降解曲線

菌株ZHLXL-2降解甲基毒死蜱的過程中未檢出TCP，可能是由于產(chǎn)生的TCP被迅速降解。對圖1所示的菌株ZHLXL-2降解甲基毒死蜱的曲線及其相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)其在本試驗條件下的降解規(guī)律符合一級動力學模型，按一級動力學模型C=C0·e-kt(C0為初始濃度，C為t天的殘余濃度，t為降解時間，k為降解速率常數(shù))模擬的方程為C=100e-1.294 7t，R2=0.989 1，k為1.294 7，降解半衰期為0.91 d。甲基毒死蜱的降解量在一定意義上也是其可產(chǎn)生TCP的最大量，若菌株ZHLXL-2降解TCP的速率高于產(chǎn)生TCP的速率，則TCP作為甲基毒死蜱降解的中間物就不會積累。后經(jīng)證實，菌株ZHLXL-2能快速降解TCP(圖2)，且能以 TCP作為唯一碳源進行生長，按一級動力學模型模擬的TCP降解方程為C=100e-1.628 3t，R2=0.928 5，k為1.628 3，降解半衰期為0.82 d。通過比較上述2組降解參數(shù)可知，TCP的降解速率常數(shù)更高、半衰期也更短。因此，在菌株ZHLXL-2降解甲基毒死蜱的過程中，TCP作為中間物不會積累，因而也沒有被檢出。

2.3 菌株ZL-7與ZHLXL-2降解6種有機磷農(nóng)藥的效果

有機磷農(nóng)藥一般具有磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酰胺酯類的共有結(jié)構(gòu)，能降解這類共有結(jié)構(gòu)的微生物通常能降解多種有機磷農(nóng)藥，為驗證所篩選的菌株是否具有這種廣譜降解有機磷農(nóng)藥的能力，測試了菌株ZHLXL-2與菌株ZL-7對其他6種有機磷農(nóng)藥的降解性能，所選取的6種農(nóng)藥均是曾在我國大量使用過的或目前仍在應用的有機磷農(nóng)藥(甲胺磷、甲拌磷、久效磷、甲基對硫磷、殺螟硫磷和水胺硫磷)。

從圖3可知，菌株ZL-7對6種供試農(nóng)藥均有較好的降解效果，其10 d降解率都在92%以上(92.1%～99.8%)，而14 d降解率則均高于99%。這些測試結(jié)果表明，菌株ZL-7對有機磷農(nóng)藥的降解作用具有廣譜性，可能是由于菌株ZL-7產(chǎn)生的相關(guān)酶類作用于有機磷農(nóng)藥的共有結(jié)構(gòu)所致，而降解速度的快慢則可能與農(nóng)藥自身的化學穩(wěn)定性、降解酶接觸農(nóng)藥靶標位點的難易程度、農(nóng)藥及降解產(chǎn)物對酶促反應的反饋作用等多種因素有關(guān)[14-15]。

圖3 菌株ZL-7對土壤中6種不同有機磷農(nóng)藥的降解曲線

菌株ZHLXL-2降解6種有機磷農(nóng)藥的性能測試結(jié)果見圖4。盡管前述試驗結(jié)果已經(jīng)表明菌株ZHLXL-2降解甲基毒死蜱的速率顯著高于菌株ZL-7，但比較兩菌株對6種其他有機磷農(nóng)藥的降解曲線及數(shù)據(jù)可知，菌株ZHLXL-2降解其他有機磷農(nóng)藥的速率低于菌株ZL-7(菌株ZHLXL-2降解6種供試農(nóng)藥的10 d降解率為89.2%～93.4%)，因此，初步推斷菌株ZL-7具有更強的有機磷農(nóng)藥廣譜降解能力。菌株ZHLXL-2能高效降解中間物TCP，可能是其較菌株ZL-7能更好地降解甲基毒死蜱的重要原因。

圖4 菌株ZHLXL-2對土壤中6種不同有機磷農(nóng)藥的降解曲線

2.4 菌株ZL-7與ZHLXL-2的磷酸酯酶活性

對有機磷農(nóng)藥結(jié)構(gòu)中的磷酸酯鍵具有分解作用的酶類較多，磷酸酯酶即是其中最重要的一類。一般而言，能產(chǎn)生磷酸酯酶活性的微生物往往也會具有廣譜降解有機磷農(nóng)藥的能力，而酶活性的大小則與降解能力呈正相關(guān)性[16]。為了弄清菌株ZL-7與ZHLXL-2降解有機磷農(nóng)藥的能力與其磷酸酯酶活性之間的關(guān)系，測試并比較了2種菌株的磷酸酯酶活性。由于磷酸酯酶能夠水解4-NPP，反應后產(chǎn)生黃色的末端產(chǎn)物，并可在波長405 nm處讀取，因此以此為基礎測定磷酸酯酶的活性。

在試驗中發(fā)現(xiàn)，同時含有菌株ZL-7和4-NPP的試驗組能觀察到溶液呈黃色，對菌株ZHLXL-2的試驗結(jié)果也與之類似，因此推斷，這是由于菌株ZL-7與ZHLXL-2在生長過程中具有磷酸酯酶活性，能夠水解4-NPP產(chǎn)生黃色產(chǎn)物所致。從圖5可知，2種菌株在生長過程中均具有較強的磷酸酯酶活性，其胞外酶、胞內(nèi)酶及膜結(jié)合酶中都能檢出磷酸酯酶活性(主要為胞內(nèi)酶)，這可能是2種菌株都能有效降解多種有機磷農(nóng)藥的原因。另外，菌株ZL-7的磷酸酯酶活性顯著高于菌株ZHLXL-2(P<0.05)，也印證了菌株ZL-7降解有機磷農(nóng)藥的能力優(yōu)于菌株ZHLXL-2，證實了這2種菌株的磷酸酯酶活性與其降解有機磷農(nóng)藥的能力呈正相關(guān)性，而菌株ZL-7降解甲基毒死蜱的能力不及菌株ZHLXL-2則是由于其他原因所致。根據(jù)圖5，2種菌株粗酶液的磷酸酯酶活性分別為59.4 U/mL和40.8 U/mL，活性大小與Bhadbhade等[13]報道的數(shù)據(jù)相當，這也暗示了這2種菌株都具有開發(fā)相應酶制劑的基礎，開發(fā)的磷酸酯酶相關(guān)制劑可望用于有機磷農(nóng)藥污染的降解等方面。

圖5 菌株ZL-7與ZHLXL-2的磷酸酯酶活性

3 結(jié)論與討論

在本研究中，成功分離到2株甲基毒死蜱高效降解菌株，分別為地衣芽孢桿菌ZL-7與熒光假單胞菌ZHLXL-2，其降解甲基毒死蜱的5 d降解率分別為90.6%和99.4%。兩菌株都有較高的磷酸酯酶活性和降解多種有機磷農(nóng)藥的能力，其酶活性與降解速率之間呈正相關(guān)性；菌株ZL-7較菌株ZHLXL-2有更高的磷酸酯酶活性，與之相應的是其對多種有機磷農(nóng)藥的降解速率更快。但是，菌株ZL-7降解甲基毒死蜱的能力不及菌株ZHLXL-2，這一現(xiàn)象被初步歸因于菌株ZL-7不能降解甲基毒死蜱降解過程中產(chǎn)生的中間物TCP，TCP的積累將會導致反饋抑制效應；而菌株ZHLXL-2則能降解TCP，從而將甲基毒死蜱完全降解，最終導致菌株ZHLXL-2較菌株ZL-7降解甲基毒死蜱更為有效、快速。

有機磷農(nóng)藥降解菌株在生長過程中可能會產(chǎn)生多種降解有機磷農(nóng)藥的酶類，其中最重要的一類是磷酸酯酶，它能夠水解有機磷農(nóng)藥中的磷酸酯鍵，因而能水解多種有機磷農(nóng)藥。微生物若能產(chǎn)生這類能夠作用于有機磷農(nóng)藥共有結(jié)構(gòu)的酶類，也就具備了降解有機磷農(nóng)藥的廣譜性，而降解速度則與農(nóng)藥自身的結(jié)構(gòu)、降解產(chǎn)物對微生物及酶促反應的反饋作用等多種因素有關(guān)。另外，微生物也能產(chǎn)生一些針對個別農(nóng)藥的特異性基團或化學鍵的酶類，這些酶只能對個別農(nóng)藥起到分解作用；不同的微生物產(chǎn)生的酶類差異很大，這決定了它們不同的降解特性。在本研究中，2株甲基毒死蜱降解菌都能分解供試的6種有機磷農(nóng)藥，故推測這2種菌株都能產(chǎn)生降解有機磷農(nóng)藥的廣譜性酶類，其產(chǎn)生的酶類可能是磷酸酯酶，也可能包括其他有相似功能的酶類。菌株ZL-7降解有機磷農(nóng)藥的能力整體上優(yōu)于菌株ZHLXL-2，這是由于菌株ZL-7產(chǎn)生的有機磷農(nóng)藥降解酶產(chǎn)量更大或者活性更高；而菌株ZL-7降解甲基毒死蜱的能力不及菌株ZHLXL-2，這一現(xiàn)象可能是由于菌株ZHLXL-2產(chǎn)生了針對甲基毒死蜱的特異性酶類，這些特異性酶類或者能直接導致甲基毒死蜱的降解，或者對甲基毒死蜱降解的中間產(chǎn)物有分解作用，從而有利于降解反應的快速進行。在本研究中，菌株ZHLXL-2能高效降解TCP被認為是其能更快降解甲基毒死蜱的重要原因之一。

通常在有機污染物治理過程中僅關(guān)注了目標污染物的數(shù)量指標，而由其導致的有害的次級效應常被忽視。從本研究的結(jié)果可知，某些甲基毒死蜱降解菌僅能將甲基毒死蜱分解為TCP，而不能將TCP降解，這就導致只是在名義上消除了甲基毒死蜱殘留的危害。因為TCP在自然環(huán)境中的穩(wěn)定性很高，導致TCP較甲基毒死蜱更難降解，并且TCP也具有較甲基毒死蜱更大的毒性，且水溶性比甲基毒死蜱也更高，導致其更容易污染水體和土壤，從而放大危害。按照已有的資料，綠草定、毒死蜱等農(nóng)藥的降解過程中也有類似現(xiàn)象[10,17]。因此，在利用微生物降解有機污染物的應用中，需要充分掌握不同微生物降解污染物的特點及降解機制，特別是降解中間物的可降解性、毒性及存在狀態(tài)等方面。

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Biodegradation of Chlorpyrifos-methyl and Its Hydrolysis Product 3,5,6-Trichloro-2-pyridinol by Different Degrading Bacteria

LI Xiaolou

(Architecture and Environmental Engineering Department,Sichuan Vocational and Technological College,Suining 629000,China)

To understand the degradation characteristics and mechanism of chlorpyrifos-methyl by microorganisms,First,different chlorpyrifos-methyl degrading bacteria were isolated from soil,and then,their degradation characteristics were tested and analyzed,including degradation efficiency on chlorpyrifos-methyl,variation of intermediate(3,5,6-trichloro-2-pyridinol,TCP) concentration in the degradation process,phosphatase activity, degradation ability on TCP and 6 organophosphorus pesticides.Two chlorpyrifos-methyl degrading bacteria were isolated,which were identified asBacilluslicheniformisZL-7 andPseudomonasfluorescensZHLXL-2,and their degradation rates on chlorpyrifos-methyl were 90.6% and 99.4% respectively in five days.TCP was found in the degradation process of chlorpyrifos-methyl by the strain ZL-7, but not by the strain ZHLXL-2.The strain ZHLXL-2 could degrade TCP, and the degradation rate reached 91.0% at 48 h,while the strain ZL-7 could not degrade TCP.Both strains could degrade 6 kinds of organophosphorus pesticides.The 10 d degradation rate of 6 organophosphorus pesticides by the strain ZL-7 was 92.1%—99.8%,higher than the degradation rate by the strain ZHLXL-2(89.2%—93.4%).In addition,the phosphatase activity of strain ZL-7 was significantly higher than that of strain ZHLXL-2.These results showed that the phosphatase activity of the two strains was positively correlated with their ability to degrade organophosphorus pesticides.The strain ZHLXL-2 could degrade chlorpyrifos-methyl more quickly because of its ability to degrade TCP effectively.

Bacilluslicheniformis;Pseudomonasfluorescens; organophosphorus pesticide; chlorpyrifos-methyl; 3,5,6-trichloro-2-pyridinol; degradation

2016-11-22

四川省教育廳重點項目(13ZA0036)

李曉樓(1974-)，男，四川遂寧人，副教授，碩士，主要從事微生物應用研究。E-mail：3141024328@qq.com

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1004-3268(2017)05-0084-06